水霉菌生物膜體外模型構建及結構特征

俞 軍，袁海蘭，歐仁建，胡 鯤，楊先樂

(1.上海海洋大學 國家水生動物病原庫，上海 201306；2.成都市龍泉驛區(qū)水務局，四川 成都 610100)

水霉菌(Saprolegnia)為一種廣泛存在于淡水水域中的條件致病真菌，對溫度的適應范圍廣，一年四季均可發(fā)生[1]。水霉菌對寄主無嚴格選擇性，能夠感染天然或人工養(yǎng)殖的魚體或魚卵而暴發(fā)水霉病，嚴重危害水產養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

目前，一般認為幾乎所有致病菌均能夠形成生物膜(Biofilm，BF)[2]。BF 是一種附著于生物或非生物表面、包裹著由其自身產生的細胞外多聚基質(ECM)、具有三維結構的菌細胞群體。微生物可以在浮游細胞和多細胞群落兩種形態(tài)之間相互轉化，BF 為菌體提供庇護場所，并成為持續(xù)感染源[3]。現(xiàn)已證實多種致病真菌可以形成與細菌BF 相類似的BF，而且BF 的形成對真菌的環(huán)境適應能力、藥物敏感性等影響較大。2013 年，Ali 首次報道了水霉菌可以形成BF，并在BF 中大量存活(即使在施用有效的藥物后)，從而對水產動物構成持續(xù)的感染[4]。因此，對水霉菌致病性的深入研究及防治水霉病藥物的開發(fā)具有十分重要的意義。

玻片常作為體外構建細菌、真菌BF 的粘附基質；在人類致病菌BF 形成的研究中發(fā)現(xiàn)，致病菌往往會附于留置醫(yī)療器械表面，形成BF 結構，引起導管和醫(yī)療植入物相關醫(yī)源性感染[2]，BF 體外構建也常常采用這些材料作為基質，而聚乙烯網(wǎng)片則是作為黏性卵粘附載體廣泛用于魚卵孵化生產中。因此本研究采用這兩種材料建立了水霉菌BF 體外模型，并分析其形成過程及結構特征，為水霉菌BF的進一步研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌 株 寄生水霉(Saprolegnia parasitica)ATCC200013(1990 年分離自日本神奈川患水霉病的虹鱒)購自美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)。

1.2 主要試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)購自國藥集團化學試劑有限公司；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基購自杭州天和微生物試劑有限公司；細胞計數(shù)試劑盒CCK-8 購自碧云天生物技術研究所；熒光染色劑Calcofluor White M2R Tinopal UNPA-GX 購自Sigma公司；熒光DNA 染料L34952LIVE/DEAD?Funga-LightTMYeast Viability Kit(SYTO 9/PI)購自Invitrogen公司。

1.3 水霉菌孢子懸液的制備 將菌種接種于PDA平皿上，20 ℃活化[5]。在平皿上鋪滿油菜籽，待菌絲長上菜籽，將菜籽移至滅菌蒸餾水中。20 ℃培養(yǎng)48 h，待游動孢子大量產生后，以3 層滅菌紗布過濾棄去油菜籽，離心收集水霉菌孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，濃度調至2×106個/mL。

1.4 BF 體外構建 在培養(yǎng)板中預先放入無菌的蓋玻片和聚乙烯網(wǎng)片(40 目)，每種材料分3 個孔放入。將1 mL 孢子懸液和1 mL 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基加入至6 孔培養(yǎng)板中，20 ℃培養(yǎng)72 h。篩選出適宜體外構建水霉菌BF 的材料[6]。

1.5 BF 的定量分析 按以上方法選出適宜的材料，并依照同樣的方法在培養(yǎng)板中構建BF，設不加水霉菌孢子懸液的空白對照組。靜置培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h 及72 h 后，吸出多余的培養(yǎng)基，經滅菌PBS 清洗3 次以去除游離菌。試驗重復3 次。

按照細胞計數(shù)試劑盒CCK-8 方法，在培養(yǎng)板中分別加入沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基和CCK-8 工作液，于28 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，將反應液平分于96 孔板中，測定每孔OD450nm值。實際OD450nm為每個實驗孔的OD450nm減去空白對照孔的OD450nm。

結果以平均數(shù)加或減標準偏差表示，采用EXCEL、SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.6 BF 的觀察 將培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 及72 h 含BF 的載體材料經滅菌PBS 沖洗3 次，200 μL Calcofluor White M2R(0.05 %[V/V])避光染色1 min，沖洗后放置于載玻片上熒光顯微鏡下觀察[7]。

將在培養(yǎng)板中20 ℃培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 及6 d含BF 的載體取出，制備掃描電鏡標本，在Hitachi S-3400NII 掃描電鏡下觀察[8]。

取不同時間段的BF 載體，按文獻[9]方法處理并使用激光共聚焦顯微鏡觀察。由BF 游離面向BF與聚乙烯網(wǎng)片附著面逐層掃描(沿Z 軸掃描)，每個標本取3 個隨機視野，每個視野根據(jù)BF 的厚度，掃描8 層～30 層。

2 結果

2.1 構建水霉菌BF 載體材料篩選 水霉菌在聚乙烯網(wǎng)片和蓋玻片上形成BF 如圖1 所示，水霉菌在兩種材料表面均可以形成水霉菌BF，但蓋玻片上形成的水霉菌BF 較少，粘附不牢固，清洗時易脫落；而聚乙烯網(wǎng)片表面形成的水霉菌BF 較多，與聚乙烯網(wǎng)片緊密粘附，完全覆蓋聚乙烯網(wǎng)片，形成厚厚的膜狀結構。

圖1 水霉菌在聚乙烯網(wǎng)片和玻片上BF 的形成情況Fig.1 The S.parasitica BF developed on polyethylene netting(a)and glass slide(b)

2.2 水霉菌BF 形成過程 靜置培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h 及72 h 后，水霉菌BF 形成情況如表1所示，在培養(yǎng)初期，水霉菌所形成的BF OD450nm隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，培養(yǎng)后24 h 內升高較快，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h～72 h 逐漸趨于穩(wěn)定。

表1 不同培養(yǎng)時間水霉菌形成BF 的OD450nm值Table 1 OD450nmvalues of S.parasitica BF of different incubation times

2.3 水霉菌BF 形成過程及結構觀察 將培養(yǎng)不同時間形成的水霉菌BF 進行Calcofluor White M2R 染色后觀察其形成過程，結果顯示，水霉菌在第6 h即開始有散在的孢子黏附于載體材料上(圖2a)；12 h時菌絲延長交織(圖2b)；24 h 水霉菌菌絲纏繞，菌絲外胞外基質增多，菌絲被胞外基質包裹，開始形成膜狀結構覆蓋在載體材料上(圖2c)；隨培養(yǎng)時間延長，BF 形成逐漸增多，最后完全包裹在胞外基質中，覆蓋整個材料(圖2d-g)。并且在水霉菌BF 中可見孢子囊(圖2h)和大量游動孢子(圖2i)，其中以水霉菌菌絲為主要結構的微生物群落。

圖2 Calcofluor White M2R 染色觀察水霉菌BF 形成過程及胞外基質情況Fig.2 Examination developmental phases of S.parasitica BF with Calcofluor White M2R stain by fluorescence microscopy

將在聚乙烯材料表面培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 的水霉菌BF 于掃描電鏡下對其形成過程進行觀察。結果顯示：24 h 稀疏的菌絲交織(圖3a)，48 h 逐漸致密(圖3b)，72 h 形成復雜的網(wǎng)狀結構(圖3c)，而在培養(yǎng)后期(6d)菌絲扭曲、斷裂(圖3d)。在掃描電鏡下可見水霉菌BF 菌絲有序排列、成簇交織生長，形成具有復雜的三維立體結構特征的多細胞菌落(圖3e-f)。

圖3 掃描電鏡觀察水霉菌BF 結構特征Fig.3 Examination structural characteristic of S.parasitica BF by scanning electron microscope

2.4 水霉菌BF 的立體結構特征 激光共聚焦顯微鏡觀察SYTO 9/PI 染色24 h、48 h、72 h 水霉菌BF。圖4 顯示不同時間段BF 一個隨機視野的截面紅綠通道信號疊加圖。其中，紅色信號代表死菌(死菌被PI 著色發(fā)出紅色熒光)，綠色信號代表活菌(活菌被SYTO 著色發(fā)出綠色熒光)，部分圖像呈橙色或桔黃色，一般認為是死菌和活菌重疊造成。結果顯示，24 h 時，已有水霉菌孢子萌發(fā)，菌絲交織成稀疏的BF 結構(圖4-1a)。48 h 時水霉菌密集，層疊成簇延伸生長(圖4-2a)。隨著培養(yǎng)時間的延長，水霉菌密度不斷的增加，至72 h 時水霉菌形成致密的網(wǎng)狀結構(圖4-3a)。同時，死菌明顯增多，可見死菌(紅色信號)大大增多，死菌和活菌交織共同形成BF結構。

3 討論

相對于浮游形式而言，微生物BF 是一種具有高度組織性、協(xié)調性的微群體形式，這種復雜結構的維持對微生物生物學行為極為重要。開展BF 相關研究的前提就是建立標準規(guī)范的BF 模型。本實驗采用置片法體外構建水霉菌BF，置片法即在微生物培養(yǎng)液中加入玻璃片或其他片狀、管狀物靜置共培養(yǎng)，以提供額外的可供BF 附著并可以移動處理的表面[10]。本研究中載體材料選用40 目聚乙烯網(wǎng)片，因其作為魚卵孵化生產中黏性卵的粘附載體，其上形成的BF 更能夠模擬田間所形成的水霉菌BF。結果表明，玻片上形成的水霉菌BF 較少，并且易于刮落。而聚乙烯網(wǎng)片上的BF 與網(wǎng)片牢固粘附，形成致密、復雜的BF 結構。表面性質與BF 體外構建密切相關[11]，糙面可能更利于BF 的形成，本研究結果表明聚乙烯網(wǎng)片可以作為研究水霉菌BF較好的載體。

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察水霉菌BF 的立體結構Fig.4 Examination stereoscopic structure of S.parasitica BF by confocal laser scanning microscopy

真菌的BF 形成過程不盡相同，但大致可分為早期(≈0～11 h)、中期(≈12～30 h)及成熟期(≈38～72 h)[7]。白念珠菌芽生孢子早期粘附在有機玻璃表面，逐漸形成微菌落；中期由于細胞的生長、聚合，菌體變厚，并且胞外基質覆蓋在菌體表面；成熟期BF 結構變得更加復雜，直到菌體完全被胞外基質包裹。絲狀真菌BF 的形成過程，與真菌BF 典型的形成過程大致一致[12]。本研究通過測定細胞活力及顯微鏡觀察描述水霉菌BF 的形成過程，結果顯示，0～6 h 為水霉菌黏附初期；12 h～24 h 形成單細胞層；36 h～60 h 為中間形成階段，至72 h 菌絲纏繞形成多層的、彌散著大量細胞外基質的立體結構，同時死菌隨著培養(yǎng)時間延長而增多。該過程與煙曲霉生BF 的發(fā)育過程類似[13]，只要在適合的底物上，其孢子也會發(fā)生黏附、萌芽、菌絲延長、直至形成菌絲有序排列的三維立體結構并產生細胞外基質。

熒光染色劑Calcofluor White M2R 能夠與纖維素、幾丁質和其他β-1，4 糖苷鍵碳水化合物緊密結合，吸收紫外光，發(fā)出明亮的藍色熒光[14]。本研究利用鈣熒光白染色技術證明了細胞外基質的存在，并發(fā)現(xiàn)隨著BF 的成熟，胞外基質隨之增多，最后菌絲及相關繁殖體完全被包裹在其中。這可能與BF內外信息交流和耐藥性具有密切關系[15]。

綜上所述，聚乙烯網(wǎng)片可以作為研究水霉菌BF較好的載體，水霉菌能夠在聚乙烯網(wǎng)片上形成典型的BF 結構，即菌絲相互黏附形成的有結構的微生物群落；菌絲有序分布，菌絲周圍有細胞外基質的包裹。本研究體外構建了水霉菌BF，了解其形成過程與結構特征，有助于早期干預和防止水霉菌BF的形成，也為水霉菌BF 進一步研究提供參考。

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