除濕丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

曾祖平，王 宏，錢 珊，彭 冰，韓旭陽，車曉平，何 薇#（.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院/北京市中醫(yī)研究所，北京 0000；.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院中藥系009級，河北廊坊 06500；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 0000）

除濕丸為皮外科泰斗趙炳南先生的臨床經(jīng)驗(yàn)方制成的水丸[1]，在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院臨床應(yīng)用數(shù)十年，收載于《醫(yī)療單位制劑規(guī)程》中，為北京市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑法定制劑，在多家醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用。除濕丸由地黃、白鮮皮、黃芩、牡丹皮、茜草、紫草、茯苓皮、炒梔子、澤瀉、連翹、豬苓、當(dāng)歸、威靈仙13 味藥組成，具有清熱涼血、燥濕止癢之功效，用于血熱濕熱所致的濕疹、脂溢性皮炎[2]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有一些試管反應(yīng)作為鑒別內(nèi)容，缺乏專屬性強(qiáng)的鑒別手段。為了保證臨床療效，控制制劑質(zhì)量，本研究增加了牡丹皮、白鮮皮的顯微鑒別和當(dāng)歸、茜草、梔子的薄層色譜（TLC）鑒別，并在同一色譜條件下測定了丹皮酚和黃芩苷的含量。按制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測了兩家醫(yī)療機(jī)構(gòu)的5 批樣品，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好，簡便易行，可有效地控制本品質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

1100 系列高效液相色譜（HPLC）儀，包括二元泵、自動進(jìn)樣器、多波長檢測器（美國Agilent公司）；DM2500M顯微鏡（德國Leica 公司）；YOKO-ZS 紫外線分析攝影儀（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)公司）；XS205 DU專業(yè)型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SK7210HP型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率：350 W，頻率：59 kHz）；Milli-Q純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

除濕丸（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，批號：120601、120602、120603；北京國濟(jì)中醫(yī)醫(yī)院，批號：110108、120120）；除濕丸處方飲片（北京杏林藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：地黃12052902、白鮮皮11110601、黃芩12010603、牡丹皮11090701、茜 草11101501、紫 草10121501、茯 苓 皮10112701、炒 梔 子11090802、澤瀉10092201、連翹11082303、豬苓10111602、當(dāng)歸12022503、威靈仙11040901，規(guī)格：1 kg/袋）；當(dāng)歸對照藥材（120927-200613）、茜草對照藥材（1049-9701）、梔子對照藥材（120986-201108）、丹 皮 酚（110708-200506）、黃 芩 苷（110715-201016）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層層析預(yù)制板（中國青島海洋化工集團(tuán)）；乙腈為色譜純（美國Fisher 公司），水為純凈水（純水儀自制），甲醇、乙醚、乙醇、正己烷、乙酸乙酯、石油醚（60～90 ℃）、丙酮、甲酸均為分析純（北京化學(xué)試劑公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 白鮮皮、牡丹皮的顯微鑒別[3-4]取本品適量，置顯微鏡下觀察：纖維單數(shù)散在，黃色，直徑25～100 μm，壁厚，層紋明顯，為白鮮皮，詳見圖1；草酸鈣簇晶存在于無色薄壁細(xì)胞中，有時數(shù)個排列成行，為牡丹皮，詳見圖2。

2.1.2 當(dāng)歸的TLC鑒別[3，5]取本品10 g，研細(xì)，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右掖? ml使溶解，作為供試品溶液。取當(dāng)歸藥材0.5 g，加乙醚20 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)靡掖? ml溶解作為當(dāng)歸對照藥材溶液。按處方比例稱取除當(dāng)歸以外的其他藥材飲片適量，粉碎，稱取10 g，照上述供試品溶液的制備方法制成缺當(dāng)歸的陰性對照溶液。照薄層色譜法[2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對照藥材溶液和缺當(dāng)歸的陰性對照溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4 ∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾，詳見圖3。

圖1 白鮮皮顯微特征Fig 1 Microscopic characteristics of C.dictamni

圖2 牡丹皮顯微特征Fig 2 Microscopic characteristics of C.moutan

圖3 當(dāng)歸的薄層色譜圖1、7.當(dāng)歸對照藥材；2～4.3 批供試品（北京中醫(yī)醫(yī)院）；5～6.缺當(dāng)歸的陰性對照；8～9.2批供試品（北京國濟(jì)中醫(yī)醫(yī)院）Fig 3 TLC of A.sinensis1、7.reference substance of A.sinensis；2-4.3 batches of test samples（Beijing Hospital of TCM）；5-6.negative control without of A.sinensis；8-9.2 batches of test samples（Beijing Guoji TCM Hospital）

2.1.3 茜草的TLC 鑒別[3]將“2.1.2”中乙醚提取后的殘?jiān)鼡]盡溶劑，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1，V/V）混合溶液20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。取茜草藥材0.5 g，加甲醇10 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至約1 ml，作為茜草對照藥材溶液。按處方配比稱取除茜草以外的其他藥材飲片適量，粉碎，稱取10 g，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液棄去，藥渣按照供試品溶液的制備方法制成缺茜草的陰性對照液。按薄層色譜法[2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取“2.1.3”中供試品溶液、缺茜草的陰性對照溶液各10 μl和對照藥材溶液5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-丙酮（4 ∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾，詳見圖4。

圖4 茜草的薄層色譜圖1、7.茜草對照藥材；2～4.3 批供試品（北京中醫(yī)醫(yī)院）；5～6.缺茜草的陰性對照；8～9.2批供試品（北京國濟(jì)中醫(yī)醫(yī)院）Fig 4 TLC of R.cordifolia1、7.reference substance of R.cordifolia；2-4.3 batches of test samples（Beijing Hospital of TCM）；5-6.negative control without of R.cordifolia；8-9.2 batches of test samples（Beijing Guoji TCM Hospital）

2.1.4 梔子的TLC鑒別[3，5]取本品10 g，研細(xì)，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾渣揮盡溶劑，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1，V/V）混合溶液20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 ml 使溶解，作為供試品溶液。取梔子藥材1 g，加50%甲醇10 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液作為梔子對照藥材溶液。按處方配比稱取除梔子以外的其他藥材飲片，粉碎，稱取10 g，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液棄去，藥渣按照“2.1.3”中供試品溶液的制備方法制成缺梔子的陰性對照溶液。按薄層色譜法[2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、缺梔子的陰性對照溶液各10 μl和對照藥材溶液5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5 ∶5 ∶1 ∶1，V/V V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，置于日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾，詳見圖5。

圖5 梔子的薄層色譜圖1、7.梔子對照藥材；2～4.3 批供試品（北京中醫(yī)醫(yī)院）；5～6.缺梔子的陰性對照；8～9.2批供試品（北京國濟(jì)中醫(yī)醫(yī)院）Fig 5 TLC of G.fructus1、7.reference substabce of G.fructus；2-4.3 batches of test samples（Beijing Hospital of TCM）；5-6.negative control without of G.fructus；8-9.2 batches of test samples（Beijing Guoji TCM Hospital）

2.2 含量測定[3，6]

2.2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（47 ∶53 ∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算＞2 500，分離度＞1.5；按丹皮酚計(jì)算＞5 000，分離度＞1.5。

2.2.2 溶液的制備（1）對照品溶液。精密稱取已干燥（60 ℃減壓干燥4 h）的黃芩苷對照品0.003 69 g，以甲醇定容于25 ml量瓶中，制成每1 ml含0.147 6 mg的黃芩苷對照品溶液。精密稱取丹皮酚對照品0.006 64 g，以甲醇定容于25 ml量瓶中，制成每1 ml 含0.265 6 mg 的丹皮酚對照品溶液。（2）供試品溶液。取除濕丸粉末（50目）1 g，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加入70%乙醇45 ml，超聲處理30 min，放至室溫，以70%乙醇定容，搖勻，取上清液，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 空白干擾試驗(yàn) 按處方比例制備不含黃芩和牡丹皮的藥品，按照上述供試品溶液制備方法制備缺黃芩和牡丹皮的陰性對照溶液。取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液和上述缺黃芩和牡丹皮的陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，在與黃芩苷和丹皮酚保留時間相應(yīng)的位置上未見相關(guān)吸收峰，說明本品中其他成分對黃芩苷和丹皮酚的測定無干擾。色譜見圖6。

圖6 除濕丸的高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.缺黃芩、牡丹皮的陰性對照品；1.黃芩苷；2.丹皮酚Fig 6 HPLC chromatograms of Chushi pillA.control sample；B.test sample；C.negative control sample without of Scutellaria baicalensis and C.moutan；1.baicalin；2.paeonol

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下兩種對照品溶液各2 ml，置于同一5 ml 量瓶中，以甲醇定容至刻度，制成黃芩苷（59.04 μg/ml）和丹皮酚（106.24 μg/ml）的混合對照品溶液。分別進(jìn)樣1、2、4、8、12、16、20 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄黃芩苷和丹皮酚峰面積。分別以黃芩苷和丹皮酚峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x，μg），進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程：y＝3 432x－5.280（r＝0.999 9），丹皮酚的回歸方程：y＝4 419x－18.67（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，黃芩苷、丹皮酚的進(jìn)樣量分別在0.059 04～1.180 8、0.106 24～2.124 8 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5 次，記錄黃芩苷和丹皮酚的峰面積。結(jié)果，黃芩苷、丹皮酚的RSD 分別為0.61%、0.87%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（批號：120120）溶液適量，每隔2 h左右進(jìn)樣測定一次，連續(xù)測定14 h。結(jié)果，黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD 分別為0.74%、0.82%，表明供試品溶液在14 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次除濕丸（批號：120120）適量，粉碎，過篩（50目），精密稱取6 份，每份約1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量。結(jié)果，除濕丸中黃芩苷平均含量為1.13 mg/g，RSD＝2.06%，丹皮酚平均含量為1.68 mg/g，RSD＝1.40%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批（批號：120120，黃芩苷平均含量為1.13 mg/g，丹皮酚平均含量為1.68 mg/g）除濕丸粉末適量，并加入一定量的黃芩苷（0.644 4 mg/ml）和丹皮酚（1.185 6 mg/ml）混合對照品溶液，其余操作同“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.2.9 樣品含量測定 取5批除濕丸樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算黃芩苷和丹皮酚的含量，結(jié)果詳見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 2 Content determination results of sample（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 定性鑒別

除濕丸為中藥復(fù)方制劑，由中藥細(xì)粉用水制成丸劑。定性鑒別時首先考慮了簡便快速的顯微鑒別，結(jié)果方中白鮮皮、牡丹皮的顯微特征明顯，其他藥味無干擾。TLC研究中，筆者曾經(jīng)嘗試鑒別處方中其他藥味。結(jié)果，供試品與紫草、澤瀉對照藥材無明顯對應(yīng)斑點(diǎn)，與地黃、威靈仙、茯苓皮、豬苓對照藥材有對應(yīng)斑點(diǎn)，但陰性有干擾，故未納入標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 含量測定

黃芩苷是黃芩的主要活性成分，具有抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)、抗微生物等藥理作用[7-10]；丹皮酚是牡丹皮中的主要活性成分，具有抗菌、抗變態(tài)反應(yīng)及免疫作用[11]。這些藥理作用與除濕丸功效密切相關(guān)，也是除濕丸的藥效成分，因此有必要控制其含量。含量測定制備供試品時，曾對供試品提取溶劑[甲醇、70%乙醇、甲醇-乙酸乙酯（1∶3，V/V）]進(jìn)行了篩選，最終確定70%乙醇為供試品溶液的提取溶劑。篩選溶劑用量時，考察了100、50、25 ml用量。結(jié)果，50 ml與100 ml的提取量相當(dāng)，故確定以50 ml作為提取溶劑用量。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為除濕丸的質(zhì)量控制方法。

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