自噬相關蛋白LC3-Ⅱ在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義

于 婷，趙洪萍，周 穎，趙衛(wèi)東，劉培淑

自噬相關蛋白LC3-Ⅱ在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義

于 婷1，2，趙洪萍2，周 穎2，趙衛(wèi)東2，劉培淑1

摘要目的 本研究檢測微管輕鏈Ⅰ蛋白3-Ⅱ型（LC3-Ⅱ）在不同卵巢腫瘤組織中的表達情況，探討其與漿液性卵巢癌及粘液性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的相關性和意義。方法 選取204例上皮性卵巢腫瘤標本，其中，卵巢漿液性囊腺瘤46例，交界性漿液性腫瘤28例，漿液性囊腺癌40例，黏液性囊腺瘤32例，交界性黏液性囊腺瘤30例，黏液性囊腺癌28例，另選取正常卵巢上皮組織28例作為對照。使用SP法檢測正常卵巢上皮組織、上皮性卵巢腫瘤組織中LC3-Ⅱ的表達，并結合漿液性癌、黏液性癌臨床病理因素進行分析。結果 ①正常卵巢上皮中LC3-Ⅱ無表達，卵巢良性漿液性囊腺瘤、交界性漿液性腫瘤及漿液性癌中LC3-Ⅱ的陽性率分別為4.5%、71.0%、95.0%，交界性漿液性腫瘤和漿液性癌中LC3-Ⅱ的表達明顯高于良性漿液性囊腺瘤，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。卵巢良性黏液性囊腺瘤、交界性黏液性腫瘤及黏液性癌中LC3-Ⅱ的陽性率分別為6.7%、66.7%、92.9%，交界性漿液性腫瘤和漿液性癌中LC3-Ⅱ的表達明顯高于良性漿液性囊腺瘤，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；②在40例卵巢漿液性癌、28例卵巢黏液性癌中，LC3-Ⅱ表達與患者年齡、FIGO分期及病理學分級等臨床病理特征均無關。結論 LC3-Ⅱ在卵巢上皮性交界性腫瘤、癌中表達增高，自噬活性增強，可能與卵巢上皮性惡性腫瘤的進展有關。

關鍵詞卵巢腫瘤；自噬；LC3-Ⅱ

2015-03-10接收

作者單位：1山東大學附屬齊魯醫(yī)院婦產科，濟南 250012

2安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院婦產科，合肥 230001

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的三大惡性腫瘤之一，因缺乏早期腫瘤標志物及預防檢測方法，且晚期病例缺乏有效治療手段，其致死率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤首位。過去50年，美國卵巢癌患者5年生存率約40%［1］。卵巢上皮性腫瘤占原發(fā)卵巢腫瘤的50%～70%，占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，其中漿液性卵巢癌占上皮性卵巢癌的75%，黏液性囊腺癌占上皮性卵巢癌的20%，術后復發(fā)率高，預后差，是晚期患者死亡的主要腫瘤類型。有研究［2］表明，自噬活性的改變與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關，誘導自噬細胞死亡已成為殺死腫瘤細胞的新策略。微管輕鏈Ⅰ蛋白3-Ⅱ型（microtubule-associated protein light chain，LC3-Ⅱ）是特異表達于自噬小體膜的分子標識，在自噬晚期階段表達，更適合自噬的檢測［3］，該研究使用免疫組化法檢測其在不同病變卵巢組織中的表達情況，并結合臨床病理資料進行分析，為了解卵巢上皮性癌發(fā)病機制及分子靶向治療在卵巢癌中應用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 病例資料 收集2011年1月～2012年12月安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院病理科確診的204例上皮性卵巢腫瘤標本，其中卵巢漿液性囊腺瘤46例，交界性漿液性腫瘤28例，漿液性囊腺癌40例，黏液性囊腺瘤32例，交界性黏液性囊腺瘤30例，黏液性囊腺癌28例，另選取正常卵巢上皮組織28例作為對照。所有患者臨床病理資料存檔完整?；颊吣挲g19～79（50.3±5.9）歲。上皮性卵巢癌共68例，按國際婦產科聯(lián)盟（FIGO）2006年手術病理分期標準：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期34例；按病理分化程度分：低分化40例，中分化10例，高分化18例。標本均由兩位病理醫(yī)師分別判斷病理類型和組織學分型。

1.2 試劑 LC3-Ⅱ兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司；免疫組化SP試劑盒、抗原修復液、DAB顯色及辣根過氧化物酶標記IgG的通用型二抗均購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.3 方法 常規(guī)4 μm厚連續(xù)切片，免疫組化SP法按試劑盒說明書進行操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫苯、水化，枸櫞酸鹽熱修復，自然冷卻后氧化氫修復封閉。滴加一抗LC3-Ⅱ（稀釋比1∶50）4℃冷藏過夜，復溫加二抗，DAB染色，蘇木精復染、脫水、透明、封片、觀察。實驗中用已知陽性切片作陽性對照，使用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判讀和評分 LC3-Ⅱ著色于細胞質，呈棕黃色或棕褐色顆粒。采用雙盲法隨機在光學顯微鏡

下觀察5個高倍（×400）視野中腫瘤細胞陽性著色的分布及強度。每個視野計數(shù)100個細胞，按染色強度評分，與背景染色強度對比，0分：無著色；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。按陽性細胞數(shù)百分比評分，0分：無陽性細胞數(shù)；1分：陽性細胞數(shù)百分比≤10%；2分：陽性細胞數(shù)百分比10%～50%；3分：陽性細胞數(shù)百分比50%～80%；4分：陽性細胞數(shù)百分比＞80%；將染色強度、陽性細胞數(shù)評分相乘計算總分，＜1分為陰性，1～4分為弱陽性（＋），5～12分為陽性（＋＋）。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。LC3-Ⅱ在正常卵巢上皮組織、卵巢上皮性腫瘤間表達差異及LC3-Ⅱ的表達與卵巢漿液性癌、卵巢黏液性癌患者臨床病理特征之間的關系均采用χ2檢驗中的Pearson Chi-Square法計算。

2　結果

2.1 LC3-Ⅱ在正常卵巢上皮組織、卵巢漿液性腫瘤、卵巢黏液性腫瘤中的表達評分情況 LC3-Ⅱ在正常卵巢上皮組織、卵巢良性漿液性囊腺瘤、卵巢良性黏液性囊腺瘤中幾無表達，在卵巢交界性漿液性腫瘤、漿液性癌；卵巢交界性黏液性腫瘤和黏液性癌中LC3-Ⅱ著色于細胞質，呈棕黃色或棕褐色顆粒。將良性漿液性瘤、交界性漿液性瘤、漿液性癌設為漿液性腫瘤一組；將良性黏液性瘤、交界性黏液性瘤、黏液性癌設為黏液性腫瘤一組。LC3-Ⅱ表達評分在卵巢漿液性腫瘤一組中P＜0.01；黏液性腫瘤一組中P＜0.01。見圖1、2、3。

2.2 LC3-Ⅱ在正常卵巢上皮組織和卵巢漿液性腫瘤、卵巢黏液性腫瘤中的表達率情況 正常卵巢上皮組織中LC3-Ⅱ無表達。卵巢良性漿液性瘤、交界性漿液性瘤、漿液性癌為漿液性腫瘤一組，LC3-Ⅱ的陽性率分別為4.5%、71.0%、95.0%，交界性漿液性腫瘤和漿液性癌中LC3-Ⅱ的表達明顯高于良性漿液性囊腺瘤，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。良性黏液性瘤、交界性黏液性瘤、黏液性癌為黏液性腫瘤一組，LC3-Ⅱ的陽性率分別為6.7%、66.7%、

92.9%，交界性漿液性腫瘤和漿液性癌中LC3-Ⅱ的表達明顯高于良性漿液性囊腺瘤，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1　LC3-Ⅱ在卵巢組織中的表達［n（%）］

2.3 LC3-Ⅱ表達與漿液性癌、黏液性癌患者臨床病理特征的關系 在40例卵巢漿液性癌、28例卵巢黏液性癌中，LC3-Ⅱ表達與患者年齡、FIGO分期及病理學分級等臨床病理特征均無關。見表2。

表2　LC3-Ⅱ表達與卵巢漿液性癌、黏液性癌患者臨床參數(shù)的關系（n）

3　討論

自噬，為真核細胞所特有，指當機體細胞處于營養(yǎng)缺乏等生理情況或暴露于低氧、輻射、細胞毒等壓力環(huán)境時，為維持生存所需的基礎代謝水平，細胞形成自噬小體，并通過自噬小體與溶酶體的融合，利用溶酶體酶將細胞內的細胞質、蛋白質、大分子物質消化降解，使其循環(huán)利用的生命現(xiàn)象［4-5］。自噬對細胞生長發(fā)育、成熟分化及死亡起重要調控作用，與包括腫瘤在內的多種人類疾病相關［6］。

微管輕鏈Ⅰ蛋白3（the microtubule-associated protein light chain 3，LC3），主要分為兩種亞型：Ⅰ型和Ⅱ型。當細胞沒有發(fā)生自噬時，細胞內合成的LC3經過加工成為胞質可溶性Ⅰ型LC3，常規(guī)表達。當機體本身發(fā)生自噬時，Ⅰ型LC3經過泛素樣加工和修飾過程，與存在自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3-PE，即LC3-Ⅱ，定位于自噬體膜的內外表面［7-8］。由于LC3-Ⅱ在自噬晚期階段表達，因此，更適合自噬的監(jiān)測，主要反映細胞內自噬體數(shù)量，與自噬活性密切相關。

本組實驗中，LC3-Ⅱ在正常卵巢上皮不表達，卵巢漿液性、黏液性腫瘤中，良性幾無表達，交界性及癌中表達明顯高于正常卵巢上皮及良性腫瘤；癌中表達明顯高于交界性腫瘤，表明漿液性、黏液性卵巢上皮腫瘤交界性、癌自噬活性顯著增加。提示上調自噬可能更有利于卵巢上皮性惡性腫瘤細胞在壓力環(huán)境下的生存，致大部分卵巢上皮性腫瘤在經典的外科手術及緊跟其后的紫杉醇、鉑類化療的治療后出現(xiàn)耐藥，使復發(fā)率及死亡率居高不下。

自噬對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有雙向作用，即可限制腫瘤的起始發(fā)生，也可促進腫瘤的形成和進展。即使同為婦科腫瘤，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中所起到的作用也是不同的。自噬具有維持細胞完整和穩(wěn)定基因組的作用，在腫瘤形成早期，自噬水平的降低可能增加DNA突變的可能，從而促進細胞增殖［9］。研究［10］發(fā)現(xiàn)Beclin 1和LC3在Ⅰ-Ⅱ分期（FIGO標準）的宮頸鱗癌的表達水平明顯低于在正常宮頸組織中的表達，這表明在宮頸鱗癌的形成早期，自噬具有抑制腫瘤發(fā)展的作用。在腫瘤進展過程中，血管機能不全引發(fā)的葡萄糖、氧過消耗，致活性氧產量的增加，腫瘤細胞外酸中毒，最終導致自噬在腫瘤微環(huán)境增強［11］。此時的腫瘤細胞依賴自噬作用清除細胞內毒性物質、循環(huán)再利用營養(yǎng)物質來延長腫瘤的生存；同時這種保護性機制使腫瘤細胞成功應對細胞毒性化療藥物，致使腫瘤耐藥［12］。有研究［13］顯示，Beclin 1和LC3在子宮內膜癌中表達上調，誘導自噬，提示自噬與子宮內膜癌的發(fā)展及不良預后有關系，并且在低氧或營養(yǎng)缺乏的條件下，自噬在子宮內膜癌中可能作為一種保護性機制促進癌癥發(fā)展。當然，某些情況下過度自噬腫瘤會發(fā)生自噬性程序死亡，即所謂的Ⅱ型程序性細胞死亡，有利于增強化療藥的細胞毒性效應，這一現(xiàn)象有利于癌癥的治療［14］。

自噬對腫瘤起抑制或促進作用，取決于組織類型、發(fā)展階段，涉及的突變及腫瘤微環(huán)境的改變。針對自噬可能是一個戰(zhàn)略性對抗卵巢癌的新型療法。

然而，以自噬為基礎的療法需嚴格取決于在腫瘤細胞中正在進行的實際自噬水平，這可能受基因突變、腫瘤微環(huán)境的影響。揭示自噬相關基因的臨床意義，明確自噬失調和表觀遺傳因素，有望為卵巢癌癥開辟新的診斷和治療方法。

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Expression and clinical significance of autophagy-related LC3-Ⅱin epithelial ovarian cancer

Yu Ting1，2，Zhao Hongping2，Zhou Ying2，et al
（1Dept of Gynecology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，2Dept of Gynecology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

AbstractObjective To investigate the expression of microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）in the epithelial ovarian carcinoma and explore their correlations to the tumorigenesis and development of epithelial ovarian carcinoma.Methods 204 specimens with different-type epithelial ovarian tumors，including 46 with serous cystadenoma，28 with borderline serous cystadenoma，40 with serous cystadenocarcinoma，32 with mucinous cystadenoma，32 with borderline mucinous cystadenoma，28 with mucinous cystadenocarcnoma，were selected in our study.Immunohistochemistry was employed to detect the expression of LC3-Ⅱ.The correlations between expression of LC3-Ⅱand both the pathological features and clinical manifestations of 68 epithelial ovarian cancer patients were analyzed.Results The positive rates of LC3-Ⅱwere significantly higher in epithelial ovarian cancinoma and borderline ovarian tumors than benign epithelial ovarian tumors.（In ovarian serous tumor，95%and 71%vs 4.5%，P ＜0.01；in ovarian mucinous tumor，92.9%and 66.7%vs 6.7%，P＜0.01）②In the serous cystadenocarcinoma and mucinous cystadenocarcnoma，the expression of LC3-Ⅱwas not correlated to age，F(xiàn)IGO stage and histological grade.Conclusion Expression of LC3-Ⅱis up-regulated in epithelial ovarian cancer tissues.The increase of autophagic capacity may relate to the development of epithelial ovarian cancer.

Key wordsovarian neoplasm；autophagy；LC3-Ⅱ

作者簡介：于 婷，女，主治醫(yī)師，碩士研究生；劉培淑，女，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：liupeishu2010＠gmail.com

基金項目：國家自然科學基金（編號：81001168、81272881）；安徽省科技廳年度重點科研項目（編號：1301043053）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0628-04

中圖分類號R 737.3