纖維蛋白粘合劑在犬小腸端端吻合術中對吻合口Hyp、VEGF與bFGF含量的影響

年聚盆，陳智華＊，郭慧琳，范希萍，高宇航，范彩彩，亢　心，韓　鵬，趙苗苗（.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州730070，.甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅蘭州730046）

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纖維蛋白粘合劑在犬小腸端端吻合術中對吻合口Hyp、VEGF與bFGF含量的影響

年聚盆1，陳智華1＊，郭慧琳2，范希萍1，高宇航1，范彩彩1，亢心1，韓鵬1，趙苗苗1
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州730070，2.甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅蘭州730046）

摘 要：為探討纖維蛋白粘合劑（FG）在犬小腸端端吻合術中對吻合口處羥脯氨酸（Hyp）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）含量的影響，將30只試驗犬隨機分為試驗組和對照組兩組，試驗組采用簡易縫合配合纖維蛋白粘合劑，對照組采用常規(guī)手術腸線縫合；分別于術后第3、5、7、14和28天每組隨機選取3只測定吻合口處Hyp、VEGF與bFGF的含量。術后試驗組Hyp含量在第5天顯著高于對照組（P＜0.05），bFGF的含量在第3天、第5天、第7天顯著高于對照組（P＜0.05），VEGF含量在第3天和第5天高于對照組（P＜0.01），在第14天和第28天顯著低于對照組（P＜0.01）。結果表明，應用簡易縫合配合纖維蛋白粘合劑吻合腸管，可促進吻合口處小腸組織內(nèi)羥脯氨酸、血管內(nèi)皮因子和堿性成纖維細胞生長因子的分泌，從而加速吻合口的愈合。

關鍵詞：纖維蛋白粘合劑；小腸端端吻合術；羥脯氨酸；血管內(nèi)皮生長因子；堿性成纖維細胞生長因子

纖維蛋白粘合劑（fibrin glue，F(xiàn)G）又稱生物膠（biological glue），主要成分包括纖維蛋白原、ⅩⅢ因子、抑肽酶、凝血酶和鈣離子。經(jīng)氯化鈉溶解后的纖維蛋白原在凝血酶和被活化的ⅩⅢ因子作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的纖維蛋白多體，模擬血凝的最后階段反應產(chǎn)生凝血和止血作用，并參與體內(nèi)一系列的病理生理過程，如炎癥、組織損傷、修復等［1-2］。近年來FG被應用于不同的外科領域來止血、促進傷口愈合、封閉缺損、防止粘連和作為藥物緩釋載體等［3-4］。羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）、血管內(nèi)皮生長因子（vasc ular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）作為創(chuàng)傷愈合中重要的細胞因子，加快創(chuàng)口膠原沉積，修復損傷組織，加速損傷部位微血管重建，在組織里的含量反映了創(chuàng)傷愈合的速度［5-7］。為了探討在小動物臨床上的應用價值，本試驗將FG應用于犬的小腸端端吻合術中，改進常規(guī)腸吻合的方法，以提高腸吻合術后的愈合質(zhì)量，減少術后并發(fā)癥。通過在簡單縫合的基礎上配合纖維蛋白粘合劑，與常規(guī)手術縫合方法進行對比，檢測Hyp、VEGF、和bFGF的含量變化，觀察FG在犬小腸吻合術中的應用效果，并探討其促進腸吻合口愈合的作用機制，為獸醫(yī)臨床應用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 豬源纖維蛋白原粉為甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院臨床實驗室提取，純度＞85%；凝血酶原（500IU/mL）為廣州白云山醫(yī)用膠公司生產(chǎn)；抑肽酶（4 500kIU/mg）為上海晨易生物科技有限公司產(chǎn)品；蔗糖為鄭州康源化工產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；氯化鈣為天津市大茂化學試劑廠生產(chǎn)；9g/L氯化鈉為四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（國藥準字：H51021157）；陸眠寧Ⅰ（獸藥字：2009-070011777）為吉林省華牧動物保健品有限公司生產(chǎn)；紅霉素軟膏（國藥準字H33020377）為四川美大康華康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；犬羥脯氨酸、犬血管內(nèi)皮因子、犬堿性成纖維細胞生長因子ELSA試劑盒均由上海滬鼎生物科技公司生產(chǎn)。

1.1.2主要儀器 分析天平為西安天力儀器廠生產(chǎn)；勻漿機（型號：T10）為廣州儀科實驗技術有限公司生產(chǎn)；離心機（型號：TDZ5-WS）為湘儀離心機；移液槍為美國熱電公司產(chǎn)品；酶標儀（State Fax-2100）；超凈工作臺（型號：ZHJH-1112C）為深圳市華弘特凈化技術有限公司產(chǎn)品；常規(guī)軟組織手術器械包。

1.2方法

1.2.1動物分組 30只犬均購自蘭州市畜禽交易市場，安靜飼養(yǎng)1周后未出現(xiàn)任何疾病，隨機分為對照組和試驗組，每組各15只，所有犬均飼喂全價犬糧，自由飲水，籠養(yǎng)于通風良好的圈舍內(nèi)，試驗前禁食24h，禁水2h。

1.2.2手術方法 犬全身麻醉，仰臥保定，術部常規(guī)備皮，術部切口在臍前腹中線，常規(guī)開腹，顯露并截斷空腸。采用不同方法行空腸端端吻合術：對照組采用常規(guī)縫合，用腸線對兩腸管斷端行單層間斷內(nèi)翻縫合16針；試驗組采用簡易縫合配合FG粘合，具體方法為助手于腸管吻合術前15min，配制FG的A液和B液（A液中含纖維蛋白原188.20 mg、抑肽酶1.33mg、生理鹽水1.00mL；B液中含凝血酶原1.00mg、氯化鈣9.2g、生理鹽水1.00 mL）并用雙聯(lián)注射器分別吸取備用。用腸線對兩腸管斷端進行等距離單層間斷內(nèi)翻縫合6針，用平鑷捏合固定相鄰線結之間的吻合口，逐段涂布適量FG，捏合10s，完成吻合。試驗組與對照組均需確保吻合口處腸管閉合嚴密。清理吻合口與創(chuàng)口后，常規(guī)關腹。犬術后佩戴伊麗莎白圈，禁食12h～24h后開始飼喂流質(zhì)食物，3d后恢復正常飲食，不限制飲水，安靜飼養(yǎng)，青霉素4萬單位/kg，肌肉注射，2次/d。

1.2.3術后觀察及樣品收集 術后密切觀察犬的精神狀態(tài)，飲食和飲水狀況，在第3、5、7、14和28天每組各隨機選取3只犬，由原切口進腹，仔細觀察腸吻合口處與周圍組織有無粘連，并截取前后距吻合口0.5cm原吻合段腸，橫切等分為3部分，做好標記后分別保存在-70℃冰箱中備用。

1.2.4bFGF、VEGF和Hyp含量的測定 3種細胞因子的含量測定均按試劑盒說明書進行操作：取含有吻合段的腸管2g，每克加入pH為7.4的PBS 9mL后先勻漿，然后離心得上清液，置于EP管內(nèi)，在酶標包被板上準確加入50μL標準品，待測樣品孔中先加入40μL樣品稀釋液，然后再加待測10μL樣品（樣品最終稀釋度為5倍），用封板膜封板后放至37℃恒溫箱中溫育30min，小心揭掉封板膜，倒掉液體，甩干，將洗滌液加滿每孔，靜置30s后棄去拍干，重復5次，每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外，再進行溫育、洗滌，每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min，然后每孔加終止液50μL，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色），最后以空白孔調(diào)零，選擇450nm波長用酶標儀測量各孔的吸光度（OD值），記錄所得數(shù)據(jù)，按照標準品的讀數(shù)繪制標準曲線，然后計算出細胞因子的含量。

1.2.5試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 采用SPSS系統(tǒng)統(tǒng)計軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，各組間和組內(nèi)比較用方差分析，所得結果以平均數(shù)標準差表示。樣本均數(shù)比較采用t檢驗，當P＜0.05時，差異顯著，當P＜0.01時，差異極顯著。

2　結果

2.1大體觀察

術后所有試驗犬均成活，在同一時間點試驗組與對照組相比，試驗組所有犬只腸管吻合口處均未發(fā)生粘連，在同樣的飼養(yǎng)條件下均未發(fā)生梗阻，而對照組所有犬只腸管吻合口處均有不同程度的粘連，且有1只試驗犬在術后28d時發(fā)生腸梗阻。

2.2Hyp、VEGF和bFGF含量的分析

術后試驗組羥脯氨酸含量高于對照組（表1），在第5天差異顯著（P＜0.05）；血管內(nèi)皮因子含量在第3天和第5天時試驗組顯著高于對照組（P＜0.01），第7天時低于對照組，而第14天和第28天時顯著低于對照組（P＜0.05）；試驗組堿性成纖維細胞生長因子含量在各時間點均高于對照組，在第3天、第5天和第7天時差異顯著（P＜0.05）。

表1　術后Hyp、VEGF和bFGF在各時間點的含量Table 1 Contents of Hyp，VEGF and bFGF at each time point after operation

3　討論

目前，由于自制FG的強度不足，單純應用FG無法完成腸吻合術，因此本試驗中試驗組采取簡單縫合配合FG粘合的方法進行小腸吻合術，這種方法通過減少縫合針數(shù)及縫線數(shù)量，并利用FG封閉和止血的作用減少術中和術后吻合口的滲血量，有效降低腸線對吻合口造成的炎性反應，減少吻合口與周圍組織的粘連；由于對照組沒有使用FG，術后吻合口的滲血導致對照組所有犬只腸管吻合口處均發(fā)生了不同程度的粘連，而且縫線縫合不僅造成吻合口處血液循環(huán)受阻，使炎癥滲出期延長，參與炎癥反應的巨噬細胞、T淋巴細胞還通過釋放多種介質(zhì)，刺激成纖維細胞增殖及增強血管內(nèi)皮細胞的活性，導致瘢痕的過度增生，增加了術后發(fā)生梗阻的幾率［8］，研究表明，在創(chuàng)傷愈合中應用FG可以減少瘢痕形成［9］，本試驗中對照組1只犬在28d時發(fā)生腸梗阻，原因可能是由于對照組腸管吻合口處過多縫線加重了炎性反應，并且影響吻合口處的血液循環(huán)，不利于術后吻合口腸管重建，造成瘢痕在吻合口處過度形成，并且該犬本來腸管就較狹窄，進而導致吻合口處狹窄，造成腸梗阻。

羥脯氨酸是膠原的主要成分，其含量與膠原的量呈正相關。而膠原合成是創(chuàng)傷愈合的關鍵步驟之一。本研究中試驗組HYP含量整體上高于對照組，且在第5天時Hyp含量顯著高于對照組（P＜0.05），說明在各時間點試驗組新生膠原的量大于對照組，這是因為對照組采用單純腸線縫合，造成吻合口處的炎性反應較試驗組嚴重，而炎性細胞是膠原酶和其他降解酶的主要來源，所以吻合口處的炎癥反應不利于膠原的合成，研究表明在腸吻合愈合過程中既存在膠原降解也存在膠原合成，當膠原的合成大于降解則有利于吻合口的愈合［10-11］。由于試驗組中FG的使用，降低了吻合口處的炎性反應，加快了膠原的生成，因此HYP的含量在每一時間點都高于對照組，而在第5天顯著高于對照組可能是因為膠原的合成量遠遠大于降解量，更說明了試驗組由于使用了FG使整個愈合期縮短并提前。

血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）是與血管再生密切相關的重要細胞因子之一，能夠刺激和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞分裂、增殖，促進新血管的生成，提高微血管的通透性，加快組織細胞與血管內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的交換，對創(chuàng)傷局部組織的修復發(fā)揮關鍵性生物學功能［12-14］。本試驗中VEGF含量在第3天和第5天時試驗組顯著高于對照組（P＜0.01），第7、14和28天時試驗組低于對照組，這是由于試驗組應用FG，減少縫線數(shù)量，可以加快VEGF因子的合成，術后大量的VEGF可以促進吻合口加速愈合，隨著吻合口的修復，VEGF含量降到了正常水平，所以在術后第7、14和28天時含量又低于對照組，而對照組VEGF含量一直是遞增的，說明過多縫線的刺激減少了VEGF的合成，隨著時間推移，炎性反應降低，VEGF的合成量緩慢增加，推后了整個愈合的進程，因此VEGF含量水平和吻合口整個愈合進程相一致。這一結果與潘云松［15］的研究結果相似。結果表明FG可以促進吻合口組織合成大量的VEGF，促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷徙和分化，新生大量的微血管，促進吻合口愈合，降低吻合口處的炎性反應，快速修復了吻合口，使吻合口可以在較短的時間恢復到正常水平，而縫線不利于VEGF的合成，導致新生血管的數(shù)量較少，吻合口處炎性反應期延長，不利于組織的修復，延長了修復組織的時間。

堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）是一種廣泛存在于人體內(nèi)細胞外間質(zhì)中的生長因子，其含量甚微，但對胚胎發(fā)育及組織的修復起重要作用，因此bFGF可以作為反應創(chuàng)傷愈合的細胞因子。本試驗表明：術后各時間點試驗組bFGF含量均高于對照組，在第3、5和14天顯著高于對照組（P＜0.01），說明術后第3天試驗組就已經(jīng)有大量的成纖維細胞增生，到第14天時增長量相比對照組達到最大，這是由于試驗組在使用FG后，可促進bEGF因子的合成，從而進一步加快腸吻合口的愈合速度，對照組的縫線減少了bFGF生成，減緩了吻合口愈合的進程。章婓然等［16］也做過類似的研究，將bFGF應用在兔回腸吻合，取得了相同的效果。江濤等［17］把纖維蛋白膠和生長素用于腹腔感染條件下大鼠的腸吻合，也取得了滿意的效果。

綜上所述，F(xiàn)G應用于腸吻合術，可減少因腸線造成的炎性反應，并通過調(diào)節(jié)加速成纖維細胞增殖和毛細血管的再生，促進吻合口膠原纖維的生成，通過一系列的改建降低炎性反應造成的破壞，提高吻合口的愈合質(zhì)量；降低了吻合口狹窄等并發(fā)癥的發(fā)生率，為FG的動物臨床應用提供了理論依據(jù)。但目前對于bFGF、VEGF和Hyp在小腸吻合術中變化的機制有待進一步的研究。

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Effect of Fibrin Glue on Contents of Hydroxyproline，Vascular Endothelial Growth Factor and Basic Fibroblast Growth Factor in Anastomotic Stoma After Canine Small Intestine End to End Anastomosis

NIAN Ju-pen1，CHEN Zhi-hua1，GUO Hui-lin2，F(xiàn)AN Xi-ping1，GAO Yu-hang1，F(xiàn)AN Cai-cai1，KANG Xin1，HAN Peng1，ZHAO Miao-miao1
（1.College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu，730070，China；2.Gansu Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention，Lanzhou，Gansu，730046，China）

Abstract：In order to explore the influence of fibrin glue on the contents of hydroxyproline（Hyp），vascular endothelial growth factor（VEGF）and basic fibroblast growth factor（bFGF）after the small intestine endend anastomosis，30dogs were randomly divided into experimental group and control group.The experimental group was manipulated with simple suture with FG，while the control group was only routinely sutured.On day 3，5，7and 14，samples of the surgical interface of 3dogs from each group were taken to detect the contents of Hyp，VEGF and bFGF.On day 5and day 3，5and 7，the contents of Hyp and bFGF of the experimental group were significantly higher than that of the control group（P＜0.05），respectively. While the contents of VEGF of the experimental group were significantly higher than that of the control group on day 3and 5（P＜0.01）but lower than that of the control group on day 14and 28（P＜0.01）. These results showed that routine end-end anastomosis combined with FG could accelerate tissue healing process through promoting the of Hyp，VEGF and bFGF secretios.

Key words：fibrin glue；intestinal anastomosis；Hyp；VEGF；bFGF

作者簡介：年聚盆（1990-），男，甘肅定西人，碩士研究生，主要從事小動物疾病診療技術研究。＊

通訊作者

基金項目：甘肅省農(nóng)牧廳生物技術專項（GNSW-2011-26）

收稿日期：2014-11-25

中圖分類號：S857.12

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）05-0048-04