復合因素建立亞健康小鼠模型

郝文麗，陳志寶，趙　蕊，薄　樂，張騰龍

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院， 黑龍江 大慶 163319)

復合因素建立亞健康小鼠模型

郝文麗，陳志寶，趙蕊*，薄樂，張騰龍

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院， 黑龍江 大慶 163319)

摘要：目的:復合因素建立與臨床癥狀相似的亞健康小鼠模型。方法:采用強迫游泳、睡眠剝奪、裝管束縛、夾鼠尾應激建立亞健康小鼠模型，通過小鼠外觀、行為學數據及病理檢測鑒定模型是否成功。結果:造模結束后，模型組小鼠外觀、體重、自主活動量、避暗次數、絕望時間、力竭游泳時間與對照組小鼠相比差異顯著(P<0.05)，病理結果顯示模型組小鼠未見異常。結論:復合因素成功建立亞健康小鼠模型。

關鍵詞：復合因素; 亞健康模型; 小鼠

隨著社會的發(fā)展，人們生活環(huán)境的改變以及社會競爭的日趨激烈，很多人日漸出現疲勞、失眠、虛弱、健忘、抑郁、易怒、易緊張等癥狀，且檢查機體未有患病癥狀，這種健康與疾病之間的狀態(tài)被稱為亞健康狀態(tài)(sub-health)，人們習慣將其稱為第三狀態(tài)或灰色狀態(tài)[1-3]。亞健康屬未病范疇且是未病之一，已成為危害人類健康的重大隱患之一，以疲勞、活力減退、免疫力降低、記憶力下降為主要的臨床表現。亞健康問題受到了國內外學者們的高度關注，然而卻未見統一的亞健康模型的建立標準。常見單一因素即應激刺激、強迫游泳、限制運動等建模方法，未能全面考慮亞健康多由于軀體、心理、社會競爭等共同因素作用而形成的。本實驗綜合考慮亞健康的主要成因及臨床表現，既往研究單一因素[4-8]及少數復合因素[9,10]建模的基礎上，加以改進，采用強迫游泳、睡眠剝奪、束縛、夾鼠尾應激來建立模型，通過小鼠的表觀現象、行為學數據以及肝臟、腎、胸腺、脾的病理觀察，來驗證是否成功建立亞健康模型。

1材料與方法

1.1實驗動物

SPF級健康昆明小鼠，雄性，4周齡，18-22 g，購于長春醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2主要儀器

S 多功能小鼠自主活動分析儀、避暗穿梭儀

1.3亞健康模型的建立

雄性昆明小鼠(50只)飼養(yǎng)適應一周后，隨機分2組，使得兩組鼠的體重平均值基本相同。對照組(10只)正常無菌飼養(yǎng)，建模組(40只)用于建立亞健康模型。所有小鼠飼養(yǎng)用品及實驗用品都定期進行滅菌消毒。

1.3.1游泳建模

制作直徑為100 cm的游泳池，水深30 cm，水溫25 ℃左右，溫度過高小鼠易暈厥，溫度過冷，小鼠易抽筋溺水。每天8∶00將小鼠放入水中，強迫游泳50 min，14∶00強迫游泳50 min，其余時間睡眠剝奪，直至每天20∶00結束。游泳過程中動物如體力不支沉入水中，及時撈出，防止溺死。

1.3.2睡眠剝奪建模

在游泳池中放置l個直徑為55 cm、高31 cm的圓圈鐵絲網平臺(平臺面距水面約1. 0 cm)，供小鼠休息，若其睡眠，則由于肌肉張力松弛而落入水中。

1.3.3束縛建模

第三周開始裝管束縛(50 mL離心管穿孔)，保持空氣通暢，小鼠禁食不禁水。每天22∶00裝管，次日6∶00放出，共7 d。

1.3.4應激建模

第四周開始每天20∶00將動物從平臺上取下，吹干處理后放入飼養(yǎng)籠中自由進食飲水，防止動物因受潮受涼而患病。用尖端纏有紗布的止血鉗夾小鼠尾部，夾尾已不破皮不流血不斷尾為度，建模過程中保證每只鼠夾尾次數一致，隨機更換小鼠夾尾。每次刺激1 h。22∶00時去除止血鉗，全天造模結束。

建模28 d結束后觀察小鼠精神狀態(tài)、皮毛、排便；稱量建模28 d后對照組小鼠和模型組小鼠的體重，分析體重的整體差異。用多功能小鼠自主活動儀記錄小鼠5 min內活動次數來評價小鼠自主活動的能力；避暗穿梭測試儀記錄小鼠5 min內避暗穿梭次數來評價小鼠的記憶能力；有機玻璃穿孔使鼠尾懸掛小鼠掙扎，記錄5 min內小鼠因絕望而累計不動的時間，評價絕望程度。水溫20 ℃，小鼠尾系其體重百分之十的鐵塊進行力竭游泳時間記錄，已鼻尖沉入水下10 s為停止記錄時間，評價小鼠疲勞程度。

1.4 He染色

將小鼠頸椎脫臼處死，立即解剖進行大體檢查，取小鼠肝、腎、胸腺、脾，摘除好各器官周圍組織，全部標本經10%福爾馬林固定，低溫修剪組織，在80 %、90 %、95 %、100 %各種濃度乙醇2 h進行脫水處理，浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片機切成厚度約5 μm的組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，干燥，制成HE染色切片，光學顯微鏡下觀察，照相。

1.5統計學分析

2結果

2.1亞健康模型一般狀況

表觀上模型組煩躁、易怒、撕咬、皮毛欠光澤、排便??；對照組行為表現無異常。建模結束后，將建模鼠40只，剔除病鼠，剩余鼠中隨機抽取30只做亞健康建模評價的數據統計。

分組n體重(g)自主活動次數5min(x)避暗穿梭次數5min(x)5min內累計不動(s)力竭時間(s)對照組1027.41±1.27213.30±31.41.7±1.5161.00±56.96650.60±198.74模型組1021.20±2.53**111.40±30.2*8.8±2.52**178.40±88.34**254.20±144.28**

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

從表1看出28 d建模后，模型組小鼠體重低于對照組，即復合因素造模影響動物的生長發(fā)育和新陳代謝，與亞健康者體重下降表現相似；模型組小鼠5 min內自主活動量小于對照組，且表現出精神倦怠，疲勞；模型組小鼠5 min內避暗穿梭次數高于對照組，即記憶力明顯低于對照組小鼠，符合亞健康狀態(tài)記憶力降低的情況；絕望測試結果顯示模型組小鼠5 min內呈現間歇性掙扎，掙扎時間明顯小于對照組；力竭游泳時間測試結果顯示模型組小鼠先沉于水下，體力明顯不如對照組小鼠。以上結果均符合亞健康基本特性。

2.2病理學分析

圖1　肝臟、腎、胸腺、脾HE染色(HE×20x)Fig.1　Mice liver、kidney、thymus、spleen HE staining(HE×20x)注：A為空白對照組，B為亞健康組。

肝、腎、胸腺和脾臟的病理結果顯示，復合因素建立的亞健康模型未對小鼠各臟器造成器質性病變。

3討論

疲勞、活力減退、記憶力降低等為亞健康的主要臨床表現，多由于軀體壓力、社會壓力、心理壓力等多方面因素共同刺激形成[11]，嚴重威脅人類的生活。本實驗采用強迫游泳、睡眠剝奪、束縛、夾鼠尾應激復合因素制造的亞健康小鼠模型，通過對其體重變化、自主活動量、避暗穿梭次數、鼠尾懸掛5 min內累計不動時間、負重游泳力竭時間的統計驗證以及肝、腎、胸腺、脾臟病理檢查驗證亞健康模型是否建立成功。

食欲不振、腹瀉、消瘦是亞健康癥狀表現之一，從體重的變化來看，模型組小鼠28天建模后體重明顯低于對照組(P<0.05)。而慢性疲勞、記憶力降低、精神倦怠是亞健康狀態(tài)最典型的表現，從自主活動分析儀分析的數據顯示亞健康組小鼠被干預生物鐘無規(guī)律后，精神倦怠，不愛走動，明顯不如正常組活動量大(P<0.01)；避暗穿梭儀分析小鼠避暗穿梭的次數結果顯示，實驗組小鼠被電擊次數多，即實驗組小鼠避暗次數明顯低于對照組(P<0.05)，符合記憶力減退這一現象；通過鼠尾懸掛，記錄5 min內計小鼠累不掙扎時間，即絕望時間的統計，實驗組小鼠時間多于正常組小鼠(P<0.05)，符合心理上的亞健康；從力竭游泳時間上來看，模型組小鼠先沉于水下，易疲勞，體力明顯不如對照組小鼠(P<0.05)。亞健康狀態(tài)是介于健康與疾病的邊緣狀態(tài)，是機體在無器質性病變情況下發(fā)生的一些功能性的改變。所以本實驗為排除小鼠主要器官并未發(fā)生病變，將代謝器官肝、腎，免疫器官胸腺、脾，進行HE染色觀察，結果顯示無器質病變。

以往單一因素建模如強迫游泳、跑臺法，僅僅考慮亞健康中軀體疲勞這一現象，且跑臺容易造成尾部或足部挫傷、出血而引起繼發(fā)感染等癥。本建模方法從心理和軀體共同刺激建模，模擬社會競爭激烈，應激刺激，精神壓力過大以及過度疲勞、缺乏睡眠等綜合成因建立亞健康模型，把握亞健康處于健康與疾病這一邊緣狀態(tài)，時刻防止亞健康小鼠往病態(tài)小鼠這一狀態(tài)轉化。通過表觀觀察以及行為學儀器多功能自主活動分析儀、避暗穿梭測試儀更準確的測定各組小鼠的差異。在建模期間，注意小鼠的飲食飼養(yǎng)環(huán)境，按時進行消毒，合理設計時間，即從亞健康的成因及癥狀綜合考慮亞健康成因，又不違反《實驗動物保護法》。

綜上所述，小鼠處于未病與病態(tài)的中間狀態(tài)。即采用復合因素建立的亞健康模型，小鼠的各項指標符合亞健康的特征。說明該造模方法具有一定合理性，為亞健康模型的進一步探究和改善亞健康的臨床藥物篩選墊定基礎。

參考文獻

[1]YAN Y X, LIU Y Q,etal.Development and evaluation of a questionnaire for measuring suboptimal health status in urban Chinese[J].Epidemiol, 2009, 19(6)：333-341.

[2]TIMOTHY R POWELL, CATHY FERNANDES,etal.Depression-Related Behavioral Tests[J].Current Protocols in Mouse Biology 2, 2012：19-127.

[3]劉艷艷, 程靜茹, 余克強.疲勞型亞健康小鼠模型的研制[J].廣東醫(yī)學, 2012, 33(1)：22-24.

LIU Yanyan, CHENG Jingru, YU Keqiang.Development of a mouse model of fatigue-type sub-health[J].Guangdong Medical, 2012, 33(1)：22-24.

[4]雷龍鳴, 邱石源, 鄔桂芬.亞健康實驗動物模型的文獻研究[J].湖南中醫(yī)雜志, 2013, 29(9)：160-162.

LEI Longming, QIU Shiyuan, WU Guifen.Sub-health literature experimental animal models[J].Hunan Traditional Chinese Medicine, 2013, 29(9)：160-162.

[5]吳鶴鳴, 李靜, 郭國禎, 等.慢性應激抑郁大鼠學習記憶及海馬非對稱性超微結構的改變[J].現代生物醫(yī)學進展,, 2007(1)：9-12.

WU Heming, LI Jin, GUO Guozhen,etal.Chronic stress rats learning and memory and hippocampal asymmetry ultrastructure[J]. Progress in Modern Biomedicine, 2007(1)：9-12.

[6]艾秀峰, 冷曉霞, 陳民利, 等.束縛應激致亞健康狀態(tài)大鼠的免疫功能改變與中藥干預的影響[J].實驗動物與比較醫(yī)學, 2010(2)：117-119.

AI Xiufeng, LENG Xiaoxia, CHEN Limin,etal.The impact of sub-health state of restraint stress in rats induced changes in immune function and medicine intervention[J].Laboratory Animal and Comparative Medicine, 2010(2)：117-119.

[7]黃建華.疲勞型亞健康小鼠模型的創(chuàng)建及維康顆粒對其血清皮質酮的影響[D].南方醫(yī)科大學, 2010.

HUANG Janghua.Creating and viacom particles affect fatigue-type sub-health mouse model of its serum corticosterone[D].Southern Medical University, 2010.

[8]馬作峰, 姜瑞雪, 張六通, 等.復合刺激對亞健康大鼠模型耐疲勞能力及血清SOD、MDA的影響[J].云南中醫(yī)中藥雜志, 2011, 32(8)：54-56.

MA Zuofeng, JIANG Ruixue, ZHANG liutong,etal.Composite stimulate resistance to fatigue and serum SOD、MDA impact on Sub rats[J]. Yunnan Chinese Medicine

Journal, 2011, 32(8)：54-56.

[9]武淑娟, 張青川, 何采輝, 等.電針對復合應激致慢性疲勞大鼠下丘腦組織中單胺類神經遞質含量的影響[J].針刺研究, 2006, 31 (2)：96-99.

WU Shujuan, ZHANG Qingchuan, HE Caihui,etal.Electric for multiple stress induced chronic fatigue rat hypothalamus tissue monoamine neurotransmitter content[J]. Acupuncture, 2006, 31 (2)：96-99.

[10]李丹, 李明今.亞健康狀態(tài)研究進展[J].中國民康醫(yī)學, 2011, 23(23).

LI Dan, LI Minjin.Progress in sub-health state[J].Chinese Public Health Medicine, 2011, 23(23).

Composite Factors of Establishing the Subhealthy Mice Model

HAOWenli，CHENZhibao，ZHAORui*，BOLe，ZHANGTenglong

(College of Life Sciences，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China)

Abstract：Objective: The purpose of this research is to employ Compound factors to construct mice sub-health model which has analogical clinical symptoms to mankind. Methods: Employed force-swimming, sleep deprivation, restraint stress, tail clipping to construct mice sub-health model and assess the effect through the appearance, behavior experiment and pathological examination. Result: The model group has significant difference compared with the control group in aspect of appearance, weight, autonomic activities, step-through test, tail suspension, force-swimming test(P<0.05). But athology examination shows no significant lesion to the model group. Conclusion: The method of compound factors can establish mice sub-health model.

Key words：compound factors; sub-health model；mice

文章編號：1007-7146(2015)06-0580-04

文獻標志碼：A

中圖分類號：R-332

*通訊作者：趙蕊，碩士生導師，副教授，研究方向是中草藥活性成分機制的研究。(電子郵箱)zhaoruier@sina.com

作者簡介：郝文麗(1989-)，女，漢， 黑龍江大慶，在讀碩士研究生，研究方向是中草藥防治疾病的研究。(電話)18645986033;(電子郵箱)598322851@qq.com；

基金項目：中國博士后科學基金2014M551281

收稿日期：2014-12-30;修回日期:2015-06-12

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.015