重金屬鎘對斜生柵藻光合作用的影響*

段晨雪 張寶玉 伍松翠, 馮建華 王廣策①

(1. 天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300457; 2. 中國科學(xué)院海洋研究所 青島 266071;3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

隨著采礦、冶煉電鍍、化工等工業(yè)的發(fā)展, 鎘(Cd)污染問題日益嚴(yán)重(王建龍等, 2010)。鎘是毒性最強(qiáng)的重金屬之一, 一旦進(jìn)入環(huán)境后, 不僅不能被生物所降解, 且往往參與食物鏈的循環(huán)并在生物體內(nèi)積累,破壞生物體正常生理代謝, 最終危害人體健康(Mountouris et al, 2002; 鄒森林, 2010)。現(xiàn)階段處理含重金屬污水的方法一般是化學(xué)方法、絮凝、沉淀法等。這對于去除重金屬比較方便, 但其回收費用高而效果不明顯(孟春曉等, 2009)。研究表明利用微藻吸附重金屬有以下諸多優(yōu)點: 應(yīng)用范圍廣, 不容易產(chǎn)生二次污染; 吸附容量大, 去除效率高; 原料來源廣,容易人工培養(yǎng); 成本低; 吸附的金屬容易重新獲取,有利于微藻的重復(fù)利用和重金屬的回收(潘進(jìn)芬等,2000; 李琛, 2011; 張陽等, 2012)。

斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)是一種單細(xì)胞真核綠藻, 生境分布廣泛。該藻因其能積累大量中性脂而作為生產(chǎn)生物柴油的理想原料之一(Gouveia et al,2009)。斜生柵藻通常由4個細(xì)胞組成定形群體, Salim等(2011)的研究表明斜生柵藻的細(xì)胞可以自絮凝, 因此, 這對微藻的采收工作非常有利, 有效降低了采收成本。

目前, 關(guān)于利用斜生柵藻吸附重金屬已展開較多的研究, 研究內(nèi)容主要集中在重金屬吸附動力學(xué)和對微藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長的影響(劉益浩, 2007), 而重金屬對微藻光合作用影響的相關(guān)報道還相對少見(Zeng et al, 2012; Ouyang et al, 2013)。因此, 本實驗采用Dual-PAM-100雙通道熒光儀, 研究了不同Cd2+濃度 處 理對 斜 生柵 藻 光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和 光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的影響, 以及微藻吸附重金屬后的恢復(fù)能力。實驗結(jié)果可作為斜生柵藻耐鎘機(jī)理研究的必要補(bǔ)充, 從而為斜生柵藻吸附重金屬的生態(tài)修復(fù)工作提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種

斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)由中國科學(xué)院海洋研究所實驗海洋生物學(xué)重點實驗室王廣策課題組提供。用BG-11培養(yǎng)基(Rippka et al, 1979)單藻種靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度(28±2)°C, 光強(qiáng)為 100μmol/(m2·s),光暗比為12h∶12h。

1.2 葉綠素a濃度測定

每天取藻液, 用80%的丙酮抽提, 通過分光光度計(Shimadzu UV-1800, Japan)測定663nm和645nm處的光密度值, 即OD663和OD645, 通過公式計算葉綠素a濃度(Arnon, 1949):

1.3 重金屬脅迫及恢復(fù)處理

實驗在 500mL錐形瓶里進(jìn)行, 在 BG-11培養(yǎng)液中加入CdCl2, 使Cd2+終濃度分別為0、1、10、50、100、150μmol/L。將培養(yǎng)到指數(shù)生長期的斜生柵藻,分別接種到上述含不同濃度Cd2+的BG-11培養(yǎng)基中,接種密度為3×106cell/mL。每個濃度設(shè)置三個平行。

恢復(fù)處理時, 將經(jīng)過重金屬處理的斜生柵藻靜置 1—2h, 待藻細(xì)胞自然沉降到錐形瓶底部后, 將上面的培養(yǎng)液緩慢倒出一半, 并加入等量無 Cd2+的標(biāo)準(zhǔn)BG-11培養(yǎng)基, 放回光照培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。此時重金屬含量比之前降低了一半, 恢復(fù)處理時每天重復(fù)這樣的步驟, 3天后藻液中的重金屬含量僅為最初的1/8。

1.4 半抑制濃度(IC50–96h)的測定

按照等對數(shù)間距設(shè)置 Cd2+濃度為 0、50、75、112.5、169、253μmol/L, 藻細(xì)胞密度通過測定650nm吸光度的變化來反映。半抑制濃度(IC50-96h)利用機(jī)率單位法(周永欣等, 1989)計算得出。

1.5 光合活性測定

使用雙通道脈沖振幅調(diào)制熒光儀(Dual-PAM-100), 同時測定P700(PSⅠ)和葉綠素?zé)晒狻?/p>

每天取藻液, 通過離心(Eppendorf 5804R, 5000g,5min)濃縮成葉綠素a濃度=60mg/L, 放入配套的石英測定杯中進(jìn)行測定。測定前暗適應(yīng) 15min, 并在暗適應(yīng)期間通過小轉(zhuǎn)子進(jìn)行混勻。

當(dāng)測定開始時, 關(guān)閉轉(zhuǎn)子。設(shè)定測量參數(shù)后(保存測量參數(shù)模板, 以備下次使用), 同步測定其P700(PSⅠ)和葉綠素?zé)晒?PSⅡ)的誘導(dǎo)曲線。按照Maxwell等(2000)介紹的原理和方法, 分別對藻體PSⅡ的最大光合量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、實際光合量子產(chǎn)量Y(Ⅱ); PSⅠ反應(yīng)中心的光合活性采用Schreiber介紹的方法(Klughammer et al, 1994)在遠(yuǎn)紅光存在的條件下對藻體施以飽和脈沖進(jìn)行測定光化學(xué)量子產(chǎn)量Y(Ⅰ)。

1.6 培養(yǎng)液中重金屬含量測定

在實驗的第1, 3, 5天分別取5mL藻液, 反復(fù)離心幾次確保得到無藻細(xì)胞的培養(yǎng)液。將樣品送至中國科學(xué)院海洋研究所分析測試中心, 通過原子吸收分光光度法(國家標(biāo)準(zhǔn)GB7475-87)測定Cd2+濃度。

圖1 96h不同Cd2+濃度下斜生柵藻的細(xì)胞密度Fig.1 The change of OD650 in S. obliquus under different Cd2+concentrations in 96h treatment

圖2 不同Cd2+濃度下斜生柵藻的葉綠素a含量Fig.2 The change of chl a in S. obliquus under different Cd2+concentrations

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析, 統(tǒng)計圖用Microsoft Excel軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同Cd2+ 濃度對斜生柵藻生長以及光合作用的影響

圖1為96h時, 不同濃度Cd2+下由OD650表示的細(xì)胞密度值?？梢钥闯鲭S Cd2+濃度的升高, OD650值緩慢下降, 當(dāng)濃度大于 112.5μmol/L時, 與對照組有顯著差異(P＜0.05)。根據(jù)機(jī)率單位法, 計算每個 Cd2+濃度下的斜生柵藻生長抑制率, 轉(zhuǎn)換為機(jī)率單位, 在建立機(jī)率單位(y)與濃度對數(shù)(x)的關(guān)系方程, y=2.0474x+0.7502 (R2=0.9892), 從曲線中得出 IC50=119.04μmol/L。

圖 2表明了不同 Cd2+濃度對斜生柵藻葉綠素 a含量的影響。接種初期, 低濃度1、10μmol/L兩組的葉綠素a比對照組略高, 而從第3天開始降至低于對照組的水平, 但與對照組沒有顯著差異。而高濃度50、100、150μmol/L組則一直呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,第3天開始這三組的葉綠素a含量與對照組有極顯著的差異(P＜0.01)。高濃度的Cd2+能夠明顯抑制斜生柵藻葉綠素a的合成, 而低濃度的影響不顯著。

從圖3可以看出, Cd2+對于斜生柵藻PSⅠ的實際光合量子產(chǎn)量 Y(Ⅰ)影響并不十分明顯, 直至第五天,50、100、150μmol/L組與對照組有顯著的差異(P＜0.05)。對于 PSⅠ來說, Cd2+濃度低于 150μmol/L對PSⅠ的實際光合量子產(chǎn)量影響不大。

圖3 不同Cd2+濃度下斜生柵藻光系統(tǒng)Ⅰ的光化學(xué)量子產(chǎn)量Y(Ⅰ)Fig. 3 The change of the effective quantum yield of PSⅠ [Y(Ⅰ)]of S. obliquus under different Cd2+ concentrations

圖4 不同Cd2+濃度下斜生柵藻光系統(tǒng)Ⅱ的光化學(xué)量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)Fig.4 The change of effective quantum yield of PSⅡ [Y(Ⅱ)] in S. obliquus under different Cd2+ concentrations

Fv/Fm值代表了PSⅡ的最大光合量子產(chǎn)量, 正常培養(yǎng)狀態(tài)下的斜生柵藻Fv/Fm值一般在0.7左右。從圖5的數(shù)據(jù)中可以看到, Fv/Fm從加入Cd2+24h后就開始出現(xiàn)下降趨勢, 除 1μmol/L組外都有顯著差異(P＜0.01)。

與Fv/Fm的趨勢相似, 加入濃度大于1μmol/L的Cd2+時, Y(Ⅱ)的活性會在 24h 出現(xiàn)明顯降低(P＜0.01)。第5天時, 150μmol/L組的Y(Ⅱ)值降到了0.2, 僅為對照組的31.66%, PSⅡ的活性相當(dāng)?shù)汀?/p>

圖5 不同Cd2+濃度下斜生柵藻光系統(tǒng)Ⅱ的最大光合量子產(chǎn)量(Fv/Fm)Fig.5 The change in the maximum PSⅡ quantum yield (Fv/Fm)in S. obliquus under different Cd2+ concentrations

表1 斜生柵藻吸附過程中溶液的Cd2+濃度Tab.1 The concentration of dissolved Cd2+ during the adsorption of S. obliquus

表2 斜生柵藻對Cd2+的吸附率Tab.2 The Cd2+ absorption rate in S. obliquus +

2.2 重金屬吸附情況

加入Cd2+24h后, 溶液中的Cd2+濃度達(dá)到了最低值, 與剛加入重金屬時有極顯著差異(P＜0.01), 含量都低于0.4mg/L。第3天開始出現(xiàn)上升趨勢, 第5天時, 50、150μmol/L組的Cd2+濃度出現(xiàn)了顯著的上升(P＜0.05)。Cd2+濃度的回升, 可能是由于斜生柵藻的細(xì)胞受損而導(dǎo)致的重金屬解析。

表 2中可以看到, 斜生柵藻對 Cd2+的吸附率隨Cd2+濃度的升高從71.58%升至了97.83%。同時, 這5組濃度中, 吸附率最高時都在第1天, 之后都出現(xiàn)了一定的降低。只有50、150μmol/L組在第5天的吸附率出現(xiàn)了顯著降低(P＜0.05)。

2.3 恢復(fù)處理對斜生柵藻生長以及光合作用的影響

在3天恢復(fù)處理中, 對照組的葉綠素a含量明顯升高, 補(bǔ)充的新鮮培養(yǎng)基促進(jìn)了斜生柵藻的生長。恢復(fù)初期, 低濃度1、10μmol/L兩組的葉綠素a含量呈上升趨勢, 恢復(fù)至第 3天時兩組都出現(xiàn)了降低, 1μmol/L 組比對照組顯著降低(P＜0.05),10μmol/L組與對照組有極顯著差異(P＜0.01)。而高濃度組 50、100、150μmol/L則一直呈下降趨勢。說明重金屬Cd2+的加入會影響斜生柵藻葉綠素a的合成, 并且隨著Cd2+濃度升高葉綠素a的合成明顯受到抑制, 即使進(jìn)行恢復(fù)處理也不能緩解這種抑制情況。

圖6 恢復(fù)期間, 不同濃度Cd2+對斜生柵藻的葉綠素a含量Fig.6 The change of chl a in S. obliquus under different Cd2+concentrations during recovery stage

圖7 恢復(fù)期間不同Cd2+濃度下斜生柵藻光系統(tǒng)Ⅰ的光化學(xué)量子產(chǎn)量Y(Ⅰ)Fig.7 The change in the effective quantum yield of PSⅠ [Y(Ⅰ)]of S. obliquus under different Cd2+ concentrations during recovery stage

雖然在恢復(fù)初期, Y(Ⅰ)出現(xiàn)了一定的升高, 但到了第 3天, 高 Cd2+濃度組即 100、150μmol/L出現(xiàn)了顯著地降低(P＜0.05)。

圖8 恢復(fù)期間不同Cd2+濃度下斜生柵藻光系統(tǒng)Ⅱ的光化學(xué)量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)Fig.8 The change in the effective quantum yield of PSⅡ [Y(Ⅱ)]in S. obliquus under different Cd2+ concentrations during recovery stage

圖9 不同Cd2+濃度下斜生柵藻光系統(tǒng)Ⅱ的最大光合量子產(chǎn)量(Fv/Fm)Fig.9 The change of the maximum PSⅡ quantum yield (Fv/Fm)in S. obliquus under different Cd2+ concentrations during recovery stage

圖8中可以看到, 即使在恢復(fù)期中添加了新鮮培養(yǎng)基, 但Y(Ⅱ)的光合活性仍然在降低。

從 Fv/Fm的數(shù)據(jù)來看, 低濃度組依然保持著略低于對照組的水平, 其中 10μmol/L組在恢復(fù)的第一天出現(xiàn)了顯著的上升(P＜0.05), 但之后的第三天仍出現(xiàn)了明顯的下降(P＜0.05)。而 50μmol/L 和 100μmol/L 組與之類似, 同樣有著先小幅度升高, 而后顯著降低的趨勢。150μmol/L組則在恢復(fù)中一直處于下降趨勢。

Y(Ⅱ)的數(shù)據(jù)中我們可以看到, 100μmol/L和150μmol/L兩組分別于恢復(fù)的第 2、3天降到了幾乎為零, 說明此時的斜生柵藻 PSⅡ幾乎無活性, 無法進(jìn)行正常的光合作用。而低濃度組 1μmol/L和10μmol/L組雖然出現(xiàn)了一定程度的升高, 卻始終未能恢復(fù)到對照組的水平, 再次證明了重金屬 Cd2+脅迫的不可逆。

3 討論

綜合所有數(shù)據(jù), 我們發(fā)現(xiàn), 當(dāng)Cd2+濃度為10μmol/L時, 吸附率為75.09%, 而其他幾組濃度時吸附率均高達(dá)90%, Cd2+濃度為150μmol/L時吸附率最高, 為97.83%。也就是說, 斜生柵藻對重金屬Cd有較好的吸附率。Chen等(2012)利用通氣(2.5% CO2)培養(yǎng)斜生柵藻CNW-N, 得到其吸附CdCl2的最適條件為: pH 6.0、溫度30°C、Cd2+濃度為50mg/L, 最高吸附率為98.4%,與本文中的最高吸附率97.83%數(shù)據(jù)相近。

本文研究表明在低Cd2+濃度時, 由于斜生柵藻自身對重金屬的耐性機(jī)制, 使其對斜生柵藻的葉綠素含量以及光合作用影響不明顯。而高濃度Cd2+毒害作用則明顯表現(xiàn)在光合活性的快速降低。葉綠素是光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ), 其含量高低將直接影響光合作用的強(qiáng)弱及物質(zhì)合成速率的高低(李裕紅等, 2006)。葉綠素a既是天線色素也是參與光反應(yīng)的中心色素,因而其含量的高低對光合作用更為重要。本實驗的數(shù)據(jù)表明, 重金屬Cd2+對斜生柵藻葉綠素a的合成有抑制作用。Stobart等(1985)認(rèn)為, 葉綠素含量的降低與合成葉綠素所需的酶受重金屬破壞有關(guān), Cd抑制原葉綠素酸酯還原酶活性, 進(jìn)而影響了氨基-γ-酮戊二酸的合成, 從而導(dǎo)致了葉綠素含量的下降(李建宏等, 2004)。

圖4、5的數(shù)據(jù)表明, 當(dāng)加入Cd2+后, 斜生柵藻PSⅡ的Y(Ⅱ)和Fv/Fm值在24h后就有了顯著的下降趨勢, 說明重金屬Cd2+對柵藻PSⅡ的破壞作用是相當(dāng)快的, 并隨著時間的推移光合活性越低, 并且這種對PSⅡ的損傷既不能自愈, 也不能通過加入新鮮培養(yǎng)基緩解。Cd2+對PSⅡ的抑制作用在Mallick等(2003)和Miao等(2005)的研究中都有報道。Nirupama的研究發(fā)現(xiàn), 在Zn、Cr、Cd幾種重金屬脅迫下, 綠藻Scenedesmus的PSⅡ各項光合活性參數(shù)初始熒光產(chǎn)量F0、Fv/Fm、非光化學(xué)淬滅系數(shù)qN、光化學(xué)淬滅系數(shù)qP等都有著顯著的下降趨勢, 推測PSⅡ是重金屬脅迫的最初反應(yīng)位點。Sbihi等(2012)的研究發(fā)現(xiàn), Cd對硅藻P. Lanceolatum的IC50為0.25mg/L, 但當(dāng)Cd濃度大于等于0.1mg/L時葉綠素a含量和Fv/Fm值都出現(xiàn)了顯著的變化, 并且Zn和Cu的數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)了這種規(guī)律,所以Shibi認(rèn)為重金屬對微藻光合作用的影響要大于對藻細(xì)胞生長的影響。通過比較本文96h的OD650(圖1)與Cd2+處理4天的葉綠素a含量(圖2)、Fv/Fm值(圖5)兩組數(shù)據(jù), 也能得到類似的結(jié)果。

同時, 本文的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn), 相比于 PSⅡ的影響來說, Cd2+對斜生柵藻PSⅠ的破壞雖然也不可逆, 但程度比 PSⅡ較低。Husaini等(1991)認(rèn)為這是由于在應(yīng)對鎘脅迫時 PSⅡ比 PSⅠ的反應(yīng)更加敏感。而相反,Zhou等(2006)通過對銅綠微囊藻(M. Aeruginosa)的研究認(rèn)為, Cd2+的抑制作用位點并不是在 PSⅡ或者PSⅠ水平, 而是位于電子傳遞鏈的末端鐵氧還蛋白/NADP+還原酶(FNR)。對于重金屬離子在 PSⅡ的抑制部位和作用機(jī)理, 可以加入人工電子供體(如DPC、NH2OH 和 Mn)來研究。Bazzaz等(1974)用 Cd2+處理木豆pigeonpea(Cajanus cajan L., cv. UPAS-120)葉片的離體葉綠體, 加入PSⅡ氧化側(cè)電子供體DPC, Cd2+抑制的 PSⅡ活性恢復(fù)至對照水平, 推測 Cd2+作用于PSⅡ氧化側(cè)。重金屬離子可能和一些參與光合作用的酶結(jié)合, 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 Cd2+能與酶活性中心或蛋白質(zhì)的琉基結(jié)合, 而且還能取代重金屬蛋白中的必需元素(如 Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+等)而導(dǎo)致酶活性的下降或喪失, 抑制細(xì)胞的生理過程(羅立新等, 1998;Zhao et al, 2002)。

Cd2+對植物的毒害及植物的耐性機(jī)理十分復(fù)雜。到目前為止, 鎘污染對植物的生理生態(tài)效應(yīng)的研究中主要集中在一些高等植物上, 對微藻光合作用的影響、后期恢復(fù)能力及微藻的耐受機(jī)理研究相對較少。本文從光合作用方面探討了Cd2+對柵藻生長的影響, 從而為利用微藻處理含重金屬廢水的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

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