華南地區(qū)豬場豬流感和甲型H1N1/2009 流感病毒的血清學(xué)調(diào)查

何淑儀，馬 駿，方 博，孫彥闊，羅永峰，秦 鋒，鄭 運，曹振鵬，周 沛，粟 碩，張桂紅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642)

豬A 型流感病毒(Swine influenza virus，SIV)可以造成豬急性和高度接觸性呼吸道疾病，能夠引起不同日齡及品種的豬感染發(fā)病[1]。

1993 年，Guan 等從中國南方以及東南亞地區(qū)分離出類禽(Eurasian Avian-like，EA)H1N1 SIV[2]。隨后，EAH1N1 SIV 在亞洲地區(qū)豬群中廣泛流行。大部分H3N2 SIV 是由人流感病毒通過跨種間傳播到豬群形成的[3]。2009 年甲型H1N1/2009 流感(H1N1 pdm09)在墨西哥暴發(fā)，并且迅速蔓延感染全球其他國家地區(qū)的人和豬群。H1N1pdm09 流感病毒來源于豬，是一種人、豬、禽三源重組病毒[4]。豬呼吸道上皮具有2 種流感病毒受體，能夠同時感染人流感病毒和禽流感病毒。因此豬被認為是流感病毒的“混合器”，對新型流感病毒的形成起到重要的作用[5-6]。了解豬群中流感的疫情動態(tài)是人類流感防控的重要依據(jù)，具有重大的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

國際組織如WHO、OIE 和FAO 認為在全世界范圍內(nèi)急需開展流感監(jiān)測活動[7]。中國華南地區(qū)被認為是世界流感病毒流行的中心之一[8]。為調(diào)查華南地區(qū)豬場SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的感染情況，本研究室對2013 年～2014 年采集的2 208 份血清樣品進行了H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09流感病毒的血清學(xué)檢測。

1 材料和方法

1.1 參考病毒株 A/swine/Guangdong/SS1/2012(HINI)(HIN1 SIV)、A/swine/Guangdong/L22/2010(H3N2 SIV)和A/Guangdong/1057/2010(H1N1pdm09)均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽病實驗室提供。

1.2 血清樣品 2013 年10 月～2014 年9 月，在廣東省、廣西省、江西省、湖南省、福建省共73 個豬場，采集未進行流感疫苗免疫的臨床健康豬的血清樣品2 208 份。并詳細記錄豬只的年齡、樣品的采集時間和來源地址。

1.3 血清樣品的檢測 通過血凝抑制試驗(HI)，對采集的2 208 份血清樣品進行血清學(xué)檢測。為防止血清學(xué)檢測中非特異性結(jié)果，采用受體破壞酶(RDE)處理血清樣品，去除血清中非特異性抑制因子。RDE 購自美國Sigma 公司。根據(jù)各株抗原病毒的血凝(HA)效價配制4 個HAU(4 單位抗原)。依據(jù)OIE 標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)診斷手冊說明進行HI 試驗，記錄HI 效價。檢驗結(jié)果為陽性或陰性的臨界值(Cut off point)為1∶40，HI 價≥1∶40 時，結(jié)果判定為陽性。

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 和GraphPad Prism 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析?；诙椃植?5 %置信區(qū)間(Confidence interval，CI)計算SIV 和H1N1pdm09 流感病毒血清抗體陽性率，并用卡方檢驗χ2比較各組數(shù)據(jù)的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。計算流感病毒抗體幾何平均滴度(Geometric mean antibody titers，GMT)。

2 結(jié)果

2.1 華南地區(qū)豬場SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體檢測結(jié)果 采用HI 試驗對華南地區(qū)2 208 份血清樣品進行SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體檢測分析，陽性血清共1 269 份(57.47 %)，結(jié)果顯示，H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體陽性血清分別為497 份(22.51 %)、728 份(32.97 %)和585 份(26.49 %)。其中，H3N2 SIV 抗體陽性率最高(p<0.01)。并且在571 份血清中同時檢測到至少兩種亞型流感病毒抗體，其中有290 份血清存在H1N1 SIV 與H1N1pdm09 流感病毒混合感染，高于其他亞型之間的混合感染(p<0.05)。另外，只在65份血清中同時檢測到3 種亞型流感病毒抗體(表1)。

2.2 華南地區(qū)豬場SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體滴度分布情況和以及其GMT 2 208 份血清樣品進行SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體檢測后，通過GraphPad Prism 軟件分析抗體滴度分布情況和計算GMT，結(jié)果顯示，H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體GMT 分別為88.14±1.04、67.27±1.03 和91.93±1.04(圖1)。其中H1N1pdm09流感病毒的GMT 最高(p<0.05)，抗體滴度最高可達1:1 280，而H3N2 SIV 的GMT 最低(p<0.05)，抗體滴度最高只達1:640。

表1 華南地區(qū)豬群(n=2 208)SIV 和H1N1pdm09流感病毒HI 抗體的檢測情況Table 1 Statistics of pigs(n=2,208)with HI antibodies to SIV and H1N1pdm09 virus in Southern China

圖1 H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的抗體滴度分布情況以及其GMTFig.1 The antibody titers distribution and GMT of H1N1 SIV,H3N2 SIV and H1N1pdm09 virus

2.3 華南地區(qū)SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的季節(jié)性流行特征 采用HI 試驗，對華南地區(qū)2 208 份血清樣品進行SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體檢測，并且按照時間順序?qū)I 檢測結(jié)果進行分析。結(jié)果如圖2 所示，H1N1 SIV 在12 月抗體陽性率為46.81%，達到全年最高(p<0.01)，但在1 月和2 月抗體陽性率持續(xù)下降，在2 月達到最低(5.74 %，p<0.01)。H3N2 SIV 在2 月也達到全年最低(p<0.01)。但在此時間段H1N1pdm09 流感病毒抗體陽性率只有輕微的變化，從29.08%降到24.40%。在5 月和9 月H1N1 pdm09 流感病毒抗體陽性率達到最高(36.90 %，p<0.01)。在5 月H1N1 SIV、H3N2 SIV 抗體陽性率也出現(xiàn)另一個高峰(p<0.01)。

2.4 華南地區(qū)各省份豬場SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的感染情況 對華南地區(qū)廣東省、廣西省、福建省、湖南省和江西省5 個省份的豬場血清樣品進行了SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體檢測分析，發(fā)現(xiàn)SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的流行存在明顯的區(qū)域性差異(p<0.01)，廣東省(64.48 %)和廣西省(75.00 %)的總陽性率明顯高于福建省(49.77 %)、江西省(37.21 %)和湖南省(55.45 %)。湖南省的H1N1 SIV 抗體陽性率最高(35.45 %，p<0.01)。廣西省的H3N2 SIV 抗體陽性率最高(53.45 %，p<0.01)。5 個省份豬場血清樣品的H1N1pdm09 流感病毒抗體陽性率差異不明顯(圖3)。

圖2 按照時間順序分析華南地區(qū)H1N1 SIV、H3N2 SIV和H1N1pdm09 流感病毒抗體陽性率Fig.2 Seroprevalences against H1N1 SIV,H3N2 SIV and H1N1pdm09 virus were analyzed by time-series decomposition

圖3 華南地區(qū)各省H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09流感病毒抗體陽性率(按以上順序展示)Fig.3 Seroprevalences of H1N1 SIV,H3N2 SIV and H1N1pdm09 virus in different provinces in southern China

2.5 不同年齡豬群SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的感染情況 采用HI 試驗，對仔豬、育肥豬和母豬的H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體進行檢測和分析比較，結(jié)果如表2 所示(年齡記錄不完整的血清樣品，將不進行分析)，母豬體內(nèi)的H1N1 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒抗體陽性率均比仔豬和育肥豬高，但它們的H1N1pdm09 流感病毒抗體陽性率差異并不顯著(p>0.05)。仔豬的H3N2 SIV抗體陽性率比母豬和育肥豬高，但差異也不顯著(p>0.05)。

表2 仔豬、育肥豬和母豬H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09 流感病毒的血清學(xué)檢測Table 2 Seroprevalences against HIN1 SIV,H3N2 SIV and H1N1pdm09 virus in piglets,finishing pigs and sows

3 討論

根據(jù)HI 試驗檢測結(jié)果，華南地區(qū)豬場廣泛存在SIV 和H1N1pdm09 流感病毒感染。雖然H3N2 SIV抗體陽性率最高(p<0.01)，但其抗體滴度普遍偏低(p<0.05)。H1N1pdm09 流感病毒的GMT 最高(p<0.05)。有報道在中國豬群分離到H1N1pdm09 流感病毒與H3N2 SIV 的重組病毒[9]，這表明H1N1pdm09 流感病毒逐漸在豬群中流行。本研究調(diào)查結(jié)果顯示華南地區(qū)豬場存在兩種或兩種以上不同亞型流感病毒的混合感染。

本研究對SIV 和H1N1pdm09 流感病毒在豬群中流行的季節(jié)性特征進行了分析研究，表明華南地區(qū)豬場全年均存在H1N1 SIV、H3N2 SIV 和H1N1pdm09流感病毒感染，但它們的季節(jié)性特征不明顯，而且不同亞型之間差異性顯著(p<0.01)。對于H1N1 SIV和H3N2 SIV，在冬季抗體陽性率最高(p<0.01)，與他人的研究結(jié)果一致[10-11]。值得注意的是，在2 月(同樣也是冬季)它們的抗體陽性率最低(p<0.01)。H1N1pdm09 流感病毒在豬群中流行的季節(jié)性特征與SIV 截然不同，也與人流感病毒的季節(jié)性特征不同[12]。近幾年對流感病毒在豬群流行的季節(jié)性特征研究較少，所以出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因還不清楚。位于不同氣候區(qū)域的豬場和現(xiàn)代養(yǎng)殖體系都有復(fù)雜的環(huán)境控制系統(tǒng)和不同的管理制度[11]，豬流感的季節(jié)性可能不明顯，與人流感的季節(jié)性特征不同。所以對于SIV 和人流感病毒在豬群中流行的季節(jié)性特征有待繼續(xù)深入研究，這對流感病毒防控措施的制定將起到相當(dāng)重要的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)仔豬的母源抗體能夠持續(xù)2～4 個月[13]。由于母源抗體的存在，在仔豬體內(nèi)流感病毒的感染和傳播受到了限制。因此，一般情況母豬和育肥豬的血清陽性率比仔豬高。然而，我們卻發(fā)現(xiàn)仔豬的H3N2 SIV 抗體陽性率較高。H3N2 SIV 與人流感病毒密切相關(guān)。許多研究表明，人可能是畜群感染流感病毒的原因之一[14]。因此，在SIV 的防控中，豬場應(yīng)該限制人員進出，特別要嚴格控制人與仔豬的接觸。加強對仔豬的飼養(yǎng)管理，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔。

本研究表明，SIV 和H1N1pdm09 流感病毒在華南地區(qū)廣泛流行，存在區(qū)域性差異，廣東省和廣西省的感染情況較為嚴重，需要進一步的研究調(diào)查分析原因。SIV 和H1N1pdm09 流感病毒在豬群中流行的季節(jié)性特征和對不同年齡豬群抗體陽性率的檢測分析結(jié)果，為制定和實施有效的流感防控措施提供參考。

[1]Olsen C W.The emergence of novel swine influenza viruses in North America[J].Virus Res,2002,85(2):199-210.

[2]Guan Yi,Shortridge K F,Krauss S,et al.Emergence of avian H1N1 influenza viruses in pigs in China[J].J Virol,1996,70(11):8041-8046.

[3]Gregory V,Lim W,Cameron K,et al.Infection of a child in Hong Kong by an influenza A H3N2 virus closely related to viruses circulating in European pigs[J].J Gen Virol,2001,82(Pt 6):1397-1406.

[4]Zhu Hua-chen,Webby R,Lam T T,et al.History of swine influenza viruses in Asia[J].Curr Top Microbiol Immunol,2013,370:57-68.

[5]Scholtissek C,Burger H,Kistner O,et al.The nucleoprotein as a possible major factor in determining host specificity of influenza H3N2 viruses[J].Virology,1985,147(2):287-294.

[6]Shinde V,Bridges C B,Uyeki T M,et al.Triple-reassortant swine influenza A(H1)in humans in the United States,2005-2009[J].N Engl J Med,2009,360(25):2616-2625.

[7]Song M S,Lee J H,Pascua P N,et al.Evidence of humanto-swine transmission of the pandemic(H1N1)2009 influenza virus in South Korea[J].J Clin Microbiol,2010,48(9):3204-3211.

[8]Shortridge K F,Stuart-Harris C H.An influenza epicentre?[J].Lancet,1982,2(8302):812-813.

[9]Fan Xiao-hui,Zhu Hua-chen,Zhou Bo-ping,et al.Emergence and dissemination of a swine H3N2 reassortant influenza virus with 2009 pandemic H1N1 genes in pigs in China[J].J Virol,2012,86(4):2375-2378.

[10]Beaudoin A,Johnson S,Davies P,et al.Characterization ofinfluenza a outbreaks in Minnesota swine herds and measures taken to reduce the risk of zoonotic transmission[J].Zoonoses Public Health,2012,59(2):96-106.

[11]Poljak Z,Carman S,Mcewen B.Assessment of seasonality of influenza in swine using field submissions to a diagnostic laboratory in Ontario between 2007 and 2012[J].Influenza Other Respir Viruses,2014,8(4):482-492.

[12]Cheng Xiao-wen,Tan Yi,He Ming-liang,et al.Epidemiological dynamics and phylogeography of influenza virus in southern China[J].J Infect Dis,2013,207(1):106-114.

[13]Van Reeth K,Labarque G,Pensaert M.Serological profiles after consecutive experimental infections of pigs with European H1N1,H3N2,and H1N2 swine influenza viruses[J].Viral Immunol,2006,19(3):373-382.

[14]Alexander D J.An overview of the epidemiology of avian influenza[J].Vaccine,2007,25(30):5637-5644.