副豬嗜血桿菌OmpP2基因的克隆及生物學(xué)信息分析

陶 政，曾文斌，劉悅欣，左明開，幸文定，白帥州，王 萍

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045）

副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPS）是豬Glasser病的病原體，在仔豬群體中具有很高的發(fā)病率和病死率，臨床表現(xiàn)為多發(fā)性纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎［1］。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)模式的發(fā)展，HPS已經(jīng)成為影響?zhàn)B豬業(yè)的主要細(xì)菌之一，近幾年，副豬嗜血桿菌病在中國日趨流行，很多地區(qū)分離到該病原體［2-5］。副豬嗜血桿菌血清型復(fù)雜多樣，中國流行的優(yōu)勢血清型為4、5、12、13型，與國外的優(yōu)勢血清型4、5、13基本相同并存在差異［6］。

目前預(yù)防該病的疫苗為滅活疫苗，但是副豬嗜血桿菌的血清型多樣，不同血清型之間缺乏交叉免疫保護(hù)，副豬嗜血桿菌滅活疫苗只對同一血清型的菌株具有保護(hù)作用［7］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，疫苗的研究方向也轉(zhuǎn)向基因工程疫苗。副豬嗜血桿菌的主要毒力因子包括外膜蛋白、莢膜多糖、脂多糖、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、神經(jīng)氨酸酶等［8-11］。其中外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）是革蘭陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)，具有良好的免疫原性，可同時(shí)激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，具有異種血清型的免疫交叉保護(hù)作用，是一種潛在的共同保護(hù)性抗原。而Tadjine M等［12］報(bào)道該病原菌的15個(gè)血清型均與一個(gè)主要的外膜蛋白反應(yīng)，這個(gè)蛋白屬于革蘭陰性菌的Omp家族，表明這個(gè)蛋白也許會(huì)成為一個(gè)很好的診斷標(biāo)記的候選蛋白。

本試驗(yàn)分離鑒定的HPS血清13型江西分離株JXGZ03中克隆了OmpP2基因，在此基礎(chǔ)上綜合應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測其蛋白質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)，分析其基因結(jié)構(gòu)及功能。為今后進(jìn)一步開展HPS的分子生物學(xué)功能研究、新型疫苗的研制、快速診斷方法的建立等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 江西HPS血清13型分離株JXGZ03由本實(shí)驗(yàn)室保存，載體pMD18-T購自寶生物工程（大連）有限公司；感受態(tài)細(xì)胞Top10菌株購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 酶及主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoI、rTaqDNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄的HPS血清13型OmpP2基因序列（登錄號：GU323699），利用Primmer3.0在線軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成一對引物：上游 引物：5′-GAATTCATGAAAAAAACACTAGTAGC-3′；下游引物：5′-CTCGAGTTAC-CATAATACACGTAAACC-3′。上、下游引物的5＇端分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)（下劃線處），該引物擴(kuò)增具有完整ORF的OmpP2的基因片段。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增與克隆 PCR模板為用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取。PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×buffur 2.5μL，dNTPs（2.5mmol／L）1μL，上、下游引物（10μmol／L）各1.0μL，模板DNA1.0μL，TaqDNA 聚合酶0.25μL，無菌水18.25μL；PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，56℃30s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增后，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10g／L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄結(jié)果。采用DNA回收純化試劑盒，回收純化擴(kuò)增片段，將純化后的目的基因片段與載體pMD18-T于16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，涂布于含AMP的LB的固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12h～16h后。挑取生長良好的單個(gè)菌落接種于含AMP的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，進(jìn)行菌液PCR及提取質(zhì)粒酶切鑒定。將陽性克隆質(zhì)粒命名為pMD18-T-OmpP2，并送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.3 序列比對分析 利用DNA Star軟件中的SeqMan對已獲得的OmpP2序列片段進(jìn)行拼接，并推導(dǎo)其氨基酸序列；運(yùn)用DNAStar軟件MegAlign程序?qū)enBank已發(fā)表的15株副豬嗜血桿菌OmpP2的基因序列進(jìn)行比對和分析。同時(shí)，運(yùn)用MEGA6軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 OmpP2生物學(xué)信息分析 利用ProtParam（http：／／web.expasy.org／protparam／）分析氨基酸序列的理化性；用在線軟件TMpred（http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html）預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向；利用Protscale（http：／／web.expasy.org／protscale／）分析蛋白質(zhì)親疏水性；利用 SignalP 4.1Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）分析蛋白的信號肽；利用NetPhos（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Net-Phos／）分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；利用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（http：／／npsa-pbil.ibcp.fr／cgi-bin／npsa＿automat.pl？page＝／NPSA／npsa＿h(yuǎn)nn.html）預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用Smart（http：／／smart.embl-heidelberg.de／）分析預(yù)測氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；利用phyre2（http：／／www.sbg.bio.ic.ac.uk／phyre2／html／page.cgi？id＝index）預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR結(jié)果

電泳結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增出大小約為1 092bp的OmpP2基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

圖1 OmpP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of OmpP2gene

2.2 克隆產(chǎn)物雙酶切鑒定

將目的基因片段與載體pMD18-T連接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞TOP10后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，擴(kuò)增出1 092bp的目的基因片段。再對提取的pMD18-TOmpP2重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，分別切出了1 092bp的目的片段和2 692bp載體片段（圖2），表明所克隆的目的基因已成功插入到pMD18-T載體中。

圖2 pMD18-T-OmpP2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2 Analysis of recombinant plasmid pMD18-T-OmpP2 by double enzyme digestion

2.3 基因序列分析

將重組克隆質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定，利用SeqMan軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，得到的OmpP2基因核苷酸序列及氨基酸序列（圖3）。本次克隆得到的OmpP2基因序列與GenBank中副豬嗜血桿菌登錄的外膜蛋白OmpP2基因序列進(jìn)行比對分析（圖4），與其他HPS OmpP2的核苷酸同源性達(dá)到98.7%～100%。利用MEGA6繪制其遺傳進(jìn)化樹（圖5），結(jié)果表明與F641（湖北株）之間親緣關(guān)系最近。

圖3 OmpP2編碼氨基酸序列Fig.3 The encoding amino acid sequence of OmpP2

圖4 OmpP2基因核苷酸序列同源性比較Fig.4 Homology comparison of OmpP2gene nucleotide sequence

2.4 OmpP2基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.4.1 OmpP2基因編碼蛋白的理化性質(zhì) 運(yùn)用軟件Expasy開發(fā)的針對蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的分析，HPS-OmpP2基因編碼的氨基酸序列含氨基酸數(shù)目共364個(gè)，分子質(zhì)量為39 138.5u，理論等電點(diǎn)pI為9.14；該蛋白質(zhì)由19種氨基酸組成，其中Gly含量最豐富（12.4%），Trp含量最少（0.6%）；總的帶負(fù)電荷殘基和帶正電荷殘基分別是38個(gè)和46個(gè)；不穩(wěn)定指數(shù)為18.52，說明此分類蛋白質(zhì)穩(wěn)定。脂肪族系數(shù)為71.18；其總平均疏水指數(shù)為-0.482，為親水性蛋白。

2.4.2 跨膜結(jié)構(gòu)分析 跨膜結(jié)構(gòu)是膜中蛋白與質(zhì)膜蛋白結(jié)合的主要部位，起著將蛋白固定于細(xì)胞膜上的作用，跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析，對認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、分類及在細(xì)胞中的作用部位均有一定的意義。利用在線軟件Tmpred預(yù)測蛋白跨膜區(qū)域結(jié)果顯示（圖6），OmpP2基因編碼的蛋白由內(nèi)向外有一個(gè)可能的跨膜螺旋區(qū)域?yàn)?-23aa，中心在19位，預(yù)測分值為1 863（大于500）；由外向內(nèi)有一個(gè)可能的跨膜螺旋區(qū)域?yàn)?-22aa，中心在19位，預(yù)測分值為1 536（大于500）；TM-螺旋長度在17-33aa。

圖5 OmpP2基因核苷酸序列分子進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of OmpP2gene

圖6 OmpP2蛋白跨膜區(qū)分析Fig.6 The transmembrane domain analysis of OmpP2protein

2.4.3 OmpP2蛋白質(zhì)的親疏水性分析 運(yùn)用軟件ExPASy的ProtScale程序?qū)mpP2基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親疏水性分析（圖7），正值為疏水，負(fù)值為親水，結(jié)果顯示該蛋白具有多個(gè)高親水性區(qū)域，且氨基酸序列絕大多數(shù)為親水性殘基，表明OmpP2蛋白質(zhì)為水溶性蛋白質(zhì)。

圖7 OmpP2蛋白親／疏水性分析Fig.7 The hydrophilicity analysis of OmpP2protein

2.4.4 OmpP2蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果 通過SignalP 4.1（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Signa lP／）進(jìn)行蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測。分析表明，該基因包含由20個(gè)氨基酸組成的信號肽（圖8）。信號肽是存在于蛋白質(zhì)N端的一段決定蛋白質(zhì)分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)的額外氨基酸序列，前體蛋白質(zhì)正確定位后，信號肽被切除，同時(shí)蛋白質(zhì)經(jīng)過折疊等立體構(gòu)象的變化，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓牡鞍踪|(zhì)。信號肽不僅可引導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌，且對其正確折疊有一定的作用。

2.4.5 OmpP2潛在的磷酸化位點(diǎn)分析 用Net-Phos 2.0Server進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，結(jié)果表明有12個(gè)絲氨酸（Ser）、5個(gè)蘇氨酸（Thr）和9個(gè)絡(luò)氨酸（Tyr）位點(diǎn)，可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（圖9）。

圖8 OmpP2蛋白信號肽預(yù)測Fig.8 Signal peptide prediction of OmpP2protein

2.4.6 OmpP2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 本試驗(yàn)使用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（HNN）預(yù)測OmpP2蛋白二級結(jié)構(gòu)（圖10）。表明該蛋白含有α-螺旋（h表示）占17.08%、無規(guī)則卷曲（c表示）占55.65%和延伸鏈（e表示）占27.27%。

2.4.7 OmpP2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域 Smart分析結(jié)果（圖11）顯示，OmpP2的4-345位是Pfam-Porin-4結(jié)構(gòu)域。

圖9 OmpP2蛋白磷酸化位點(diǎn)Fig.9 Phosphorylation sites of OmpP2protein

2.4.8 OmpP2三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過Phyre2軟件在線預(yù)測OmpP2三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該序列和d2fgqx1模板同源性最高，基于該模板預(yù)測315個(gè)殘基（87%的序列）已被建模，可信度100%（圖12）。

3 討論

圖10 OmpP2基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 The secondary structure prediction of OmpP2gene encoded protein

圖11 OmpP2蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.11 The domain prediction of OmpP2protein

圖12 OmpP2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.12 The predicted tertiary structure of OmpP2protein

外膜蛋白是革蘭陰性菌外膜的重要組成成分，在致病性和免疫原性方面發(fā)揮著重要的作用，一直是國內(nèi)外科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)［13］。目前流感嗜血桿菌OmpP2蛋白的生理功能和致病機(jī)理的研究較為透徹OmpP2是流感嗜血桿菌的一個(gè)毒力因子，是逃避宿主補(bǔ)體殺傷和參與宿主細(xì)胞的黏附作用的一個(gè)重要免疫原性蛋白［14］。最新研究表明流感嗜血桿菌OmpP2膜外結(jié)構(gòu)域能激活宿主細(xì)胞的信號通路分子并誘導(dǎo)促炎癥因子的表達(dá)，表明了OmpP2蛋白在病原菌致病性中起著重要作用［15］。美國學(xué)者M(jìn)cVicker等在進(jìn)行流感嗜血桿菌的OmpP2蛋白單克隆抗體研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該單克隆抗體可與副豬嗜血桿菌菌體蛋白發(fā)生反應(yīng)，且不同毒力菌株反應(yīng)蛋白大小有所不同，在有毒力HPS菌株中OmpP2蛋白為48ku，而在非毒力菌株中卻為55 ku，并預(yù)期OmpP2蛋白可用來區(qū)分HPS毒力與非毒力菌株［16-17］。副豬嗜血桿菌中關(guān)于該蛋白的功能卻研究的較少。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，生物信息學(xué)已成為推動(dòng)基因組學(xué)和后基因?qū)W研究的一種重要技術(shù)［17］。

本研究通過PCR方法擴(kuò)增得到了HPS血清13型江西分離株JXGZ03中的OmpP2基因序列，成功獲得了長1 092bp的OmpP2基因，編碼364個(gè)氨基酸，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量理論值為39 138.5u，理 論 等 電 點(diǎn) 為 9.14；與 其 他 HPS OmpP2的核苷酸同源性達(dá)到98.7%～100%，遺傳進(jìn)化樹表明與F641（湖北株）之間親緣關(guān)系最近；Tmpred預(yù)測該蛋白由內(nèi)向外和由外向內(nèi)各有可能一個(gè)跨膜區(qū)域；ProtScale分析OmpP2蛋白具有多個(gè)高親水性區(qū)域，且氨基酸序列絕大多數(shù)為親水性殘基，表明OmpP2蛋白質(zhì)為水溶性蛋白質(zhì)；通過SignalP 4.1分析表明，該基因包含由20個(gè)氨基酸組成的信號肽，屬于分泌性蛋白；NetPhos進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析表明有12個(gè)絲氨酸（Ser）、5個(gè)蘇氨酸（Thr）和9個(gè)絡(luò)氨酸（Tyr）位點(diǎn)，可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；使用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（HNN）預(yù)測OmpP2蛋白二級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主；該蛋白保守域4-345氨基酸殘基是Pfam-Porin＿4結(jié)構(gòu)域；應(yīng)用Phyre2軟件成功模擬出OmpP2蛋白的3D結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探索該蛋白結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

本研究首次克隆了江西血清13型HPS OmpP2基因，利用生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，不僅了解了江西省流行的HPS OmpP2的分子特征，豐富了我國副豬嗜血桿菌的遺傳信息資料，也為OmpP2功能的進(jìn)一步研究及研制副豬嗜血桿菌新型的基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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