CBF-β 輔助SIVagm Vif 蛋白誘導限制因子APOBEC3G 的降解

朱丹彤，艾有為，林躍智，馬建章，王曉鈞*，侯志軍*，張明海*

(1.東北林業(yè)大學 野生動物資源學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001)

APOBEC3G(A3G)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的天然免疫慢病毒限制因子，通過誘導病毒cDNA 超突變，降低病毒感染性，發(fā)揮重要的抗病毒作用[1]。Vif(Virion infectivity factor)是除了馬傳染性貧血病毒(EIAV)以外，其他慢病毒均編碼的一種病毒輔助蛋白，分子量為23 ku，是慢病毒在某些細胞中復制所必需的輔助蛋白。Vif 通過招募基于Cul5、Elongin B、Elongin C 和Rb 組成的Cullin5-ring ligase(CRL5)E3 泛素連接酶復合物與A3G 結(jié)合，誘導多種APOBEC3 蛋白的泛素化及降解，解除APOBEC3介導的抗病毒作用[2-3]。HIV-1 的研究發(fā)現(xiàn)，Vif 對APOBEC3G 降解作用還需要另外一種因子CBF-β 的參與。CBF-β 是RUNX 家族轉(zhuǎn)錄輔助因子，可與RUNX 家族的蛋白形成異二聚體，該復合物對于細胞分化具有重要功能。在HIV-1 感染過程中，CBF-β 的缺失會導致Vif 失去對A3G/F 降解作用[4-5]。CBF-β 廣泛表達于各種細胞，其存在可以提高Vif的穩(wěn)定性和可溶性，抑制Vif 的寡聚化。未寡聚化的Vif 更利于E3 泛素連接酶復合物的形成。同時，CBF-β 的表達可以提高Vif 與Cul5 的結(jié)合，從而有效的招募E3 泛素連接酶復合體并與之穩(wěn)定結(jié)合，有利于Vif 對A3G 的降解作用。其中aa15-aa126 為CBF-β 發(fā)揮該功能的關鍵區(qū)域[6-7]。由此，CBF-β 在HIV-1 編碼的VIf 對A3G 的降解作用是至關重要的。除HIV-1 之外，最近研究發(fā)現(xiàn)SIVmac(恒河猴)編碼的Vif 蛋白對A3G 的降解作用也同樣需要CBF-β 的輔助作用[8]。

在HIV-1 及SIVmac 的相關研究顯示CBF-β 的重要作用[8]。但這一結(jié)果是否適用其他來源的慢病毒還不清楚。本研究通過CBF-β 對不同屬的靈長類慢病毒來源的Vif 生化特性的改變，來探索CBF-β促進靈長類慢病毒Vif 的原因和機制，證明SIVagm編碼的Vif 對A3G 的降解同樣需要CBF-β 的輔助作用，并且其第38 位色氨酸對于該蛋白的活性具有關鍵作用。

1 材料和方法

1.1 重組質(zhì)粒及細胞 pcDNA-HIV-1-Vif-HA、pcDNASIVagm-Vif、pcDNA-HIV-1-Vif W38S-HA、pcDNASIV-Vif W38S-HA、pVR-CBF-β-myc-flag、293T 細胞及293T siRNACBF-β細胞系均由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病與慢病毒創(chuàng)新團隊提供；人A3G(pcDNA-A3G-V5)以及非洲綠猴A3G(pcDNAA3Gagm-V5)表達重組質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所基礎免疫創(chuàng)新團隊鄭永輝研究員提供。

1.2 主要試劑 Plasmid Mini Kit I 購自OMEGA 公司；HiPure Plasmid Maxiprep Kit 購自Invitrogen 公司；鼠抗HA、鼠抗beta-actin、Flag 抗體、V5 抗體和放線菌酮(CHX)均購自Sigma 公司；DyLightTM羊抗鼠IgG 購自ROCK-LAND 公司。

1.3 CBF-β 對SIVagm Vif 功能的影響 按照磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染法，設立對照組和實驗組2 個轉(zhuǎn)染組，對照組將3 μg A3G、1 μg A3G 和1 μg pcDNAHIV-1-Vif-HA、1 μg A3G 和1 μg pcDNA-HIV-1-Vif-HA 及1 μg CBF-β 分別轉(zhuǎn)染293T siRNACBF-β；實 驗組將3 μg A3Gagm、1 μg A3Gagm 和1 μg pcDNASIV-Vif-HA、1 μg A3Gagm 和1 μg pcDNA-SIV-Vif-HA 及1 μg CBF-β 分別轉(zhuǎn)染293T siRNACBF-β，同時用空載體pcDNA3.1 補平轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭坎町?。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞并裂解，進行SDS-PAGE，將轉(zhuǎn)印蛋白的PVDF 膜用5 %的脫脂乳封閉，分別以HA 抗體(1:10 000)、V5 抗體(1∶5 000)、Flag 抗體(1∶5 000)、actin 抗體(1∶10 000)為一抗，以DyLightTM羊抗鼠IgG 為二抗(1∶10 000)，通過紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(YQ09-0052)檢測各個實驗組的蛋白表達情況。

1.4 CHX 對Vif 蛋白穩(wěn)定性檢測 通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，設立兩個實驗組，對照組將3 μg pcDNA-HIV-1-Vif-HA 與CBF-β 質(zhì)?；蛘呦鄳康膒cDNA3.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞；實驗組將3 μg pcDNA-SIVVif-HA 與CBF-β 質(zhì)?；蛘呦鄳康膒cDNA3.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進293T 細胞。轉(zhuǎn)染24 h 之后換成含有終濃度100 μg/mL CHX(放線菌酮)的完全培養(yǎng)液，分別在加入CHX 后的0 h、1 h、2 h、6 h 和12 h 收 獲細胞，并將細胞裂解。進行SDS-PAGE，將轉(zhuǎn)印蛋白的PVDF 膜用5 %的脫脂乳封閉，分別以HA 抗體(1∶10 000)、Flag 抗體(1∶5 000)、actin 抗體(1∶10 000)及DyLightTM羊抗鼠IgG 為二抗(1:10 000)進行孵育，對蛋白表達進行檢測。

1.5 SIVagm Vif 功能試驗 通過點突變技術把HIV-1 Vif 和SIVagm Vif 的38 位色氨酸(W)突變成絲氨酸(S)并且以Bam HⅠ和NotⅠ為酶切位點加入HA 標簽，構建重組質(zhì)粒pcDNA-HIV-1 Vif W38SHA 和pcDNA-SIV Vif W38S-HA 進行相應的實驗。通過磷酸鈣沉淀法，分別將3 μg pcDNA-A3G 與pcDNA-HIV-1 Vif W38S-HA、3 μg pcDNA-A3Gagm與pcDNA-SIVagm-Vif W38S-HA 轉(zhuǎn)染293T 細胞。轉(zhuǎn)染48 h 后收集細胞并裂解，進行SDS-PAGE，將轉(zhuǎn)印蛋白的PVDF 膜用5 %的脫脂乳封閉，分別以HA抗體(1∶10 000)、V5 抗體(1∶5 000)、actin 抗體(1∶10 000)及DyLightTM羊抗鼠IgG 為二抗(1∶10 000)進行孵育，對蛋白表達進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 CBF-β 輔助SIVagm Vif 降解A3Gagm 的檢測結(jié)果 分別采用CBF-β/SIVagm Vif/A3Gagm 3 種重組質(zhì)粒和SIVagm Vif/A3Gagm 2 種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞并采用A3G 單轉(zhuǎn)染及相關HIV 重組質(zhì)粒組合作為對照組進行對比性分析。并采用western blot 檢測目的蛋白的表達。結(jié)果顯示，同CBF-β 對HIV-1 Vif 和A3G 的作用相同，在SIVagm 中，CBF-β 的表達組中Vif 蛋白的表達顯著高于其他2組(圖1A，圖1B 第4 列)，同 時Vif/SIVagm Vif 對A3G/A3Gagm 蛋白降解作用顯著高于未加入CBF-β的對照組(圖1A，圖1B)。上述結(jié)果表明，SIVagm Vif 對A3Gagm 的降解也需要CBF-β 的輔助。

圖1 在293T 細胞中共轉(zhuǎn)染48 h 后檢測Vif 介導的A3G 降解需要CBF-βFig.1 The degradation of Vif mediated A3G with the expression of CBF-β in 293T cells at 48 hrs post cotransfections

2.2 CBF-β 對SIVagm Vif 細胞內(nèi)穩(wěn)定性的檢測結(jié)果 CHX 是一種在真核生物中對蛋白質(zhì)生物合成過程有抑制效應的化合物。結(jié)果2.1 顯示，加入CBF-β 的實驗組SIVagm Vif 的表達顯著高于其他2組。為進一步探索CBF-β 提高Vif 表達的機制，采用 將CBF-β 和Vif 表達質(zhì)粒pcDNA-HIV-1-Vif-HA、pcDNA-SIV-Vif-HA 共轉(zhuǎn)染293T 細胞后，通過CHX進行蛋白穩(wěn)定性試驗。由于CHX 能夠抑制細胞內(nèi)蛋白合成，但對蛋白降解沒有影響。通過CHX 的處理后，在與單獨表達SIVagm Vif 組相比，加入CBF-β 的實驗組SIVagm Vif 的表達水平顯著升高，同時與CHX 的作用時間呈負相關(圖2)。表明，CBF-β 不僅促進HIV-1 Vif 在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性，也能促進SIVagm Vif 在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性。

圖2 293T siRNACBF-β 細胞轉(zhuǎn)染24 h 后 經(jīng)CHX 處理后Vif 蛋白表達水平的檢測Fig.2 The stabilization of Vif in presence of CHX in 293T siRNACBF-β from 24 hrs post the transfections

2.3 Vif W38S 點突變對CBF-β 的敏感性的檢測結(jié)果 有研究表明HIV-1 Vif 中第38 位色氨酸(W)對HIV-1 Vif 與CBF-β 的相互作用具有關鍵作用。將HIV-1 Vif 的第38 位色氨酸(W)突變成絲氨酸(S)之后，HIV-1 Vif 喪失與CBF-β 之間的相互作用，CBF-β不再促進其細胞內(nèi)穩(wěn)定性以及Vif 介導的A3G 降解的功能。為了檢測在SIVamg Vif 中與CBF-β 的關鍵結(jié)合部位是否也是第38 位色氨酸，將pcDNASIVagm-Vif W38S-HA 和CBF-β 共轉(zhuǎn)染293T 細胞，對比pcDNA-SIVagm Vif-W38S-HA 單獨轉(zhuǎn)染的CHX-蛋白穩(wěn)定性試驗，發(fā)現(xiàn)CBF-β 對SIVagm W38S 突變體的穩(wěn)定性同對HIV-1 Vif 同樣沒有促進作用。此外，CBF-β 也喪失了促進SIVagm W38S 細胞內(nèi)穩(wěn)定性的能力(圖3A、B)。上述結(jié)果表明第38 位色氨酸對HIV-1 Vif、SIVagm Vif 與CBF-β 之間的相互結(jié)合作用至關重要。

2.4 Vif W38S 點突變對A3G 降解能力的檢測結(jié)果將A3G 與pcDNA-HIV-1-Vif W38S-HA、A3Gagm 與pcDNA-SIVagm Vif W38S-HA 共轉(zhuǎn)染293T 細胞后，收集樣品進行western blot 檢測。結(jié)果顯示，野生型HIV-1/SIVagm Vif 蛋白能夠有效地下調(diào)細胞內(nèi)A3G/A3Gagm 的水平(圖4A、圖4B)，而Vif W38S 突變組對A3G 的降解作用顯著下降(圖4A，圖4B)。表明W38S 的突變不但改變了CBF-β 和Vif 的結(jié)合，同時也造成了Vif 誘導相應物種A3G 降解的能力。

圖3 Vif 突變體對CBF-β 結(jié)合活性的檢測Fig.3 Detection of the binding activity of Vif mutant to CBF-β

圖4 Vif W38S 突變體對A3G 降解能力的檢測Fig.4 Detection of A3G degradation activity with Vif W38S mutant

3 討論

本研究顯示，CBF-β 能夠直接和Vif 結(jié)合影響其穩(wěn)定性，減少其寡聚化水平。從而利于Vif 招募相應的因子，發(fā)揮對A3G 的降解作用。根據(jù)晶體結(jié)構顯示，Vif 的蛋白結(jié)構包括一大一小2 個結(jié)構域[9]。CBF-β 能夠與Vif 大的結(jié)構域發(fā)生緊密結(jié)合。而CBF-β 的羧基端則在Vif 的兩個結(jié)構域間形成三明治結(jié)構。另一個結(jié)構域負責與CUL5-ELOC 結(jié)合。Vif 是處于復合體的核心位置。同時，結(jié)構顯示與CBF-β-RUNX1 結(jié)合的區(qū)域為Vif 的α/β 區(qū)域，這一區(qū)域的關鍵氨基酸為第22 位色氨酸以及第38 位色氨酸[10]。這2 個氨基酸的破壞會打破CBF-β-Vif 及RUNX-CBF-β 的連接，從而影響復合物的形 成[11]。本研究也證實了這點。將HIV-1 Vif 與CBF-β 相互作用的第38 位色氨酸突變成絲氨酸之后，CBF-β 不再促進HIV-1 Vif 在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性，該HIV-1 Vif突變體隨即喪失了誘導A3G 降解的功能。由于不同種間的差異，SIVagm Vif 沒有第22 位色氨酸，所以將SIVagm Vif 相應的第38 位色氨酸突變?yōu)榻z氨酸之后，觀察到CBF-β 不再促進SIVagm Vif 在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性，該突變體喪失了誘導A3Gagm 降解的功能。恒河猴和非洲綠猴慢病毒編碼的Vif 基因和CBF-β 作用的關鍵位點較為保守。因此，該位點將成為一個潛在的設計抗HIV-1 及SIV 藥物的靶點。

[1]Wang Xiao-jun,Dolan P T.Biochemical differentiation of APOBEC3F and APOBEC3G proteins associated with HIV-1 life cycle[J].J Biolog Chem,2006,282(3):1585-1594.

[2]Fribourgh J L,Nguyen H C.Core binding factor beta plays a critical role by facilitating the assembly of the Vif-cullin 5 E3 ubiquitin ligase[J].J Virol,2014,88(6):3309-3319.

[3]Salter J D,Lippa G M.Core-binding factor beta increases the affinity between human Cullin 5 and HIV-1 Vif within an E3 ligase complex[J].Biochem,2012,51(44):8702-8704.

[4]Ai You-wei,Zhu Dan-tong,Wang Cui-hui,et al.Core-binding factor subunit beta is not required for non-primate lentiviral vif-mediated APOBEC3 degradation[J].J Virol,2014,88(20):12112-12122.

[5]Matsui Y,Shindo K,Nagata K,et al.Defining HIV-1 Vif residues that interact with CBFbeta by site-directed mutagenesis[J].Virology,2014,449:82-87.

[6]Zhou Xiao-hong,Han Xue.Dispersed and conserved hydrophobic residues of HIV-1 Vif are essential for CBFbeta recruitment and A3G suppression[J].J Virol,2014,88(5):2555-2563.

[7]Han Xue,Liang Wei-zi.Evolutionarily conserved requirement for core binding factor beta in the assembly of the human immunodeficiency virus/simian immunodeficiency virus Vif-cullin 5-RING E3 ubiquitin ligase[J].J Virol,2014,88(6):3320-3328.

[8]Wang Xiao-dan,Wang Xiao-ying,Zhang Hai-hong,et al.Interactions between HIV-1 Vif and human ElonginB-ElonginC are important for CBF-beta binding to Vif[J].Retrovirology,2013,10(1):94-99.

[9]Guo Ying-ying,Dong Li-yong.Structural basis for hijacking CBF-β and CUL5 E3 ligase complex by HIV-1 Vif[J].Nature,2014,505(7482):229-233.

[10]Ai You-wei,Ma Jianz-hang.Multiple lysines combined in HIV-1 Vif determines the responsiveness to CBF-beta[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,457:385-390.

[11]Zhang W,Du J,Evans S L,et al.T-cell differentiation factor CBF-beta regulates HIV-1 Vif-mediated evasion of host restriction[J].Nature,2012,481(7381):376-379.