槲皮苷對過氧化氫誘導PC12 細胞損傷的保護作用

江 芮，呂 浩，李 申，王麗莉

隨著老齡化的發(fā)展，阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)已成為繼心腦血管、腫瘤之后又一危害老年人健康的疾病，表現(xiàn)為退行性的神經(jīng)系統(tǒng)病變［1］。在AD 眾多的發(fā)病機制假說中，氧化應激假說越來越引起關注［2］。PC12 細胞株源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，它在形態(tài)，結構和功能上與神經(jīng)細胞有許多相似之處，被廣泛用于神經(jīng)藥理學方面的研究［3］，H2O2誘導PC12 細胞損傷是經(jīng)典的細胞氧化損傷模型，由活性氧(ROS)介導的氧化應激損傷在神經(jīng)退行性疾病中起了至關重要的作用［4］，H2O2是體內代謝產(chǎn)生的一種ROS，可以透過細胞膜，能夠與多種生物靶標分子反應。

近年來，從天然產(chǎn)物中尋找具有清除自由基活性的物質用于保護細胞免受氧化損傷備受關注。黃酮類化合物可以對神經(jīng)元發(fā)揮類似神經(jīng)營養(yǎng)因子的保護作用［5］。槲皮苷(Quercitrin)是一種廣泛存在于中草藥和蔬果中的天然黃酮類化合物，研究證明其具有抗氧化、抗癌、抗病毒等作用［6］。本研究利用H2O2誘導類神經(jīng)細胞系PC12 凋亡建立模型，檢測槲皮苷對PC12 細胞的保護作用并初步分析其作用機制，為其在神經(jīng)退行性疾病治療上提供可行性的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 槲皮苷購于阿拉丁試劑有限公司，純度≥98%，DMSO 購于上海生物工程有限公司，DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco 公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司，MTT、DAPI購于Sigma 公司，H2O2(30%，AR 級)購于國藥集團化學試劑有限公司。乳酸脫氫酶試劑盒購于南京建成生物工程研究所，Cytc 和caspase-3 一抗、HRP 標記二抗購于武漢三鷹生物技術有限公司，大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12 細胞)購于中國科學院上海細胞所。

1.2 儀器 倒置顯微鏡(OLYMPUS);多功能酶標儀(Thermo，美國);美國UVP 凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國);熒光顯微鏡TE2000-U(Nikon，日本)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 用含10% 小牛血清的DMEM 細胞培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)PC12 細胞，每隔48 h 換液。用0.25%胰蛋白酶進行消化。

1.3.2 H2O2誘導PC12 細胞損傷模型的建立PC12 細胞消化、計數(shù)，以8×104個/ml (100 μl)細胞接種于96 孔板中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基將H2O2分別配成0、100、200、400、800、1600 μmol/L 各濃度，分別加入96 孔板中，每孔100 μl，每組6 個復孔，分別作用2、4、6 h 后，棄掉上清，用PBS 洗滌3 次，每次200 μl。分別加入MTT(5 mg/ml)工作液100 μl，繼續(xù)孵育4 h 后加入100 μl DMSO，微孔振蕩器上震蕩10 min，用酶標儀檢測570 nm 下的吸光度值。

1.3.3 槲皮苷給藥劑量篩選 槲皮苷用DMSO 溶解，配成終濃度為1600 mmol/L 的母液。為了檢測槲皮苷對PC12 細胞的影響，收集對數(shù)生長期的PC12 細胞，將濃度為8 ×104個/ml (100 μl)細胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，給予不同終濃度的槲皮苷(0、50、100、200、400、800、1600 μmol/L)分別預處理12 h 后，MTT 法檢測細胞的生長存活率。

1.3.4 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞活力的影響 為了檢測槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞保護作用，實驗方法分為5 組，空白對照組(Control):每孔加入100 μl 無血清培養(yǎng)液;模型組(Model):加入100 μl、400 μmol/L H2O2作用4 h;槲皮苷(Quercitrin)保護組:先用不同終濃度的槲皮苷100、200、400 μmol/L 分別預處理12 h 后，吸出藥物，然后加入100 μl、400 μmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，MTT法檢測細胞的生長存活率。

1.3.5 LDH 釋放量的檢測 將PC12 細胞以2×105cells/well (2 ml)的密度接種于6 孔板，孵育培養(yǎng)24 h 后，按照參考文獻［7］的方法，背景空白對照孔為無細胞的培養(yǎng)液，按照1.3.4 分為5 組處理細胞后，取各孔上清120 μl 于新的96 孔板中，再加入60 μl LDH 檢測工作液，避光室溫孵育30 min后，在490 nm 處測量吸光度值。

1.3.6 DAPI 熒光核染色分析 將PC12 細胞以2×105cells/well (2 ml)的密度接種于6 孔板，孵育培養(yǎng)24 h 后，按照1.3.4 分為5 組處理細胞后，用PBS 清洗3 遍后，加入1 μg/ml 的DAPI 溶液，37 ℃孵育5 min，PBS 清洗后用熒光顯微鏡進行拍照觀察。

1.3.7 Western blotting 法檢測蛋白表達水平按照1.3.4 分為5 組處理細胞后，0.25%胰酶消化，離心收集細胞500 g 離心10 min，以PBS 洗兩次，細胞總蛋白提取用PIPA 細胞裂解液置冰浴裂解，14 000 × g 離心5 min，收集上清。經(jīng)BCA 法進行蛋白定量后，取等量樣品以12% SDS-PAGE 進行電泳。胞漿蛋白提取用胞漿蛋白提取試劑盒進行，細胞加入適量緩沖液A，渦旋震蕩15 s，放置上10 min，加入總體積的1/20 體積的緩沖液B，快速震蕩混勻，放置冰上1 min 后，16，000 g，4 ℃，離心30 s，收集上清至新的離心管中，即為胞漿蛋白。電泳后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，用Cytc、casepase-3 抗體(濃度1∶ 100)孵育過夜，再以辣根過氧化酶標記的二抗封閉液孵育1 h，用ECL 顯影。以目標蛋白與內參的積分灰度值比值表示蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 H2O2誘導PC12 細胞損傷模型的建立MTT 實驗結果顯示，細胞抑制率隨H2O2的濃度的升高和作用時間的延長而增加，當400 μmol/L H2O2作用4 h 時，其細胞抑制率達到50.8% (P ＜0.01)左右，作為最佳造模條件。

2.2 槲皮苷單獨給藥對PC12 細胞的影響藥物劑量在400 μmol/L 以下的藥物處理組與對照組相比差異沒有顯著性(P ＞0.05)，表明對細胞沒有損傷作用;而當藥物劑量大于800 μmol/L 時，藥物處理組與對照組相比差異具有顯著性(P ＜0.01)，表明此時的藥物濃度對細胞有損傷作用。因此，選擇100、200、400 μmol/L 作為合適的給藥濃度。

2.3 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞活力的影響 槲皮苷預孵育12 h 后，加入400 μmol/L H2O2作用4 h，細胞活力檢測結果顯示，與對照組相比，模型組細胞活力明顯降低(P ＜0.01);與模型組相比，槲皮苷保護組細胞活力明顯提高(P ＜0.01)，且呈劑量依賴性(見圖1)。

2.4 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞LDH 釋放量的影響 實驗以LDH 釋放量作為PC12 細胞損傷程度檢測指標，與正常組比較，H2O2誘導后PC12的LDH 釋放量明顯升高(P ＜0.01)，而預防應用槲皮苷能夠顯著降低LDH 釋放量(P ＜0.01)(見圖2)。

2.5 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞凋亡形態(tài)學的影響 空白對照組細胞的細胞核呈均勻的淡藍色，模型組細胞呈現(xiàn)強烈的藍色熒光，提示細胞的細胞核固縮或碎裂。而400 μmol/L槲皮苷預處理組細胞藍色熒光明顯弱于模型組。

2.6 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞中相關凋亡蛋白表達的影響 Western blot 結果顯示，與對照組相比，模型組細胞胞漿中Cytc 和細胞內caspase-3蛋白表達水平明顯升高(P ＜0.01);與模型組相比，槲皮苷預孵育組(100、200、400 μmol/L)細胞胞漿中Cytc 和細胞內caspase-3 蛋白表達水平均有不同程度的降低，且具有劑量依賴性(見圖3)。

圖1 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞保護作用

圖2 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞LDH 釋放量的影響

圖3 槲皮苷對H2O2損傷PC12 細胞中相關凋亡蛋白表達的影響

3 討論

本研究為了探討槲皮苷對H2O2誘導的PC12 細胞損傷的保護作用和機制，首先采用MTT 法對H2O2誘導的PC12 細胞損傷濃度和時間進行檢測。實驗結果表明400 μmol/L H2O2作用細胞4 h 后，細胞活力抑制率為50.8%，該濃度下細胞有一定比例凋亡，但又不至于大量死亡，所以本研究選用400 μmol/L H2O2造模。MTT 法確定了3 個無毒劑量:100、200、400 μmol/L后對槲皮苷進行保護作用和機制的研究。

LDH 是細胞內標志酶，受損的細胞膜通透性發(fā)生改變，LDH 漏出量明顯增大，其累計釋放量與細胞受損的程度呈正相關［8］，細胞損傷時LDH 會釋放入培養(yǎng)液中，故其上清液中LDH 的濃度可反映出細胞的損傷程度，與正常對照組相比，H2O2能造成培養(yǎng)液中LDH 顯著提高，100～400 μmol/L 槲皮苷能顯著降低H2O2誘導的LDH 的釋放。

DAPI 熒光核染色結果表明槲皮苷能夠減輕由H2O2誘導的PC12 細胞凋亡。細胞內線粒體的雙層膜受到破壞后會形成穿膜孔道，通透性增加，促進Cytc 的釋放，胞漿中Cytc 含量也是指示細胞凋亡的重要指標［9］。實驗發(fā)現(xiàn)，H2O2可導致PC12 細胞細胞胞漿中Cytc 和細胞內caspase-3 蛋白表達升高。提示H2O2可通過線粒體細胞色素C 介導的凋亡通路，啟動caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。caspase-3 的活化是凋亡進入不可逆階段的標志，槲皮苷預孵育后可下調胞漿中Cytc 和細胞內caspase-3 蛋白表達，進而產(chǎn)生抗凋亡的作用。

綜上所述，槲皮苷對H2O2誘導的PC12 細胞損傷具有一定的保護作用，可以提高H2O2損傷人PC12 細胞的存活率，降低LDH 釋放量，下調胞漿中Cytc 和細胞內caspase-3 蛋白表達。提示槲皮苷可保護和修復過氧化H2O2誘導的PC12 細胞的損傷，其機制可能與抑制細胞凋亡線粒體途徑中凋亡相關蛋白Cytc 和caspase-3 的表達有關。

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