輪葉黨參不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)

李美陽

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002)

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輪葉黨參不定根的誘導(dǎo)培養(yǎng)

李美陽

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002)

[目的]通過考察不同外植體與外源激素誘導(dǎo)輪葉黨參不定根的能力來探索輪葉黨參不定根生長的最佳條件。[方法]切取輪葉黨參無菌實生苗的葉片和莖段，接種到含有不同濃度外源激素的不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，考察不同外植體與外源激素誘導(dǎo)生根的能力，并在此基礎(chǔ)上進行不定根的誘導(dǎo)增殖。[結(jié)果]不同外植體以及不同濃度外源激素對不定根誘導(dǎo)能力不同，莖段誘導(dǎo)不定根的效果明顯優(yōu)于葉片。不同生長素對輪葉黨參不定根誘導(dǎo)的影響中，IAA對不定根的誘導(dǎo)效果優(yōu)于NAA。當(dāng)IAA濃度為1.0 mg/L時的誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最佳，莖段的生根率達到最高，可達 92%。[結(jié)論]為輪葉黨參的大規(guī)模組織培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

輪葉黨參；不定根；組織培養(yǎng)

輪葉黨參 [CodonopsislanceolataBenth.et Hook.f] 屬桔?？泣h參屬多年生藤本草本藥食兩用植物，別名山海螺、山胡蘿卜、四葉參、羊奶、羊奶參、白蟒肉、羊乳等。輪葉黨參主要以根入藥，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其根入藥具有消腫排膿、清熱解毒、補虛通乳、養(yǎng)陰潤肺及祛痰等功效[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，輪葉黨參具有降血脂、抗氧化、抗突變、抗腫瘤及提高機體免疫力的作用[3]。

隨著國際、國內(nèi)市場對輪葉黨參需求量的不斷增長，野生資源采集已遠(yuǎn)不能滿足市場的需要[4-5]。我國東北地區(qū)野生資源雖然較多，但經(jīng)過多年的采挖，資源已經(jīng)枯竭。保護輪葉黨參植物資源已成為嚴(yán)峻的問題。栽培輪葉黨參可以解決市場的大量需求，但栽培輪葉黨參仍具有生長周期長(一般為3～5年)，易受環(huán)境、季節(jié)、病蟲害影響，黨參皂苷含量不高等缺點，自20世紀(jì)70年代中期國內(nèi)外一些研究者利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)[6]進行輪葉黨參快速繁殖和品種改良，作為繼野生、栽培之后的第三代植物資源的生產(chǎn)方式——植物組織培養(yǎng)越來越受到人們的青睞。

目前，利用生物技術(shù)進行中藥資源繁殖并大規(guī)模生產(chǎn)其有效成分已成為一條新的發(fā)展途徑，但藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的弊端之一是有效成分含量的不穩(wěn)定。這主要是由于大多數(shù)有效成分均為次生代謝產(chǎn)物，其合成細(xì)胞階段表現(xiàn)不強而造成，而根培養(yǎng)可以解決這一問題[7]。根培養(yǎng)的主要優(yōu)點是具有原始植物根所具有的巨大生物合成能力，同時表現(xiàn)出明顯的代謝穩(wěn)定性和活力穩(wěn)定性[8]。近年來，國內(nèi)外通過培養(yǎng)不定根生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的研究日益活躍，此技術(shù)已在人參[9-11]等多種藥用植物應(yīng)用中得以成功。

不定根培養(yǎng)是輪葉黨參次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的有效培養(yǎng)方法。同時，加強輪葉黨參的不定根培養(yǎng)研究，可為次生代謝產(chǎn)物的大量生產(chǎn)提供原料，加速其藥用植物開發(fā)進程[12]，以提高其應(yīng)用價值，滿足生產(chǎn)和消費的需要。

筆者通過不同外源激素誘導(dǎo)不定根的能力來探尋不定根生長的最佳條件，為建立藥用植物大規(guī)模組織培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料輪葉黨參種子購自安圖青谷土特產(chǎn)專業(yè)合作社。

1.2 輪葉黨參無菌苗的獲得將冷藏儲存的輪葉黨參種子去掉邊緣種翅后用自來水沖洗30 min，直至沒有其他雜質(zhì)，在無菌操作臺上倒入75% 乙醇消毒20 s，再用2%次氯酸鈉溶液滅菌30 min，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸去多余水分，然后在無菌操作臺上接種到MS 培養(yǎng)基上，接種時應(yīng)防止種子重疊，進而發(fā)生霉變，最后放入培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照強度2 000～2 500 lx，光照時間 12 h/d。

1.3 不定根的誘導(dǎo)選取生長健壯的無菌苗于超凈工作臺上，切取不含葉腋1 cm 左右的莖段和0.5 cm2的葉片，平放于含有不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。待不定根長至1 cm左右，將其剝離下來，轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，生長素IAA濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和3.0 mg/L共6個處理；生長素NAA濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和3.0 mg/L共6個處理。所有培養(yǎng)基的蔗糖含量為30 g/L，瓊脂含量為10 g/L，初始 pH5.7。培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，暗培養(yǎng)。莖段每個處理均接種10個外植體，重復(fù) 5 次。觀察不同濃度生長素條件下的生根情況。

生根率=(生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%

1.5 不定根的繼代培養(yǎng)待不定根長至1 cm左右，將其剝離下來，轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為1/2MS+IAA 0.3 mg/L，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃下暗室培養(yǎng)，蔗糖30 g/L，pH 5.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對輪葉黨參不定根誘導(dǎo)的影響為了確定輪葉黨參不定根的最佳誘導(dǎo)部位，分別將葉片與莖段接種于含有2.0 mg/L IAA的培養(yǎng)基上，28 d后統(tǒng)計不定根生長情況(表1)。接種10 d后莖的外植體逐漸膨大，部分出現(xiàn)愈傷組織，且部分誘導(dǎo)生成不定根(圖1)。

從表1可以看出，莖段誘導(dǎo)生根率明顯高于葉片誘導(dǎo)生根率；誘導(dǎo)效果更好，兩者生根率分別是88%和44%。莖誘導(dǎo)的平均根數(shù)為4.10,明顯高于葉片誘導(dǎo)的平均根數(shù)。

表1 不同外植體在不同濃度的IAA誘導(dǎo)下生根情況

2.2 不同IAA濃度對輪葉黨參不定根誘導(dǎo)的影響因莖段誘導(dǎo)不定根的效果優(yōu)于葉片，接種外植體使用不含葉腋1 cm 左右的莖段。在接種4～5 d后，輪葉黨參外植體開始膨脹變大，部分開始卷曲，此時應(yīng)將卷曲的脫離培養(yǎng)基的部分重新按到培養(yǎng)基上，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。14 d左右輪葉黨參外植體的切口處開始出現(xiàn)愈傷化現(xiàn)象并生長出不定根。從表2可以看出，不同濃度IAA對輪葉黨參不定根的誘導(dǎo)有較大差異，具體表現(xiàn)在：每個濃度的IAA都能誘導(dǎo)出輪葉黨參的不定根，但隨著IAA濃度增加生根率也逐漸升高，當(dāng)IAA濃度為1.0 mg/L時，生根外植體數(shù)達46個，生根率為92%，每個外植體的平均根數(shù)為4.6，不定根的誘導(dǎo)效果最佳。其次為IAA濃度2.0 mg/L時生根外植體數(shù)達42個，生根率為84%。隨著IAA濃度的增加生根率反而下降。

表2 不同濃度的IAA誘導(dǎo)生根情況

2.3 不同NAA濃度對輪葉黨參不定根誘導(dǎo)的影響將輪葉黨參莖段外植體分別接種在不同濃度NAA培養(yǎng)基上，每種激素的培養(yǎng)基上切取10段無生長點、無節(jié)間的莖段，平放在培養(yǎng)基上，試驗重復(fù)5次。14 d左右輪葉黨參外植體的切口處開始出現(xiàn)愈傷化現(xiàn)象，生長出不定根，其誘導(dǎo)生根情況見表3。從表3可以看出，在低濃度下隨著NAA濃度增加，生根率逐漸增加，當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時，生根外植體數(shù)達38個，生根率達76.00%，效果最佳。其次為NAA濃度為1.0 mg/L時生根率達65.00%，但當(dāng)NAA濃度繼續(xù)增加時，生根率逐漸下降，NAA濃度為3.0 mg/L時，生根率極低，為0.02%。

表3 不同濃度的NAA誘導(dǎo)生根情況

2.4 不定根的繼代培養(yǎng)將所獲得的不定根進行繼代增殖，培養(yǎng)條件為1/2MS+IAA1.0 mg/L，蔗糖30 g/L，pH 5.7，在溫度(25±1)℃下暗培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇帶有少量愈傷組織的不定根進行繼代培養(yǎng)效果優(yōu)于缺乏愈傷組織的不定根。

3 討論

3.1 不同類型外植體的誘導(dǎo)生根輪葉黨參莖、葉均可在一定條件下誘導(dǎo)生根，但不同外植體在外源性生長素誘導(dǎo)下不定根的分化能力和生長明顯不同，表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。其中莖的誘導(dǎo)效果較好，葉段明顯弱于前者。

3.2 不同激素對不定根誘導(dǎo)的影響不定根的發(fā)生受許多因素影響，其中生長素類物質(zhì)起著重要的調(diào)控作用[13]。目前離體器官或組織在誘導(dǎo)不定根發(fā)生時，大多需要添加外源生長素、吲哚丁酸、萘乙酸等生長素類生長調(diào)節(jié)劑。研究表明，它們在施用后會影響和改變內(nèi)源生長素的水平，進而達到調(diào)節(jié)植物形態(tài)發(fā)生的目的[14]。在不同濃度的IAA和NAA試驗中，IAA對不定根誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于NAA。

4 結(jié)論

①不同外植體誘導(dǎo)不定根試驗中，莖段的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于葉片。②不同外源激素誘導(dǎo)不定根試驗中，IAA對不定根的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于NAA。③當(dāng)IAA濃度為1.0 mg/L時的誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最佳，莖段的生根率達到最高，可達 92%。

[1] 劉威.輪葉黨參栽培及管理方法[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2009，29(1)：110-112.

[2] 付成國，劉連奎，董然.輪葉黨參化學(xué)成分與藥理作用研究進展[J].中藥材，2007，30(4)：497-499.

[3] 徐惠波.輪葉黨參多糖對單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能的影響[J].吉林醫(yī)藥工業(yè)，1988，3：20.

[4] 鮑隆友.西藏黨參屬植物資源及光萼黨參栽培技術(shù)[J].中國林副特產(chǎn)，2006，3：37-39.

[5] 耿艷秋，胡國宣，孫 偉，等．長白山輪葉黨參資源及開發(fā)策略[J]．吉林農(nóng)業(yè)，2010(11)：136-137．

[6] 莊福良，姜秀麗．輪葉黨參的人工栽培技術(shù)[J]．經(jīng)濟作物，2009(5)：159-160.

[7] 袁媛，呂冬梅，黃璐琦，等.不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究[J].中國中藥雜志，2007，32(1)：65-66.

[8] 元英進.植物細(xì)胞培養(yǎng)工程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：226.

[9] HAHN E J，KIM Y S，YU K W，et al.Adventitious root cultures of Panaxginseng CV Meyer and ginsenoside production through large-scale bioreactor system[J].Plant Biotechnol，2003，5(1)：1-6.

[10] SIVAKUMAR G，YU K W，PAEK K Y.Production of biomass and ginsenosides from adventitious roots of Panaxginsengin bioreactor cultures[J].Engine Life Sci，2005，5(4)：333-342.

[11] JEONG C S，MURTHY H N，HAHN E J，et al.Inoculum size and auxin concentration influence the growth of adventitious roots and accumulation of ginsenosides in suspension cultures of ginseng(Panaxginseng CA Meyer)[J].Acta Physiol Plant，2009，31(1)：219-222.

[12] 高文遠(yuǎn)，賈偉.藥用植物大規(guī)模組織培養(yǎng)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[13] DAVIS T D，HAISSIG B E.Biology of adventitious root formation [M].New York：Plenum Press，1994：275-280.

[14] 谷瑞升，蔣湘寧，郭仲琛.植物離體培養(yǎng)中器官發(fā)生調(diào)控機制的研究進展[J].植物學(xué)通報，1999，16(3)：171-177.

Induction and Culture of Adventitious Root ofCodonopsislanceolataBenth

LI Mei-yang

(Agricultural College of Yanbian University, Yanji, Jilin 133002)

[Objective] The optimum conditions of inducing capability ofCodonopsislanceolataadventitious root were explored through the study of different explants and exogenous hormones to explore theCodonopsislanceolataadventitious root growth. [Method] Cuttings of theCodonopsislanceolataaseptic seedling leaves and stem segments were inoculated into adventitious root induction medium containing exogenous hormone at different concentration, the ability of different explants and exogenous hormones on induction of rooting were investigated, and on this basis the proliferation of adventitious root induction experiment was conducted. [Result] Different explants and various concentrations hormones have different abilities on induction of adventitious root, stem segments induced adventitious root is obviously better than the blade. Effect of different auxins onCodonopsislanceolataadventitious root induction, IAA is better than NAA on the induction of adventitious root. When the concentration of IAA for inducing culture best effect at 1 mg/L, stems rooting rate reached the highest value, up to 92%. [Conclusion] The study will lay a foundation for large scale tissue culture ofCodonopsislanceolata.

CodonopsislanceolataBenth.et Hook.f; Adventitious root; Tissue culture

李美陽(1971- )，女，吉林安圖人，講師，博士，從事植物生理方面的研究。

2014-11-19

S 567

A

0517-6611(2015)01-027-02