熊果酸對斑馬魚血管生成及斑馬魚移植癌的抑制作用

陳錫強，程麗芳，徐新剛，劉可春，閆雪生，王希敏，劉　瑾，李　瑩，侯海榮，孫丹丹，韓利文，彭維兵(.山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院斑馬魚藥物篩選中心，.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟南　5004)

?

熊果酸對斑馬魚血管生成及斑馬魚移植癌的抑制作用

陳錫強1，程麗芳2，徐新剛2，劉可春1，閆雪生2，王希敏1，劉瑾2，李瑩2，侯海榮1，孫丹丹2，韓利文1，彭維兵1
(1.山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院斑馬魚藥物篩選中心，2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟南250014)

中國圖書分類號: R-332; R322.12; R364.3; R73-35; R735. 7; R735. 3; R979. 1

摘要:目的研究熊果酸(ursolic acid，UA)對斑馬魚節(jié)間血管生成以及對斑馬魚移植癌的影響。方法采用AB系和轉(zhuǎn)基因(trangenosis，TG)血管熒光斑馬魚(VEGFR2: GFP)作為實驗?zāi)Ｐ蛣游?，在熒光顯微鏡下觀察不同劑量UA對斑馬魚胚胎背部節(jié)間血管(intersegment vessels，ISV)生成情況的影響;利用微量注射的方法分別建立斑馬魚的人肝癌細胞及腸腺癌斑馬魚的移植癌模型，在共聚焦顯微鏡下分別觀察UA對肝癌細胞的影響，及人腸腺癌誘導(dǎo)的腸下靜脈叢(subintestinal veins，SIVs)的變化，計算抑制率和SIVs生長情況，結(jié)果顯微鏡示UA 5與10 mg·L－1組引起TG斑馬魚節(jié)間熒光血管殘缺或者缺失，抑制率分別為20. 25%、26. 65%;在斑馬魚肝癌SMMC-7721模型實驗中，3個UA劑量組可減少移植肝癌細胞光密度(optical density，OD)，抑制率分別為38. 01%、54. 69%(P＜0. 01)、61. 88%(P＜0. 01)，具有劑量依賴性;在斑馬魚移植瘤SIVs的實驗中，UA 10 mg·L－1與15 mg·L－1組對移植癌誘導(dǎo)的SIVs增生有明顯的抑制作用(P＜0. 01)。結(jié)論UA對斑馬魚生理性及移植瘤引起的血管生成有明顯抑制作用，這種抑制血管生成的作用與阻滯VEGFR2相關(guān)。

關(guān)鍵詞:熊果酸;斑馬魚;抗癌;血管生成; SMMC-7721; HT-29

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.023.html

程麗芳(1956－)，女，博士，研究員，研究方向:中藥藥理學，通訊作者，Tel:0531-82949846，E-mail: chenglifang517@ 163.om;

劉可春(1964－)，男，博士，研究員，研究方向:藥理學，通訊作者，Tel:0531-82605352，E-mail: hliukch@ sdas.org

新血管生成對于惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用［1－2］，抑制腫瘤新生血管生成已經(jīng)成為腫瘤靶向治療的重要方向，其中斑馬魚是公認的血管新生在體研究模型，由于其胚胎透明，生長初期主動脈及節(jié)間血管在鏡下清晰可見，現(xiàn)已成為一種理想的抗血管生成高通量藥物篩選的模型，并且在天然產(chǎn)物藥理研究中也得到了應(yīng)用［3］。熊果酸(ursolic acid，UA)是廣泛存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，目前的研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的藥理活性如:鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等［4－5］作用，本研究旨在考察UA對斑馬魚生理性和腫瘤誘導(dǎo)的血管生成的作用，及其對斑馬魚移植瘤模型的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑實驗動物AB系野生斑馬魚(wild type，AB strain)，血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(VEGFR2: GFP)系山東省科學院斑馬魚藥物篩選中心提供。肝癌SMMC-7721、結(jié)腸腺癌HT-29均為山東省醫(yī)學科學院藥物研究所惠贈。凍存HT-29和SMMC-7721分別復(fù)蘇后，傳代，備用。熊果酸(純度≥99. 0%)由山東省中醫(yī)藥研究院課題組提供; PTK787購自Sigma公司(純度≥98.0 %); CM-DiL(C7000)活細胞染色劑購自Invitrogen; RPMI 1640培養(yǎng)基與新鮮牛血清(Gibco，批號1354643，1122050); 0. 25%胰酶-EDTA(Gibco，批號1535318);三卡因(Sigma-ALDRICH);脫膜劑pronase E(SOLARBIO)。

1.2實驗儀器微量注射儀ZGENEBIO PCO-1500(力鈞生物科技有限公司); SZX16體式熒光顯微鏡、IX51倒置顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡FV-1000(Olympus);無菌操作臺sw-cj-2fd(蘇州AIRTECH);5804R離心機(Eeppendorf); ZSA302體視顯微鏡(重慶光學儀器公司); Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，HPG-280BX光照培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子科技公司);斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)設(shè)備(北京愛生科技公司)。

1.3方法

1.3.1斑馬魚胚胎的獲取選用成熟♀♂斑馬魚分開喂養(yǎng)，照明14 h/黑暗10 h交替進行，定時飼喂人工餌料;采胚胎時，取性成熟斑馬魚按照♀∶♂= 1∶1～2放入繁殖缸中，于次日10時獲得受精卵。對受精卵進行純凈水清洗，移入加有亞甲基藍(消毒)的斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水(含5 mmol·L－1NaCl，0. 17 mmol·L－1KCl，0. 4 mmol·L－1CaCl2，0. 164 mmol·L－1MgSO4)中，置于28℃光照培養(yǎng)箱待用。

1.3.2 UA對TG斑馬魚節(jié)間血管生成的影響在受精卵發(fā)育至24 h時，使用1 g·L－1Pronase E溶液脫去卵膜。在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚胚胎，移入24孔板中，每孔10枚。用二甲基亞砜(DMSO)將UA配制成2 g·L－1母液，取一定體積至24孔中，使UA的終濃度為1. 25、2. 5、5、10 mg·L－14組;陽性藥物選用終濃度為2 mg·L－1的酪氨酸酶抑制劑PTK787;對照組為含0. 1%DMSO培養(yǎng)水，加藥后置于光照培養(yǎng)箱28℃24 h。于48 hpf時，熒光顯微鏡下觀察并計算斑馬魚節(jié)間血管長度，拍照，利用IPP計算背部中段血管長度，計算抑制率。

抑制率/% =(正常對照組節(jié)間血管長度－給藥組節(jié)間血管長度)/正常對照組節(jié)間血管長度×100%。

1.3.3 UA對斑馬魚肝癌移植細胞的影響制備微量注射癌細胞懸液:按照Yong等［6］報道的實驗方法進行，略有改動。無菌條件下在操作臺將培養(yǎng)瓶中SMMC-7721細胞除去培養(yǎng)基，PBS清洗1次后，加入0. 25%胰酶消化1 min，后加入培養(yǎng)基終止消化，離心后換新的RPMI 1640培養(yǎng)基，細胞懸液加入CM-DiL活細胞染色劑，37℃孵育5 min，然后4℃孵育15 min，隨后離心除去上清液，PBS清洗2次后，加入培養(yǎng)基，鏡下調(diào)整細胞密度達到2×109·L－1，備用。

給藥條件及處理方法:新生斑馬魚胚胎用蒸餾水清洗2次，隨后用含有亞甲基藍培養(yǎng)水滅菌處理，加入終濃度0. 03%二苯硫脲(PTU)孵育48 h(除斑點)，斑馬魚胚胎加入適量1%三卡因輕度麻醉，放置在體式顯微鏡下，用微量注射儀將CM-Dil染色后的肝癌細胞注射于胚胎卵黃下，約0. 1μL(約200個癌細胞)，微量注射條件:壓力0. 12psi，注射時間:0. 08s，注射后斑馬魚按照每組12條分組，隨機分4組:模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組;正常對照組僅做穿刺注射處理，不注射細胞; UA用DMSO配制成2 g ·L－1母液，取一定體積無菌水至24孔中，使UA的終濃度為0、5、10、15 mg·L－1放入28℃培養(yǎng)箱。在48 h后，將各組麻醉后的胚胎于共聚焦鏡下拍照，用40倍鏡拍攝，波長為550 nm，X、Y行2個方向的逐層掃描，拍攝整體斑馬魚。并用FV-10軟件計算紅色腫瘤細胞OD值，進行統(tǒng)計。抑制率/% =(模型組OD－給藥組OD)/模型組OD×100%。

1.3.4 UA對HT-29誘導(dǎo)斑馬魚腸下靜脈血管生成的影響

1.3.4.1制備微量注射懸液移植癌選用增殖期HT-29，操作參照“1.3.3”。

1.3.4.2微量注射方法操作參考“1.3.3”，斑馬魚胚胎與UA共同孵育了48 h后觀察結(jié)果，將麻醉后的胚胎放置于共聚焦鏡下，波長為480 nm，分別拍攝整體與腸下靜脈，沿X、Y行2個方向的逐層掃描拍照，并用FV-10軟件分析腸下靜脈OD，并進行統(tǒng)計學處理。

1.4統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13. 0統(tǒng)計學軟件工具進行分析，數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用t檢驗。

2　結(jié)果

2.1 UA對斑馬魚節(jié)間血管生成的影響斑馬魚節(jié)間血管的發(fā)育起始時間24hpf，本實驗觀察的現(xiàn)象與文獻相同［7］;對照組斑馬魚節(jié)間血管生長良好，節(jié)間血管呈均勻縱向排列，完整無缺失，無斷裂，熒光強。PTK787組的斑馬魚ISV缺失明顯，熒光消失; UA處理組的中、高劑量組熒光缺失明顯:出現(xiàn)血管變細、部分缺失，5與10 mg·L－1UA組節(jié)間血管長度與對照組比較差異有顯著性(P＜0. 01)，抑制率分別達到了20. 25%、26. 65%(Fig 1，2)，同時鏡下可見節(jié)間血流明顯減少，并且高濃度UA具有延遲胚胎發(fā)育，心臟線性畸形等現(xiàn)象。

Fig 1　ISV of VEGFR2 zebrafish after treatment of different concentrations of UA＊＊P＜0. 01 vs control(0.1%DMSO)

Fig 2　Lateral view of TG(VEGFR2: GFP)zebrafish showing ISV after treatment with UA for 24h

a: Control(0.1%DMSO)at 48hpf; b: Zebrafish larva treated with 2 mg·L－1PTK787; c: Zebrafish larva treated with 5 mg·L－1UA; d: Zebrafish larva treated with 10 mg·L－1UA.Yellow arrow indicates ISV，white arrow indicates missing ISV，red arrow shows line-heart.

2.2 UA對荷癌斑馬魚腫瘤細胞的影響胚胎經(jīng)微量注射SMMC-7721細胞48 h后，各組死亡率介于25. 0%～41. 7%，與文獻報道相似［8］;顯微鏡下可見:空白對照組生長良好，模型組鏡下可見紅色腫瘤細胞在胚胎各個器官均有分布，較集中于卵黃部、卵黃延伸部及尾段主動脈，在頭部及眼睛也有少量分布; UA組紅色腫瘤細胞全身分布的情況消失，10 及15 mg·L－1組紅色細胞數(shù)量減少，且分布區(qū)域有限，僅局限于卵黃延伸部和尾段主動脈(Fig 3)，15 mg·L－1組胚胎出現(xiàn)體色變淺、生長緩慢等變化;各組OD值顯示，10及15 mg·L－1組與模型組比較均差異具有顯著性(P＜0. 01)，UA各組對SMMC-7721的抑制率分別為38. 01%、54. 69%、61. 88%，具有明顯的劑量依賴性(Tab 1)。

Tab 1　Changes of SMMC-7721 xenografts in zebrafish larva after treatment with different concentrations of UA(±s)

Tab 1　Changes of SMMC-7721 xenografts in zebrafish larva after treatment with different concentrations of UA(±s)

Group　n　OD　Inhibition rate of tumor growth/% 0.1%DMSO 　10　0 Model　9 67822.67±20905.33 UA 5 mg·L－1　8 42235.25±19003.75　38.01 UA 10 mg·L－18 30732.75±14051.63＊＊　54.69 UA 15 mg·L－17 25852.86±14722.43＊＊61.88＊＊P＜0.01 vs model group

Fig 3　Zebrafish showing SMMC-7721 xenografts after treatment with UA for 48ha: Control(0.1% DMSO).b: SMMC-7721 xenograft zebrafish at 96hpf(model group); c.d.e: SMMC-7721 xenograft Zebrafish larvas treated with 5mg·L－1UA，10mg·L－1UA，15mg·L－1UA.White arrow indicates SMMC-7721 cell.

2.3 UA對斑馬魚HT-29移植瘤腸下靜脈血管生成的影響共聚焦鏡下觀察顯示:空白對照組斑馬魚胚胎SIVs呈半月形，呈柵欄狀，連續(xù)無分支，無側(cè)枝及出芽; HT-29荷瘤模型組SIVs顯示有明顯增生，靜脈彎曲延長，出現(xiàn)側(cè)枝與分支，部分區(qū)域呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);與模型組比較，UA組顯示出腸下靜脈叢OD值隨濃度增加減少，出芽及側(cè)枝數(shù)量減少(Fig 5)，其作用具有明顯劑量依賴性，UA組與模型組比較，10 mg·L－1UA與15 mg·L－1UA組差異有顯著性(P＜0. 01，F(xiàn)ig 4)。

3　討論

Fig 4　Effect of UA on SIVs in HT-29 xenografts in zebrafish after treatment for 48h＊＊P＜0.01 vs model group

斑馬魚移植瘤模型屬于國際上新型移植腫瘤動物模型，相對于實驗鼠移植腫瘤模型，斑馬魚移植腫瘤模型具有成本較低、實驗周期短(4～7 d)，樣品用量少，移植癌細胞在鏡下清晰可見等優(yōu)點，有利于腫瘤細胞體內(nèi)遷移與新生血管的研究，目前斑馬魚胚胎腫瘤移植模型常常被用于癌細胞遷移相關(guān)基因功能與抑制血管生成的藥物篩選研究［6，8］;研究發(fā)現(xiàn)，不同的腫瘤細胞在斑馬魚體內(nèi)的表現(xiàn)有差異，MDA-231、DU-145等腫瘤細胞具有較強的遷移性，會在胚胎多個部位有出現(xiàn);而T-47D、HT-29等腫瘤細胞遷移則不明顯，主要在卵黃區(qū)域注射部位聚集，該部位的腫瘤細胞分泌的生長因子可刺激腸下靜脈SIVs明顯增殖［9］，因而非常適合藥物初期篩選實驗，在本實驗我們采用了SMMC-7721與HT-29分別注射建模。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，UA對前列腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞均具有抑制作用，其作用靶點廣泛:有報道［10－13］UA對Wnt/β-catenin、Akt/NF-κB、AMPK、STAT3等重要信號通路均有抑制作用，本項研究考察UA對斑馬魚生理性節(jié)間血管及對移植瘤環(huán)境下的血管生成的作用，應(yīng)用斑馬魚移植癌模型探討UA抗腫瘤活性在國內(nèi)屬首次報道。

本實驗所使用的轉(zhuǎn)基因斑馬魚為血管內(nèi)皮生長因子Ⅱ型受體(VEGFR2)標記綠色熒光蛋白的斑馬魚，UA處理后的斑馬魚節(jié)間血管熒光減弱或者消失，鏡下血流數(shù)量減少，說明UA對于斑馬魚生理狀態(tài)下血管生成有抑制作用，同時也提示UA的作用機制與抑制VEGFR2的表達有關(guān);體外研究結(jié)果表明: UA在4.57 mg·L－1濃度時對HT-29增殖有明顯抑制作用［14］，本實驗表明10 mg·L－1時可明顯抑制HT-29引起的斑馬魚SIVs增生，說明UA抗腫瘤作用既有抗增殖作用，同時具有抑制血管生成的作用，揭示了UA的抗腫瘤作用具有多個靶點作用特點。

Fig 5　Effect of UA on SIVs in HT-29 xenografts in zebrafish after treatment for 48ha: Control at 96hpf(0.1%DMSO); b: HT-29 xenografts zebrafish at 96hpf.; c.d.e: xenogrsfts zebrafish larvas treated with PTK787 2mg· L－1; UA 10mg·L－1; UA 15mg·L－1at 96hpf.

UA針對肝癌體外實驗結(jié)果顯示: UA對SMMC-7221細胞體外增殖有抑制作用，其機制為將肝癌細胞周期阻滯于S期，使DNA合成受阻，細胞喪失增殖能力［15］，本實驗結(jié)果表明UA對于斑馬魚胚胎體內(nèi)SMMC-7221細胞數(shù)量同樣具有抑制作用;并且從UA處理后斑馬魚移植瘤癌細胞分布的部位來看，其具有抑制癌細胞遷移的傾向，說明熊果酸的抗遷移作用也是其抗腫瘤活性作用，但是該現(xiàn)象還需要更深入的實驗研究。綜上，本研究證明了UA對斑馬魚體內(nèi)移植癌以及移植癌誘導(dǎo)的血管新生均有明顯的抑制作用，表明UA具有良好的抗癌活性，證明其具有較好的應(yīng)用前景。

參考文獻:

［1］Carmeliet P，Jain R K.Angiogenesis in cancer and other diseases ［J］.Nature，2000，407(6801):249－57.

［2］Folkman J，Angiogenesis in cancer，vascular，rheumatoid，and other diseases［J］.Nature Med，1995，1:27－31.

［3］陳磊，劉怡，梁生旺.模式生物斑馬魚在中藥研究中的應(yīng)用［J］.藥學學報，2012，47(4): 434－9.

［3］Chen L，Liu Y，Liang S W.Application of zebrafish model organism in the research of Chinese materia medical［J］.Acta Pharm Sin，2012，47(4): 434－9.

［4］王博龍.烏索酸對人肝星狀細胞凋亡及TGFβ1mRNA表達的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):417－8.

［4］Wang B L.Effect of ursolic acid on apoptosis and expression of TGFβ1 mRNA in human hepatic stellate cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):417－8.

［5］孟艷秋，陳瑜，王趲，等.熊果酸的研究進展［J］.中國新藥雜志，2007，16(1):25－9.

［5］Meng Y Q，Chen Y，Wang Z，et al.Research advance of ursolic acid［J］.Chin J New Drugs，2007，16(1):25－9.

［6］Stefania N，Marco P.The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay［J］.NAT protocols，2007，2(11):2918－23.

［7］夏小燕，劉可春，王思鋒，等.大青葉靛玉紅的抗血管生成活性研究［J］.中國藥學雜志，2010，45(3):187－9.

［7］Xia X Y，Liu K C，Wang S F，et al.Studies on anti-angiogenesis activity of indirubin from folium isatidis［J］.Chin Pharm，2010，45(3):187－99.

［8］Yong T，Xie X Y，Steven W，et al.Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish［J］.BMC Cancer，2013，13:453－65.

［9］Karni S M，Karine F L，Jamil H，et al.Discriminating different cancer cells using a zebrafish in vivo assay［J］.Cancers，2011，3:4102－13.

［10］Park J H，Kwon H Y，Sohn E J，et al.Inhibition of Wnt/β-catenin signaling mediates ursolic acid-induced apoptosis in PC-3 prostatecancer cells［J］.Pharmacol Rep，2013，65(5):1366－74.

［11］Gai L，Cai N，Wang L，et al.Ursolic acid induces apoptosis via Akt/NF-κB signaling suppression in T24 human bladder cancercells［J］.Mol Med Rep，2013，7(5):1673－7.

［12］Chen M B，Zhang Y，Wei M X，et al.Activation of AMP-activated protein kinase(AMPK)mediates plumbagin-induced apoptosis and growth inhibition in cultured human colon cancer cells［J］.Cell Signal，2013，25(10):1993－2002.

［13］唐丹，李劍萍，鄭錫鳳，等.熊果酸通過STAT3通路調(diào)控胃癌細胞增殖和凋亡［J］.中國藥理學通報，2012，28(2): 179－84.

［13］Tang D，Li J P，Zheng X F，et al.Regulatory effect of ursolic acid on proliferation and apoptosisof gastric cancer cells via STAT3 signaling pathway［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(2):179－84.

［14］Prasad S，Yadav V R，Sung B，et al.Ursolic acid inhibits growth and metastasis of human colorectal cancer in an orthotopic nude mouse model by targeting multiple cell signaling pathways: chemosensitization with capecitabine［J］.Clin Cancer Res，2012，15，18(18): 4942－53.

［15］崔兵兵，程麗芳，侯立靜，等.熊果酸抑制人肝癌SMMC-7721細胞生長及凋亡的實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(18):181－4.

［15］Cui B B，Cheng L F，Hou L J，et al.Effect of ursolic acid on inhibiting growth and apoptosis in human hepatoma SMMC-7721 ［J］.Chin J Exp Tradit Med Formul，2013，19(18):181－4.

Inhibition of ursolic acid on angiogenesis and xenografts in zebrsfish(danio rerio)

CHEN Xi-qiang1，CHENG Li-fang2，XU Xin-gang2，LIU Ke-chun1，YAN Xue-sheng2，WANG Xi-min1，LIU Jin2，LI Ying2，HOU Hai-rong1，SUN Dan-dan2，HAN Li-wen1，PENG Wei-bing1
(1.Drug Screening Center of Shandong Academy of Sciences，Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensor，Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Ji’nan 250014，China; 2.Shandong Research Academy of Traditional Chinese Medicine，Ji’nan 250014，China)

Abstract:Aim To investigate the anti-angiogenesis and anti-xenograftes of UA in zebrafish larvaes.Methods 24 hour post-fertilization(hpf)TG zebrafish was treated with different concentration of UA for 24h，and the number of intersegmental vessels(IVS)were detected under fluorescent microscope respectively; then the models of AB/TG zebrafish xenografts were established by be micro-injected with SMMC-7721 or HT-29 cell at 48hpf respectively，and after cocultured with UA for 48h，optical density(OD)of the SMMC-7721 cell and subintestinal veins(SIVs)induced by HT-29 were evaluated under confocal microscope.Results ISV assay showed that UA could cause IVS missing or disapperance，inhibition ratio reaching 20. 25% and 26. 65%.UA blocked the spread of SMMC-7721 cells in zebrafish and OD value，and inhibition ratios at three concentrations were 38. 01%，54. 69%，61. 88%，respectively; in another SIVs assay induced by xenografts，UA at concentration 10 and 15mg·L－1showed that SIVs were inhibited(P＜0. 01)obviously.Conclusion UA could inhibit the angiogenesis and the growth of SMMC-7721/HT-29 xenografts，and the antitumor mechanism may be related with VEGFR2 expression.

Key words:ursolic acid; zebrafish; anti-cancer; angiogenesis; SMMC-7721 cell; HT-29 cell

作者簡介:陳錫強(1972－)，男，博士，助理研究員，研究方向:腫瘤藥理學，Tel:0531-82605352，E-mail: cxqq@ sina.com;

基金項目:國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No 2010ZX09401);國家自然科學基金項目(No 81202584);山東省科技攻關(guān)發(fā)展計劃項目(No 2011GSF11902)

收稿日期:2015－03－26，修回日期:2015－04－01

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－1004－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.023