一起蛋雛雞皮膚型雞痘病毒與大腸埃希菌混合感染的病理學(xué)觀察

謝長(zhǎng)清，王　凱，黃紹宋，程國(guó)富，谷長(zhǎng)勤（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070）

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一起蛋雛雞皮膚型雞痘病毒與大腸埃希菌混合感染的病理學(xué)觀察

謝長(zhǎng)清，王凱，黃紹宋，程國(guó)富，谷長(zhǎng)勤＊
（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070）

摘 要：采用細(xì)菌分離技術(shù)、病理組織學(xué)觀察、PCR鑒定及致病性試驗(yàn)對(duì)臨床一例疑似雛蛋雞皮膚型雞痘混合感染進(jìn)行了確診。結(jié)果顯示，病雞眼分泌物及腳趾結(jié)痂處均分離到大腸埃希菌，內(nèi)臟器官未分離到細(xì)菌。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在皮膚痘痂和眼瞼組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞呈水泡變性，空泡化，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)圓形嗜酸性包涵體，腺胃胃壁增厚，復(fù)管腺腺腔內(nèi)可見(jiàn)局灶性的淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞聚集，肺臟淤血，散在的肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，其他內(nèi)臟器官未出現(xiàn)明顯病變。體表病灶內(nèi)PCR擴(kuò)增出1 358bp的禽痘病毒的特異性片段。將痘痂病料接種9日齡的SPF雞胚可致雞胚死亡，呈暗紅色。確診該起病例為皮膚型雞痘伴大腸埃希菌局部感染。

關(guān)鍵詞：雞痘；大腸埃希菌；病理學(xué)觀察；診斷

雞痘病毒屬于痘病毒科，為禽痘病毒屬的成員。雞痘主要侵害雞，是危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的一種重要傳染病，分為兩種型皮膚型和黏膜型［1-2］。發(fā)病后成年雞一般不死亡，雛雞病死率較高，5%～60%不等，近幾年雞痘發(fā)病呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，若混合感染、繼發(fā)感染或營(yíng)養(yǎng)不良等可造成更高的病死率［3-5］。本文報(bào)道了2013年8月份在河南汝南縣一養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)生的典型雞痘病例。試驗(yàn)觀察了自然感染雞痘病毒的雞的臨床癥狀和病理變化，并通過(guò)細(xì)菌分離、病理組織學(xué)檢查及PCR擴(kuò)增病毒的特異性片段及致病性試驗(yàn)對(duì)疑似雞痘繼發(fā)細(xì)菌感染的病例進(jìn)行了確診。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來(lái)源 5只40日齡的海藍(lán)褐病雞來(lái)源于河南汝南縣某養(yǎng)殖戶(hù)，飼養(yǎng)蛋雞500只，發(fā)病率10%左右，已死亡11只。病雞精神沉郁，羽毛蓬松，閉眼，不時(shí)的細(xì)聲尖叫。

1.1.2主要試劑 HE染色試劑一套、革蘭染液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)基、DNA提取試劑盒、PCR試劑盒及DL2000DNA Marker均購(gòu)自上海英俊生物有限公司。

1.1.3SPF雞胚 9日齡SPF雞胚購(gòu)于北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1病理學(xué)檢查 觀察臨床癥狀及剖檢變化，采集病雞皮膚結(jié)痂、心、肝、脾、肺、腎、法氏囊及腸管置于100mL/L中性福爾馬林固定液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。無(wú)菌取心血和肝組織進(jìn)行細(xì)菌分離。同時(shí)無(wú)菌采集痘痂組織-80℃保存。

1.2.2細(xì)菌學(xué)檢查 將上述的血液及肝組織無(wú)菌操作制備組織勻漿后分別涂布在選擇培養(yǎng)基（高鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂）進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)，涂片，革蘭染色、鏡檢及細(xì)菌16S RNA通用引物擴(kuò)增進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.3病毒的擴(kuò)增 DNA提?。?80℃保存組織的DNA的提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物合成：根據(jù)GenBank公布發(fā)表的禽痘病毒p4b核心蛋白基因序列（AF198100.1）。設(shè)計(jì)上游引物：5′-TAGAGGATCGTACATCCA-3′；下游引物5′-ATCTACTCATGACTGGCAA-3μL，由上海生物工程有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增目的片段的大小為1 358bp。

PCR擴(kuò)增：50μL反應(yīng)體系，模板2μL，其他按照說(shuō)明書(shū)推薦劑量。擴(kuò)增條件：94℃5min；94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃2 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.4致病性試驗(yàn) 9日齡的SPF雞胚無(wú)菌操作接種0.2mL組織懸液于尿囊膜上，接種后放置于37℃恒溫孵化箱中培養(yǎng)4d～7d，每日檢胚觀察。

2　結(jié)果

2.1病理學(xué)檢查結(jié)果

病雞精神沉郁，消瘦，羽毛蓬松，閉眼，眼瞼增厚，內(nèi)分泌物增多（圖1A），眼部及腿部出現(xiàn)大小不一，棕褐色的突起的結(jié)痂（圖1B），對(duì)病雞進(jìn)行剖檢，其內(nèi)臟器官無(wú)明顯眼觀病變。

組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，眼瞼和腿部皮膚淤血，上皮細(xì)胞變性，壞死，胞質(zhì)空泡化，內(nèi)有近圓形邊界清晰嗜酸性的包涵體（圖1C、1D），皮下及部分壞死的上皮細(xì)胞間夾雜著淋巴細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞，在腳趾皮膚表層的壞死組織內(nèi)還見(jiàn)大量的成團(tuán)堆積的藍(lán)染粉末狀的細(xì)菌團(tuán)塊（圖1E）。部分病雞（1/5）腺胃壁增厚，黏膜下層及復(fù)管腺內(nèi)可見(jiàn)淋巴樣的細(xì)胞成團(tuán)聚集（圖1F），肺輕微淤血，肝、腎組織內(nèi)有少量的實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變性、壞死，其他器官未見(jiàn)明顯病變。

2.2細(xì)菌分離及鑒定結(jié)果

在高鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂上未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，麥康凱培養(yǎng)基上可見(jiàn)有微紅色，中心呈深桃紅色的菌落，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。鏡檢為革蘭陰性桿菌，挑取單個(gè)菌落純培養(yǎng)后進(jìn)行DNA提取及擴(kuò)增，擴(kuò)增出分子量約1 500ku左右的片段，經(jīng)測(cè)序后在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示和大腸埃希菌（登錄號(hào)：NC 017634.1）同源性為98%。

2.3病毒擴(kuò)增結(jié)果

提取痘痂病料組織的DNA，用痘病毒的特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性（圖2），經(jīng)上海生物工程有限公司測(cè)序后和GenBank上報(bào)道的序列（登錄號(hào)：AF198100.1）同源性為99%。

圖1　病雞的病理學(xué)變化Fig.1 Pathological lesions in sick chickens

2.4致病性試驗(yàn)

采用上述病毒擴(kuò)增呈陽(yáng)性的病變組織懸液接種9日齡的SPF雞胚后5d雞胚死亡，死亡雞胚和正常雞胚相比體積略小，羽毛較短，全身淤血，呈暗紅色（圖3）。

圖2　禽痘病毒的特異性片段的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The specific fragment amplification results of fowl pox virus

圖3　皮膚痘痂組織接種SPF雞胚試驗(yàn)Fig.3 Skin scab tissue inoculation SPF chicken embryo experiments

3　討論

禽痘臨診主要有皮膚型、白喉型兩種病型。皮膚型雞痘雞冠、肉髯上面形成一種灰白色的、水皰樣的小斑點(diǎn)，稍突出于皮膚表面。此后斑點(diǎn)干燥結(jié)痂，痂皮連接擴(kuò)大，形成一種疣肉狀的痂塊。黏膜型雞痘，雞冠萎縮。剖檢可見(jiàn)口腔上顎出現(xiàn)潰瘍?cè)?，喉氣管?nèi)有黏液，最典型的病變是腺胃明顯腫大，腺胃乳頭出血，凸凹不平，潰瘍［6］。皮膚受損后很容易導(dǎo)致細(xì)菌的繼發(fā)感染，所以在臨床上報(bào)道較多的大腸埃希菌及葡萄球菌的混合感染［3-4］。該病例在病雞體表的破損及結(jié)痂的皮膚上也分離到大腸埃希菌，但在內(nèi)臟器官內(nèi)未分離到，說(shuō)明細(xì)菌局部感染是由皮膚天然屏障破壞后引起的。

該病例病雞在眼瞼及腿部無(wú)毛和少毛處皮膚見(jiàn)有大小不等的痘疹，喉部及各內(nèi)臟器官未見(jiàn)明顯的病理變化，排除皮膚型、白喉型混合感染的可能性［2］，結(jié)合臨床癥狀可初步診斷該病為皮膚型雞痘。病理組織學(xué)觀察，在感染部位皮膚上皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)有大量具有證病意義的嗜酸性包涵體［7-8］。鑒于目前很多疫苗都是以痘病毒作為載體，無(wú)論是細(xì)菌［6］、病毒［8，10］還是寄生蟲(chóng)［11］，因此在引物的設(shè)計(jì)上我們選擇禽痘病毒的特異性片段P4b［12］，依照前人的取材部位［6，13］，本病例從病雞體表病灶組織內(nèi)PCR擴(kuò)增出禽痘病毒的特異性P4b片段。因此確診該病例為禽痘病毒感染所致的皮膚型雞痘。

在本病例中觀察到肺臟輕微淤血可能與病雞自然死亡有關(guān)，部分肝細(xì)胞和少量的腎小管上皮細(xì)胞死亡可能與病雞失明后長(zhǎng)時(shí)間未進(jìn)食有關(guān)。對(duì)病雞的血液和內(nèi)臟器官進(jìn)行了細(xì)菌分離，但是未分到可疑的致病菌。部分病雞還表現(xiàn)腺胃腫脹，在鏡下發(fā)現(xiàn)腺胃黏膜下及復(fù)管腺內(nèi)局灶性大淋巴細(xì)胞樣的細(xì)胞聚集，這和雞的馬立克病引起內(nèi)臟的腫瘤細(xì)胞比較相似［1］，但是在其他器官內(nèi)未發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的細(xì)胞群。因?yàn)殡u群一旦感染了免疫抑制性疾病，如雞馬立克病或網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖病［14］，時(shí)常會(huì)繼發(fā)痘病毒的感染或加重疾病的嚴(yán)重程度［15］。

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Pathological Observation on Mixed Infection with Skin Type Avipoxvirus and E.coli in Layer Chicks

XIE Chang-qing，WANG Kai，HUANG Shao-song，CHENG Guo-fu，GU Chang-qin
（College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei，430070，China）

Abstract：The causes of the suspected clinical skin-type pox virus mixed infection in layer chicks were confirmed by bacterial isolation technology，histopathological observation，PCR identification and pathogenicity test.The results showed that the E.coli was isolated from the toe skin scabs and eye secretions，and no bacteria isolated from the internal organs.Histological observation found that circular eosinophilic inclusions，vesicular degeneration and cavitation appeared in the cytoplasm of the epithelial cells of the skin scabs and eyelid tissue.Glandular stomach wall was thick with lymphocyte cell-like focal cluster in the compound tubular gland，lung congestion，a few hepatocytes and renal tubular epithelial cell degeneration，necrosis were scattered，and no obvious pathological lesions appeared in other organs.In skin lesions，PCR amplification segments of the specificity of 1 358bp of fowl pox virus were confirmed.The vaccination of 9 day-old SPF chicken embryes with scab materials lead the embryo death.All these confirmed that the cases were mixed infections with skin-type chicken pox virus and E.coli.

Key words：fowl pox；E.coli；pathological observation；diagnosis

作者簡(jiǎn)介：謝長(zhǎng)清（1975-），男，湖北荊門(mén)人，碩士，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專(zhuān)項(xiàng)（201303044）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（2011PY081）

收稿日期：2014-11-18

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1007-5038（2015）06-0174-04