14，15-EET通過(guò)TRPV4-SKCa復(fù)合物調(diào)節(jié)氣管平滑肌收縮機(jī)制研究

張 潔，沈 兵，桑大成，杜 鵑，丁圣剛

14，15-EET通過(guò)TRPV4-SKCa復(fù)合物調(diào)節(jié)氣管平滑肌收縮機(jī)制研究

張 潔1，沈 兵1，桑大成1，杜 鵑1，丁圣剛2

摘要目的 探討花生四烯酸細(xì)胞色素P450（CYP）表氧化酶代謝產(chǎn)物14，15-環(huán)氧化二十碳三烯酸（14，15-EET）對(duì)小鼠氣管平滑肌收縮功能的影響及其機(jī)制。方法 采用離體氣管實(shí)驗(yàn)，通過(guò)運(yùn)用特異性鈣激活鉀通道阻斷劑和瞬時(shí)受體電位離子通道4（TRPV4）通道阻斷劑，觀察14，15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的影響；采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRPV4通道蛋白與小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（SKCa）蛋白在小鼠氣管平滑肌組織中的相互作用。結(jié)果 與對(duì)照組相比，300 nmol／L 14，15-EET預(yù)處理小鼠氣管后，卡巴膽堿引起的收縮顯著減弱；大、中電導(dǎo)鈣激活鉀通道阻斷劑IbTX和TRAM34沒(méi)有顯著影響14，15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的抑制效應(yīng)；而SKCa阻斷劑Apamin和TRPV4通道阻斷劑RN-1734都分別顯著阻斷了14，15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的抑制作用。免疫共沉淀結(jié)果顯示TRPV4通道蛋白和SKCa通道蛋白可以彼此相互共沉淀。結(jié)論 在小鼠氣管平滑肌中，14，15-EET通過(guò)TPRV4-SKCa鈣信號(hào)復(fù)合物調(diào)節(jié)氣管平滑肌的收縮。

關(guān)鍵詞鈣激活鉀通道；瞬時(shí)受體電位離子通道4；14，15-EET；氣管平滑肌

2015-02-02接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022

支氣管哮喘是由多種炎癥因子參與的慢性氣道炎癥，因其患病率和死亡率的逐年上升，已成為嚴(yán)重威脅公眾健康的一種主要慢性病。環(huán)氧化二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acid，EETs）作為花生四烯酸的衍生物，可以使氣管平滑肌舒張并減弱氣管平滑肌細(xì)胞對(duì)Ca2＋的敏感性［1］，但其作用靶點(diǎn)還未完全闡明。該研究通過(guò)闡明EETs同分異構(gòu)體中14，15-EET對(duì)激動(dòng)劑引起的氣管平滑肌收縮的作用及其機(jī)制，揭示氣管平滑肌中瞬時(shí)受體電位離子通道4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）與小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（small conductance Ca2＋-activated K＋-channel，SKCa）所形成的鈣信號(hào)復(fù)合物在調(diào)節(jié)氣管張力中的作用。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 14，15-EET購(gòu)自英國(guó)Abcam Biochemicals公司；卡巴膽堿、RN-1734、TRAM34、Apamin等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TRPV4、SKCa抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；二抗Goat-Anti-Rabbit IgG購(gòu)自合肥志宏生物有限公司；Protein A Magnetic Beads購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；克氏液（NaCl 118 mmol／L、CaCl22.5 mmol／L、KCl 4.7 mmol／L、KH2PO41.2 mmol／L、MgSO4·7H2O 1.2 mmol／L、NaHCO325.2 mmol／L和glucose 11.1 mmol／L）；高鉀溶液（NaCl 58 mmol／L、KCl 60 mmol／L、CaCl22.5 mmol／L、KH2PO41.2 mmol／L、MgSO4·7H2O 1.2 mmol／L、NaHCO325.2 mmol／L和glucose 11.1 mmol／L）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種雄性小鼠，清潔級(jí)，6周齡，20～25 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。正常進(jìn)食飲水，室溫維持（22±1）℃。

1.2 方法

1.2.1 氣管環(huán)的制備 用CO2窒息法處死小鼠，迅速取出喉部以下的主支氣管，放入備好的克氏（K-H）液并通有混合氣體（95%O2和5%CO2）保持pH在7.40±0.05。在解剖顯微鏡下用精密手術(shù)剪和手術(shù)鑷快速、輕柔地去除氣管外周結(jié)締組織，用粗糙的金屬絲小心去除氣管內(nèi)皮，然后沿縱軸將氣管剪成長(zhǎng)約2 mm氣管環(huán)。

1.2.2 離體氣管張力實(shí)驗(yàn) 參照朱金行等［2］的實(shí)驗(yàn)方法，將分離干凈的氣管環(huán)懸掛于張力換能器上，并置于含有5 ml K-H液的浴槽內(nèi)，通入含95%O2和5%CO2的混合氣體；調(diào)節(jié)張力換能器，給予氣管環(huán)500 mg前負(fù)荷，運(yùn)用BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)氣管張力信號(hào)，在K-H液中平衡40～60 min，且每隔15 min更換一次K-H液，待氣管張力基線趨于穩(wěn)定后，加入60 mmol／L的高鉀溶液激動(dòng)氣管，收縮達(dá)峰值后，用K-H液洗3 min×4次，反復(fù)激動(dòng)2

次后分兩組，一組為對(duì)照組不做任何處理，另一組加入300 nmol／L 14，15-EET作為實(shí)驗(yàn)組；重復(fù)上述相同處理方法后分組，一組加入300 nmol／L 14，15-EET作為對(duì)照組，另一組加入IbTX阻斷劑和300 nmol／L 14，15-EET預(yù)處理10 min（TRAM34、Apamin、RN-1734阻斷劑方法同IbTX），然后加入不同濃度的卡巴膽堿，觀察量效關(guān)系。

1.2.3 免疫共沉淀 從小鼠氣管組織中提取蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。新鮮離體氣管去掉脂肪、結(jié)締組織，稱重后加入適當(dāng)體積的裂解液，冰上研磨裂解轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，置于冰上30～60 min，4℃、3 000 r／min離心5 min后取上清液。兩個(gè)樣品中分別加入抗TRPV4的抗體和抗SKCa抗體（抗SK3）進(jìn)行免疫沉淀，4℃震蕩2 h后分別加入預(yù)處理好的50 μl Protein A Magnetic Beads過(guò)夜；次日，于冰盒磁力架上吸附后棄上清液。清洗沉淀3次后加入50 μl 5×上樣緩沖液煮沸，收集上清液后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blot法 蛋白樣品行SDS-PAGE電泳后以0.2 A恒流轉(zhuǎn)膜，隨后用5%脫脂牛奶封閉1 h，4℃孵育一抗過(guò)夜。次日，以PBST洗膜，5 min×3次，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBST漂洗5 min×3次，顯色。

2　結(jié)果

2.1 14，15-EET對(duì)小鼠氣管張力的影響 卡巴膽堿可以濃度依賴地引起小鼠氣管環(huán)收縮（10-10～10-3mol／L），與對(duì)照組相比，300 nmol／L 14，15-EET預(yù)處理使卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮顯著減弱（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 3種Ca2＋激活鉀通道阻斷劑對(duì)14，15-EET引起的氣管舒張的影響 大、中電導(dǎo)鈣激活鉀通道阻斷劑50 μmol／L IbTX和10 μmol／L TRAM 34沒(méi)有顯著影響300 nmol／L 14，15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的抑制效應(yīng)；而SKCa阻斷劑1 μmol／L Apamin顯著阻斷了14，15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的抑制作用（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 TRPV4通道阻斷劑對(duì)14，15-EET引起的氣管舒張的影響 TRPV4通道阻斷劑20 μmol／L RN-1734＋14，15-EET處理組與14，15-EET組相比，明顯減弱了14，15-EET對(duì)卡巴膽堿引起的小鼠氣管收縮的抑制效應(yīng)（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 TRPV4蛋白和SKCa通道相互作用 將小鼠氣管平滑肌組織裂解后，提取蛋白，上樣分別為小鼠氣管平滑肌裂解液、洗脫液、免疫共沉淀IP產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRPV4蛋白和SKCa通道蛋白第三亞型SK3可以彼此相互共沉淀。見(jiàn)圖4。

3　討論

鈣激活鉀通道屬于鉀通道家族中的一個(gè)分支。根據(jù)其電導(dǎo)大小可分為大電導(dǎo)鈣激活鉀通道、中電導(dǎo)鈣激活鉀通道和SKCa通道。SKCa通道廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中，如平滑肌、骨骼肌、腎臟及內(nèi)分泌細(xì)胞等［3］。TRPV4通道是瞬時(shí)受體電位離子通道家族（transient receptor potential，TRP）中香草素受體亞家族成員，屬于非選擇性陽(yáng)離子通道，對(duì)Ca2＋具有一定的通透性，在生物體許多組織、器官中均有表達(dá)，可以感受低滲引起的細(xì)胞膨脹、機(jī)體溫度變化以及佛波醇酯衍生物、細(xì)胞內(nèi)外Ca2＋濃度、花生四烯酸等的理化刺激，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓、機(jī)械刺激、溫度、血管張力以及氣管平滑肌的收縮，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對(duì)機(jī)體許多生理功能的正常完成有重要作用。

EETs有多種同分異構(gòu)體，如5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET和14，15-EET［4］。目前研究認(rèn)為EETs有舒張血管、調(diào)節(jié)臟器局部血流和抗炎等多種功能［5-6］，還可作為第二信使在某些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［7］。有研究［8］顯示，EETs能直接激活內(nèi)皮細(xì)胞中的TRPV4通道調(diào)節(jié)血管平滑肌張力。然而，EETs引起平滑肌舒張的分子機(jī)制尚不十分清楚。在大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，TRPV4 和SKCa可以形成鈣信號(hào)復(fù)合物，通過(guò)TRPV4調(diào)節(jié)SKCa開(kāi)放并引起血管平滑肌細(xì)胞超極化，從而引起血管舒張［9］。

氣管平滑肌的收縮效應(yīng)在調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)疾病中起著重要作用。EETs作為花生四烯酸的衍生物，在哺乳動(dòng)物的肺部、心臟和內(nèi)皮細(xì)胞中都有表達(dá)［6，10-11］，在氣管上皮細(xì)胞中被稱為超極化因子起到舒張氣管和抗炎的作用［6］。雖然EETs相關(guān)研究日益受到重視，但其對(duì)氣管平滑肌功能的作用還未完全闡明。平滑肌的收縮是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，有多種機(jī)制參與調(diào)節(jié)。有研究［9］報(bào)道在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，TRPV4-SKCa可形成鈣信號(hào)復(fù)合物調(diào)節(jié)血管平滑肌的收縮。本研究中的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRPV4和SKCa在氣管平滑肌也可以形成鈣信號(hào)復(fù)合物，而且氣管張力實(shí)驗(yàn)表明，預(yù)先加入14，15-EET處理后比對(duì)照組對(duì)卡巴膽堿的收縮反應(yīng)顯著減弱，這是由于14，15-EET可以激活細(xì)胞膜上TRPV4通道，介導(dǎo)Ca2＋內(nèi)流，導(dǎo)致局部Ca2＋濃度迅速升高，進(jìn)而激活與其相互作用的SKCa通道產(chǎn)生外向鉀電流并導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化，反饋性抑制電壓依賴鈣通道，使Ca2＋內(nèi)流減少、細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度降低，抑制氣管平滑肌的收縮，最終引起氣管舒張。因此，充分認(rèn)識(shí)EETs對(duì)TRPV4-SKCa復(fù)合物在氣管平滑肌細(xì)胞上

的作用機(jī)制對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的防治具有重要意義。

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14，15-epoxyeicosatrienoic acid regulates airway smooth muscle contraction through TRPV4-SKCasignal complex

Zhang Jie，Shen Bing，Sang Dacheng，et al
（Dept of Physiology，College of Basic Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032）

AbstractObjective To provide a mechanistic insight into how 14，15-epoxyeicosatrienoic acid（14，15-EET）which is a product of cytochrome P450 epoxygenase regulates mouse airway smooth muscle contraction.Methods Isolated mouse tracheal tension was measured in vitro.Mouse tracheal rings were treated by Ca2＋-activated K＋channel blockers or transient receptor potential vanilloid 4（TRPV4）channel blocker.The changes of relaxation caused by 14，15-EET in tracheal rings were recorded after the tracheal rings were contracted by carbachol in concentration-dependent fashion.Co-immunoprecipitation was used to examine the physical interaction between TRPV4 and SKCain airway smooth muscle.Results Tracheal tension measurement showed that compared with the control group，carbachol-induced contraction in 300 nmol／L 14，15-EET pretreatment group was significantly reduced.BKCa and IKCa blockers did not affect the effect of 14，15-EET on carbachol-induced tracheal contraction.However，SKCaand TRPV4 blockers notably inhibited the effect of 14，15-EET on carbachol-induced tracheal contraction，respectively.Conclusion 14，15-EET regulates airway smooth muscle contraction via TRPV4-SKCasignal complex.

Key wordsCa2＋-activated K＋channel；transient receptor potential vanilloid 4；14，15-EET；airway smooth muscle

作者簡(jiǎn)介：張 潔，女，碩士研究生；沈 兵，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shenbing＠anhui.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81371284）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）05-0565-04

中圖分類號(hào)Q 412