原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的線粒體tRNA基因突變分析

李紅超，舒紅英，李曉杰，倪　斌，謝海龍，周海燕，倪　崖*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院/生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035； 2.湖南省計劃生育研究所 現(xiàn)代優(yōu)生技術(shù)

湖南省重點實驗室， 湖南 長沙 410126； 3.郴州市第一人民醫(yī)院病理科， 湖南 郴州 423000)

原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的線粒體tRNA基因突變分析

李紅超1，舒紅英2，李曉杰3，倪斌2，謝海龍2，周海燕2，倪崖1*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院/生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035； 2.湖南省計劃生育研究所 現(xiàn)代優(yōu)生技術(shù)

湖南省重點實驗室， 湖南 長沙 410126； 3.郴州市第一人民醫(yī)院病理科， 湖南 郴州 423000)

摘要：為尋找原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病病例是否存在已知以及未知的線粒體tRNA致病性突變，以探討擴(kuò)張型心肌病可能的發(fā)病原因。收集2例原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病患者和10例正常對照尸檢心肌組織石蠟標(biāo)本，針對22種線粒體tRNA基因分別設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增后并測序分析線粒體tRNA基因突變情況。結(jié)果在對照樣本中未檢測到線粒體tRNA變異位點，在1例患者中檢測到了tRNAVal基因G1664A變異，Mitomap已有報道為多態(tài)性位點；于另1例患者中檢測到tRNAMetT4454C變異，有文章報道該位點與線粒體功能障礙有關(guān)，Mitomap報道為多態(tài)性位點。本研究中2例病例中未檢測到線粒體tRNA致病性突變位點，可能與病例個體的心衰程度有關(guān)，有必要擴(kuò)大樣本量深入研究線粒體tRNA以及mtDNA其他基因突變與原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病之間的關(guān)系，以尋找可能的致病突變位點、易感的多態(tài)性位點或者單倍體群，為認(rèn)識原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

關(guān)鍵詞：擴(kuò)張型心肌病；線粒體tRNA基因

0背景

原發(fā)性心肌病從形態(tài)和功能上分為肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、限制性心肌病、致心律失常型右心室心肌病和無類別心肌病5種類型[1]。擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以心腔(左和/或右心室)擴(kuò)大、心肌纖維化為主要特征的心肌疾病，其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性心力衰竭(心衰)、心律失常、血栓栓塞，甚至猝死。擴(kuò)張型心肌病發(fā)病達(dá)到晚期時，除心臟移植外，沒有徹底的治療方法，該病死亡率較高，5年病死率15%-50%[2]，是心肌衰竭的第三大常見原因[3, 4]，亦是導(dǎo)致兒童及青少年死亡的主要原因。而DCM病因與多種因素有關(guān)，如基因突變[5, 6]、病毒感染[7]和自身免疫[8]，其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，鑒于上述，加強(qiáng)對擴(kuò)張型心肌病的研究，深入了解其發(fā)病機(jī)制有其必要性和緊迫性。

線粒體是哺乳動物細(xì)胞中唯一含有自身遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，是真核生物細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換體系和供能中心。它含有一個獨立的半自主復(fù)制的DNA，稱為線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)。人mtDNA為一16 569 bp的雙鏈閉合環(huán)狀分子，編碼13種呼吸鏈酶復(fù)合物的亞單位、22種tRNA和2種rRNA。線粒體tRNA基因長度僅占整個mtDNA的1/10，但這里集中著50%以上與線粒體疾病相關(guān)的突變位點[9,10]。線粒體tRNA與編碼氨基酸之比基本是1:1，若某種線粒體tRNA基因發(fā)生突變影響其結(jié)構(gòu)功能，而其他tRNA又不能進(jìn)行補(bǔ)償，則突變的線粒體tRNA可導(dǎo)致線粒體DNA編碼的氧化磷酸化功能相關(guān)蛋白翻譯過程的眾多缺陷[11]，因此，線粒體tRNA基因突變更容易導(dǎo)致氧化磷酸化功能缺陷，引起疾病的發(fā)生，這也可能是線粒體tRNA基因成為疾病相關(guān)的突變熱點區(qū)的原因之一。

細(xì)胞通過氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP占細(xì)胞生命活動所需能量的90%以上，由于心臟對氧化代謝的強(qiáng)大依賴，使得線粒體的結(jié)構(gòu)功能改變在心臟受損中十分重要，因此，探究是否存在線粒體基因致病性改變對心肌病有著重要的研究意義。本研究擬從線粒體DNA角度出發(fā)，尋找本實驗中的DCM病例是否存在已知以及未知的線粒體tRNA致病性突變，以建立實驗室快速篩查線粒體tRNA基因突變的方法，以探討該DCM病例可能的病因，也為深入了解DCM發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)和提供依據(jù)，為DCM的診斷與預(yù)防開辟新的途徑。

1材料方法

1.1病例資料

于南華大學(xué)協(xié)作醫(yī)院郴州一醫(yī)院病理科收集2例因原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病而行移植術(shù)患者的心臟和10例尸檢心臟心肌組織石蠟標(biāo)本。患者A：女，21歲，因“活動后心悸氣促8個月”入院，臨床相關(guān)檢查：X線檢查心臟擴(kuò)大呈普大型，中度，心尖圓鈍，心后緣圓隆，左房壓跡增深，心前間隙明顯變窄，肺動脈段稍突出。心臟彩超：左室右房增大，考慮擴(kuò)張型心肌病。病理巨檢：心臟標(biāo)本大小為13 cm×11.7 cm×5 cm，360 g，心瓣膜及乳頭肌未見贅生物。三尖瓣瓣環(huán)周徑為10.8 cm，二尖瓣瓣環(huán)周徑為10.0 cm，右室壁厚0.3 cm，左室壁厚0.8 cm，室間隔厚1.4 cm。雙側(cè)心室腔均明顯擴(kuò)大，右室心下緣至三尖瓣9.5 cm，右室腔橫徑最寬處為5.5 cm，左室心尖至二尖瓣9.5 cm，最寬處5.0 cm。心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)為擴(kuò)張型心肌病。

圖1　 HE染色顯示心肌組織(分別×200、×400觀察) 可見心肌細(xì)胞明顯肥大與萎縮，心肌間質(zhì)間可見小灶纖維化Fig.1　The HE staining showed the myocardial tissue (×200, ×400 vision, respectively) with myocyte hypertrophy and atrophy, and cystic fibrosis between myocardial interstitial cells

患者B：女，36歲，因“活動后心悸氣促6年”入院查體，心臟彩超顯示：右房右室心腔擴(kuò)張，右室壁較薄，活動明顯減弱，上游離壁明顯，附游離壁可見范圍7 mm×3 mm×2 mm移動回聲光團(tuán)，右室腔內(nèi)還可見起搏器中極強(qiáng)回聲帶。室間隔連續(xù)，其基底段呈同向運(yùn)動，活動度較增強(qiáng)，房間隔連續(xù)。左房室不大，室壁不厚，活動減弱。各瓣膜結(jié)構(gòu)不清，瓣葉細(xì)，三尖瓣關(guān)閉見裂，余各瓣膜開閉可。升主動脈不寬，肺動脈增寬，心包腔未見明顯積液。彩色多普勒血流成像顯示：心內(nèi)血彩較暗淡，TV-RA偶見大量返流。返流速達(dá)右房中部，返流Vmax0.90 m/s。彩超意見：1、提示心肌病(右室型)；2、右心擴(kuò)大，疑右室內(nèi)血栓；3、三尖瓣返流；4、心功能測值SV、SI、CO、CI減低。CR胸位(床旁)成像顯示：心影明顯增大近似球形，主要表現(xiàn)向左增大，心左緣緊貼左胸腔側(cè)壁，心影占據(jù)左胸腔中下部，左膈面顯示不清，心胸比值約0.65，肺野及骨性胸廓未發(fā)現(xiàn)明顯異征，符合擴(kuò)張型心肌病。臨床心臟移植術(shù)中也可見：左心房、心室明顯擴(kuò)大，右心室內(nèi)可見陳舊性血栓，可見起搏導(dǎo)線附著于心肌內(nèi)。巨檢：心臟大小為16 cm×12 cm×5 cm，400 g，左心房明顯擴(kuò)張，肌壁變薄，肌壁厚0.1-0.4 cm，右心耳明顯擴(kuò)張。三尖瓣周徑15.5 cm，乳頭肌明顯增粗，肥大。右室壁厚0.1-0.3 cm，肺動脈瓣周徑7 cm，二尖瓣周徑6.5 cm，左心室擴(kuò)張，肌壁厚1.1-1.4 cm，主動脈瓣周徑6 cm，室間隔與房間隔無異常。組織病理學(xué)檢查：心肌細(xì)胞不均勻肥大，心肌間質(zhì)小灶狀纖維化，右心耳及右心室內(nèi)附壁血栓形成，左冠狀動脈內(nèi)膜增厚，管腔輕度狹窄，病變符合擴(kuò)張性心肌病。

圖2　 HE染色顯示心肌組織(分別×100、×200)可見心室內(nèi)附壁血栓形成，心肌細(xì)胞肥大與萎縮，心內(nèi)膜下心肌纖維明顯變性Fig.2　The HE staining showed the myocardial tissue (×100, ×200 vision, respectively) with ventricular thrombosis, myocyte hypertrophy and atrophy, and obvious degeneration in myocardium fibrocyte

1.2研究方法

1.2.1DNA提取

采用HiPure FFPE DNA Kit(Magen)從石蠟包埋組織切片中提取總基因組DNA(方法有改進(jìn))。用干凈刀片去除組織切片周圍多余的石蠟，轉(zhuǎn)移切片至1.5 mL離心管中，加入1 mL二甲苯劇烈渦旋20 sec，靜置15 min，14 000 g離心2 min，棄上清留沉淀。依次分別用100%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇、雙蒸水重懸沉淀10 sec，14 000 g離心，棄上清留沉淀。后續(xù)實驗操作同試劑盒法。

1.2.2PCR

應(yīng)用Primer5引物設(shè)計軟件分別針對22種線粒體tRNA基因設(shè)計一對引物。PCR反應(yīng)體系為：10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μL，5 U/μL Ex Taq Polymerase(TaKaRa)0.2 μL，10 μmol/L F/R引物各1 μL，DNA模板3 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。為提高擴(kuò)增效率和特異性，采用降落PCR：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 sec，62 ℃退火20 sec，72 ℃延伸30 sec，2個反應(yīng)；95 ℃變性15 sec，60 ℃退火20 sec，72 ℃延伸30 sec，2個反應(yīng)；95 ℃變性15 sec，58 ℃退火20 sec，72 ℃延伸30 sec，28個反應(yīng)后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確認(rèn)為特異單一條帶后，送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行直接測序，所有序列均行正反向測序以驗證，測序結(jié)果采用CodonCode Aligner4.0.4(http://www.codoncode.com/aligner/download.htm)序列軟件進(jìn)行分析，并與修正后的線粒體基因劍橋參考序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS，NC＿012920.1，http://www.mitomap.org)作比對，查找相應(yīng)tRNA基因突變情況以及擴(kuò)增的目的片段是否準(zhǔn)確，并進(jìn)一步核對測序峰圖確保無誤。

2結(jié)果

PCR產(chǎn)物測序結(jié)果比對分析顯示，在患者A的tRNAVal基因1664位點檢測到了G→A變異(如圖3所示)，而在患者B和10例對照樣本里均未檢測到這一位點變異，該變異位點在Mitomap上有報道，為多態(tài)性位點。

圖3　患者A中線粒體tRNAVal基因序列(1664G→A) 示患者A、患者B、對照樣本9號與mtDNA劍橋參考序列的比對分析結(jié)果Fig.3　The sequence of mitochondrial tRNAVal gene of No.A patient (G1664A variation) The results of alignment analysis from the sequence of patient A, patient B, control sample No.9 and mitochondrial reference sequence

在患者B的tRNAMet基因的4454位點檢測到了4454T→C變異(如圖4所示)，而在患者A和10例對照樣本里均未檢測到這一位點變異。

tRNA基因側(cè)翼序列分析結(jié)果顯示(如表1)10398A→G、12358A→G、12372G→A變異在患者和對照心肌組織中均有檢測到，10400C→T、14766C→T、14783T→C變異僅在對照樣本中檢測到，而未在患者石蠟組織中檢測到。其中A10398G、C10400T位點為線粒體DNA單倍體型N、M群分型的標(biāo)志性位點[12]，A12358G、G12372A、C14766T、T14783C均為線粒體DNA多態(tài)性位點，在Mitomap、PhyloTree等數(shù)據(jù)庫上均有報道。

表1DCM患者和對照樣本中tRNA基因和其側(cè)翼編碼序列分析

Tab.1The analysis of mitochondrial tRNA gene and flank coding sequence from DCM patients and controls

基因位點患者標(biāo)本對照是否報道tRNA基因G1664A(tRNAVal)A-是T4454C(tRNAMet)B-是tRNA基因側(cè)翼A10398G(ND3,T114A)A、B7、8是編碼序列C10400T(ND3,syn)-7是A12358G(ND5,)A8是G12372A(ND5,syn)A8是C14766T(CytB,I7T)-1、2、4、5、6、7、8、9、10是T14783C(CytB,syn)-1、2、3、4、5、7、9是

tRNAVal基因1664位點位于tRNAValACC端的接受莖上，tRNAMet4454位點位于tRNAMetT環(huán)上(如圖5所示)，17種靈長類動物在這兩個位點的保守性分析顯示，這兩個位點的保守性指數(shù)均低于50%，保守性低，可能該位點變異對tRNA二級結(jié)構(gòu)的正確折疊影響比較小。

圖5　線粒體tRNAVal和tRNAMet二級結(jié)構(gòu)圖 箭頭分別指示本實驗中篩查到的tRNAValG1664A和tRNAMetT4454C變異位點Fig.5　The secondary structure of mitochondrial tRNAVal and tRNAMet The arrow show that mitochondrial tRNAVal gene G1664A variation and tRNAMet gene T4454C variation screened in this study

3討論

本研究建立了針對22個線粒體tRNA基因快速篩查的方法，此方法針對性強(qiáng)，比較適合于非新鮮長久保存的樣本。目前病理科室制備石蠟組織切片多為福爾馬林固定，受到固定時間、溫度以及組織處理過程的影響，從石蠟塊中提取的DNA，長度大部分在100-1 000 bp之間，而貯存10年以上的標(biāo)本會存在明顯的降解[13]。本實驗取到的標(biāo)本為石蠟組織切片，實驗過程中亦發(fā)現(xiàn)有明顯的降解而影響長片段的擴(kuò)增，因此本實驗針對22個tRNA設(shè)計引物進(jìn)行篩查，為研究線粒體tRNA基因與疾病的關(guān)系奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

本實驗中篩查得到的tRNAMetT4454C變異位點，Mitomap報道為多態(tài)性位點，有文章報道該位點變異與線粒體功能障礙有關(guān)，與高血壓相關(guān)，但這一結(jié)論尚存在爭議。Zhu等[14]研究報道從270例原發(fā)性高血壓中國人群中檢測到了T4454C變異，功能分析顯示該變異位點可能導(dǎo)致tRNA3'末端代謝缺陷或者呼吸鏈重要亞基的損害，并且發(fā)現(xiàn)攜帶此變異位點的永生化淋巴細(xì)胞的氧耗速率明顯低于對照細(xì)胞(P=0.0010)，預(yù)示該變異位點可能與中國人群原發(fā)性高血壓有關(guān)。而Wang等[15]針對該報道進(jìn)行了修正，認(rèn)為Zhu等發(fā)表的攜帶T4454C變異位點的病例線粒體全序列數(shù)據(jù)不夠充分，不能夠劃分其單倍體型，可能與所報道的中國人群不一致，且利用MFOLD系統(tǒng)分析了tRNAMet二級結(jié)構(gòu)，4454T和4454C位點的自由能非常接近，均比較低，說明該位點變異后tRNAMet二級結(jié)構(gòu)亦比較穩(wěn)定，質(zhì)疑T4454C變異與中國人群原發(fā)性高血壓之間的相關(guān)性。因此，有關(guān)該位點變異與線粒體功能或疾病之間的關(guān)聯(lián)尚需深入研究以闡明。

本研究對2例DCM病例和10例對照樣本進(jìn)行了篩查，未檢測到新的線粒體tRNA致病性突變位點，這可能與病例個體的心衰程度有關(guān)。Marin-Garcia等[16]在28個散發(fā)的嚴(yán)重DCM患者中發(fā)現(xiàn)了線粒體tRNA突變，并導(dǎo)致了氨基酸結(jié)構(gòu)或是核苷酸的變化。Cardena等[17]在一個重度心衰的DCM患者中發(fā)現(xiàn)mtDNA16018-16032位點之間存在15bp的核苷酸序列重復(fù)，其中部分區(qū)域在編碼脯氨酸t(yī)RNA的基因(tRNAPro)上，這一位置對保護(hù)細(xì)胞對抗氧化起著重要的作用。這種重復(fù)可能改變tRNAPro的穩(wěn)定性或二級結(jié)構(gòu)，影響線粒體蛋白質(zhì)的合成。Wahbi等[18]發(fā)現(xiàn)，純擴(kuò)張型表型常見于患者mtDNA8344A>G，約20%的這類患者存在左心室功能障礙。Stalder等[19]發(fā)現(xiàn)存在A3243G突變的患者具有嚴(yán)重的心衰癥狀、顯著低EF值，并伴有聽力下降、代謝紊亂等特點。還有很多臨床案例都顯示了在DCM患者中，尤其是在嚴(yán)重型或者其他類型心肌病患者中，都能檢測mtDNA突變，又以各型tRNA異質(zhì)性突變?yōu)橹?，他們均不同程度地改變了氨基酸、核苷酸或tRNA的結(jié)構(gòu)而致病。以上已報道病例的共同特點是心衰比較嚴(yán)重，而本研究樣本量小，由于涉及到倫理學(xué)問題，心肌病患者心肌組織樣本很難取材，本實驗取到的是十年前進(jìn)行心臟移植術(shù)后的石蠟樣本，2例患者術(shù)后尚正常，本實驗中未篩查到tRNA致病性突變位點，可能與患者個體心肌衰竭相關(guān)臨床指征的嚴(yán)重程度有關(guān)。

本研究從病例中篩查得到的tRNAVal基因G1664A和tRNAMetT4454C變異位點，MITOMAP已有報道這兩個位點均為多態(tài)性位點，而本實驗在線粒體tRNA基因側(cè)翼序列檢測到的其他變異位點亦為多態(tài)性位點，由于受到樣本量小的局限性，無法對病例進(jìn)行大樣本量研究和利用多態(tài)性位點進(jìn)行單倍體群劃分，因此，我們?nèi)孕钄U(kuò)大樣本量，深入研究線粒體tRNA以及mtDNA其他基因突變與原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病之間的關(guān)系，以尋找可能的致病突變位點、易感的多態(tài)性位點或者單倍體群，為認(rèn)識原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

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Mutation Analysis of Mitochondrial tRNA Gene in Patients with Primary Dilated Cardiomyopathy

LIHongchao1,SHUHongying2,LIXiaojie3,NIBin2,XIEHailong2,ZHOUHaiyan2,NIYa1*

(1.School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, Zhejiang, China;2.Key Laboratory of Genetics and Birth Health of Hunan Province, Family Planning Institute of Hunan Province,Changsha 410126, Hunan, China; 3.Department of Pathology, the First Hospital of Chenzhou City,Chenzhou 423000, Hunan, China)

Abstract：To identify the potential pathogenic mutations of mitochondrial tRNA in patients with primary dilated cardiomyopathy(DCM)and the possible association of the mutations with DCM. Paraffin-embedded myocardial tissues from two patients with DCM and 10 healthy controls,which were discarded after forensic examination, were used for the study. PCR amplification wasperformed for the mitochondrial tRNA genes and direct sequencing was conducted. Sequencing results showed no variation for mitochondrial tRNA genes in the normal myocardial tissues. The tRNAValG1664A variation and tRNAMetT4454C variation were identified in patients with DCM. These two variations were previously reported as polymorphism in MitoMap. There was no pathogenic mutation detected in mitochondrial tRNA genes of the two patients with DCM. A patient pool of large sample size is expected for analysis of the pathogenic mutations, polymorphism loci and haplogroup that might be associated with DCM.

Key words：dilated cardiomyopathy; mitochondrial tRNA gene

文章編號：1007-7146(2015)06-0539-06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號：R715.5

*通訊作者：倪崖，碩士，研究員，主要從事精子細(xì)胞功能及其信號傳導(dǎo)的研究。(電話) 0571-88215505；(電子郵箱)niya99@126.com

作者簡介：李紅超(1982-)，男，河南南陽人，碩士研究生，臨床檢驗診斷專業(yè)。(電話)0731-89762261)；(電子郵箱)hongchao800@126.com

基金項目：湖南省科技廳科技計劃一般項目(2013SK3295)

收稿日期：2015-11-02;修回日期:2015-11-15

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.009