重組囊素肽的構(gòu)建表達(dá)及其對禽流感滅活苗免疫效果的影響

姬向波，徐秋良，馮秀麗，陳溥言*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450016；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

法氏囊組織提取物中含有多種具有生物活性的短肽，其中囊素三肽(Bursin，BS)已被證實(shí)對哺乳動物和禽類具有增強(qiáng)體液免疫功能，特別是對禽類法氏囊具有保護(hù)作用[1-5]；李德遠(yuǎn)等分離到的法氏囊五肽(Bursopentin，BP5)，不僅能夠促進(jìn)B 細(xì)胞分泌抗體，還能夠促進(jìn)細(xì)胞因子分泌和增強(qiáng)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的殺傷活性[6]。因此，對法氏囊活性肽的研究具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。目前常用的制備囊素活性肽的方法有：從天然組織中分離提取或利用化工技術(shù)人工合成。組織提取的囊素肽純化難度大，雜蛋白含量高；化學(xué)合成的囊素肽雖然純度極高，但成分單一且成本較高，不適合在動物生產(chǎn)中推廣應(yīng)用[7]。王臣等利用大腸桿菌串聯(lián)表達(dá)BS 及囊素樣肽，經(jīng)小鼠模型證實(shí)其具有較好的免疫增強(qiáng)作用[8]，為體外大量制備囊素活性肽及其作為免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用提供了新的思路。

本實(shí)驗(yàn)選擇以BS 和BP5 的氨基酸序列為基本單元，設(shè)計(jì)了3 種不同的肽片段串聯(lián)體，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增串聯(lián)體編碼基因，分別將其克隆至表達(dá)載體，以大腸桿菌(E.coli)為表達(dá)宿主菌，表達(dá)重組囊素肽，并通過動物實(shí)驗(yàn)研究其作為疫苗免疫增強(qiáng)劑的效果。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動物 H9 亞型禽流感病毒(AIV)株A/Duck/Jiangsu/NJ08/05 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭其升博士惠贈，病毒滴度為108.3EID50/0.1 mL；H9 亞型AIV 滅活疫苗為青島易邦生物工程有限公司產(chǎn)品；H9 亞型AIV 血凝抗原及陽性血清購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；人工合成的BS和BP5 購自西安華辰生物科技有限公司；表達(dá)載體pET-32a、宿主菌DH5α、OrigamiTMB(E.coli OB)、兔抗鼠KLH-BS 多克隆抗體均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物重點(diǎn)免疫實(shí)驗(yàn)室保存。1 日齡海蘭褐蛋雞120羽購自鄭州正德牧業(yè)有限公司，實(shí)驗(yàn)雞父母代均為同一批次飼養(yǎng)的種雞，AIV 抗體檢測為陰性，按常規(guī)飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑 高保真Pyrobest DNA 聚合酶和各種限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠純化試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA 低分子量Marker 購自生工生物工程(上海)有限公司；SDSPAGE 低分子量Marker 購自創(chuàng)瑞公司；水溶性四唑鹽(WST-1)細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雞細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒購自美國R&D 公司。

1.3 重組囊素肽的設(shè)計(jì)與基因擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[9]，選擇BS 和BP5 氨基酸序列KHG 和CKDVY 作為串聯(lián)表達(dá)對象，設(shè)計(jì)了3 種串聯(lián)模式(表1)，按照E.coli 偏嗜性密碼子分別設(shè)計(jì)3 種串聯(lián)肽的擴(kuò)增引物，基因合成采用重疊延伸PCR(SOE-OCR)進(jìn)行擴(kuò)增。引物均由上海Invitrongen 公司合成。

表1 3 種串聯(lián)囊素肽及SOE-PCR 擴(kuò)增引物Table 1 Primers of three tandem bursa peptides

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 采用SOE-PCR 擴(kuò)增獲得3 段基因并經(jīng)Eco RⅠ/Hin dⅢ雙酶切后，分別克隆于表達(dá)載體pET-32a 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-BS1、pET-BS2、pET-BS3，并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α。由于3種重組囊素肽基因片段太小，對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定時無法區(qū)分假陽性，因此采取缺失酶切位點(diǎn)鑒定，陽性克隆由上海博亞生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及純化 將測序正確的3 種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coli OB 中。37 ℃振搖培養(yǎng)，至OD600nm約為0.4～0.6 時，以終濃度為1 mM 的IPTG，于22 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。菌液離心后收集上清和沉淀，裂解處理后進(jìn)行SDS-PAGE，檢測表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)形式。并采用兔抗鼠KLH-BS 多克隆抗體為一抗，進(jìn)行western blot 鑒定。

鑒定正確的重組蛋白采用Ni 柱親和層析進(jìn)行純化。并將其經(jīng)PBS 透析濃縮，得到純度極高的3 種重組囊素肽，分別命名為BS1、BS2、BS3。經(jīng)分光光度儀檢測定量后冷凍干燥備用。

1.6 動物的分組與免疫 具體免疫劑量和分組詳見表2。首免時間為7 日齡，二免時間為30 日齡，兩次免疫均采用頸部皮下注射。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design

1.7 血清的采集與分析 分別于兩次免疫后第14 d，每組隨機(jī)抽取10 只雞，翅靜脈采血，分離血清，按照OIE 血凝抑制(HI)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作方法[10]，進(jìn)行血清HI 效價(jià)的測定。于第二次免疫后第7 d，每組隨機(jī)抽取10 只雞，采血，分離血清，采用商品化檢測試劑盒檢測血清中IL-4 和IFN-γ 的含量。

1.8 外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 于第二次免疫后第7 d，每組隨機(jī)抽取10 只雞，EDTA-肝素鈉抗凝采血，參考文獻(xiàn)[11]方法分離淋巴細(xì)胞。采用改良的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)WST-1 法，將淋巴細(xì)胞接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，以10 μL ConA(10 μg/mL)抗原刺激，同時設(shè)立空白對照。刺激48 h 后，每孔加入10 μL WST-1 溶液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。采用酶標(biāo)儀測定OD450nm值，以630 nm 為參考波長，分析細(xì)胞增殖情況。

1.9 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以LSD Test 進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 串聯(lián)囊素肽的PCR 擴(kuò)增及序列驗(yàn)證 采用SOE-PCR 擴(kuò)增法，利用表1 中引物對BS1、BS2、BS3基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，在100 bp 處有特異的目的片段(圖1)。將其回收、酶切后克隆至表達(dá)載體pET-32a 中。根據(jù)測得序列推導(dǎo)氨基酸序列，與設(shè)計(jì)的3 種串聯(lián)囊素肽氨基酸殘基完全一致，表明串聯(lián)囊素肽基因正確插入至表達(dá)載體pET-32a 的多克隆位點(diǎn)。

2.2 重組囊素肽的表達(dá)及鑒定 將pET-BS1、pETBS2、pET-BS3分別轉(zhuǎn)化E.coli OB 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示3 株陽性重組菌的表達(dá)上清約在21 ku 各有一條帶，而沉淀和pET-32a/OB 誘導(dǎo)后上清無相應(yīng)條帶，表明重組囊素肽主要以可溶形式表達(dá)(圖2)。Western blot結(jié)果顯示，3 個重組蛋白在21 ku 均出現(xiàn)特異性條帶，表明3 種表達(dá)產(chǎn)物均可以與兔抗鼠KLH-BS 多克隆抗體特異性結(jié)合，具有良好的免疫原性(圖2)。

圖1 3 種串聯(lián)囊素肽基因的PCR 結(jié)果Fig.1 Amplifications of three tandem bursa pepties by PCR

圖2 3 種重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE 檢測(A)和western blot(B)鑒定Fig.2 Detection and identification of three recombinant proteins expression by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

2.3 HI 抗體動態(tài)變化分析 每組實(shí)驗(yàn)雞于免疫后第14 d 采血，通過HI 試驗(yàn)檢測抗體產(chǎn)生的情況。結(jié)果顯示，兩次免疫后，與單獨(dú)免疫滅活A(yù)IV 組和商品化疫苗組相比，以重組囊素肽和人工合成囊素肽為免疫增強(qiáng)劑組，抗體水平均顯著增高(p<0.05)，其中BS3促進(jìn)抗體提高的水平低于其它兩種重組囊素肽。加強(qiáng)免疫后，以重組囊素肽為免疫增強(qiáng)劑組的抗體水平顯著低于以人工合成囊素肽為免疫佐劑組(p<0.05)(圖3)。

2.4 血清中細(xì)胞因子變化分析 第二次免疫后第7 d，采血分離血清，采用細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒檢測IL-4 和IFN-γ，結(jié)果顯示，與單獨(dú)免疫滅活A(yù)IV組和商品化疫苗組相比，3 種重組囊素肽和人工合成BP5 均能夠明顯提高雞血清中IL-4 含量(p<0.05)，其中重組囊素肽BS1和人工合成BP5 的效果基本相同；但與商品化疫苗組相比，BS2、BS3僅能夠提高雞血清中IL-4 含量的升高，對IFN-γ 的產(chǎn)生無明顯影響(圖4)。

圖3 免疫后AIV 血凝抗體滴度Fig.3 Antibody titer of AIV

圖4 免疫后血清細(xì)胞因子水平Fig.4 Cytokine response to vaccination

2.5 外周血淋巴細(xì)胞增殖情況 第二次免疫后第7 d，翅靜脈抗凝采血，分離淋巴細(xì)胞，ConA 進(jìn)行刺激，檢測外周血淋巴細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，使用重組囊素肽BS1和人工合成BP5 作為免疫佐劑的淋巴細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，兩組之間無明顯差異，并且明顯高于對照組和其它免疫組(p<0.05)；以BS2、BS3為免疫佐劑組的淋巴細(xì)胞的增殖活性高于單獨(dú)使用滅活A(yù)IV 免疫組，并且差異顯著(p<0.05)，但與AIV 疫苗免疫組相比差異不顯著；而以人工合成的BS 作為免疫佐劑組與單獨(dú)使用滅活A(yù)IV 組相比差異也不顯著(圖5)。

3 討論

臨床應(yīng)用顯示，以法氏囊組織培養(yǎng)制備的傳染性法氏囊炎病毒疫苗的免疫保護(hù)率明顯高于其它類型的疫苗[12]。另外，胸腺提取物、小牛脾提取物也被廣泛地當(dāng)作免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用。這些均表明，在動物免疫器官中存在許多未知的免疫活性分子。將一定量BS 與疫苗聯(lián)合使用，能夠提高疫苗的免疫保護(hù)效果，并對免疫器官有一定程度的保護(hù)作用，為法氏囊活性肽作為疫苗佐劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[3-5]。研究表明，利用基因工程技術(shù)制備的重組胸腺肽與天然胸腺肽具有相同的生物學(xué)活性[13-14]。為探索體外大量獲取囊素活性肽的有效方法，本實(shí)驗(yàn)以E.coli為宿主菌，選取能夠增強(qiáng)體液免疫的BS 和對T、B淋巴細(xì)胞具有雙重活性的BP5 為串聯(lián)表達(dá)對象，分別以BP5 單體重復(fù)串聯(lián)、BP5 與BS 間隔重復(fù)串聯(lián)的排列方式，表達(dá)包含不同氨基酸序列的重組囊素肽。為獲得高效的表達(dá)產(chǎn)量，選用與pET-32a 相匹配的表達(dá)菌株OrigamiTMB，可以在胞質(zhì)中促進(jìn)二硫鍵的形成，這樣的組合有利于獲得較高產(chǎn)量的可溶性、具有活性的目的蛋白。同時，采用低溫22 ℃延長誘導(dǎo)時間，使3 種重組囊素肽均以可溶性大量表達(dá)。

圖5 免疫后各組外周血淋巴細(xì)胞增殖能力結(jié)果Fig.5 Lymphocyte proliferation response after vaccination

IL-4 和IFN-γ 分別屬于Th2 型和Th1 型細(xì)胞因子，是細(xì)胞免疫和體液免疫的重要調(diào)節(jié)因子[15-16]。對3 種重組囊素肽聯(lián)合滅活A(yù)IV 免疫雛雞的免疫效果檢測表明，原核表達(dá)的3 種重組囊素肽，均能夠不同程度地提高雞對滅活A(yù)IV 的免疫應(yīng)答，但這種作用在加強(qiáng)免疫時不太明顯；其中以BP5 單體重復(fù)串聯(lián)的BS1對提高T 淋巴細(xì)胞免疫和抗體分泌均有明顯作用，效果與人工合成囊素肽相當(dāng)；而以BP5和BS 間隔串聯(lián)的BS2和BS3僅表現(xiàn)出增強(qiáng)Th2 型細(xì)胞因子分泌的作用。表明重組囊素肽的免疫增強(qiáng)作用與文獻(xiàn)報(bào)道的BP 和BP5 的生物學(xué)活性基本一致，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)將BP5 和BS 以不同方式串聯(lián)后并未產(chǎn)生免疫增強(qiáng)的疊加效應(yīng)。

研究表明，具有免疫活性的小分子多肽，因其結(jié)構(gòu)簡單，分子量小，能夠通過細(xì)胞膜的滲透以原型形式直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且對機(jī)體不具有免疫原性，能夠多次重復(fù)使用仍保持良好的活性[17]。天然提取和人工合成的BS 和BP5 分別由3 個和5 個氨基酸組成，空間結(jié)構(gòu)簡單，而原核表達(dá)產(chǎn)物BS1、BS2和BS3，則是多個BS 和BP5 的多個串聯(lián)體，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，免疫原性增強(qiáng)；而且3 種串聯(lián)體中均含有兩個或更多的半胱氨酸，是否會形成鏈內(nèi)二硫鍵本實(shí)驗(yàn)還未驗(yàn)證。另外，重組多肽通過注射方式進(jìn)入體內(nèi)后，將如何被機(jī)體吸收還未可知，是否會影響其免疫活性還需進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)室將在后期的研究中探索其發(fā)生機(jī)制。本研究為重組囊素肽的制備和臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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