結(jié)核分支桿菌Rv3117基因的克隆與原核表達

劉 楊，宋紀偉，曾范利，時 坤，李健明，杜 銳，4＊

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118；2.吉林市人民醫(yī)院，吉林吉林 132001；3.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春 130118；4.教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，吉林省藥用動物二級實驗室，吉林長春 130118）

鹿結(jié)核病（Deer tuberculosis）是由結(jié)核分支桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）引起的一種慢性、傳染性疾病，該病呈世界分布，給養(yǎng)鹿業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失［1-2］。我國鹿結(jié)核病檢測目前尚無規(guī)定性的診斷方法，主要采取結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗。但該方法存在諸多問題，如只能進行活體試驗，不能區(qū)分各種分支桿菌，不能對保存的樣品進行回顧性分析，尤其是它的特異性較低，經(jīng)BCG免疫的鹿變態(tài)反應(yīng)檢測均呈現(xiàn)陽性［3-5］，因此，不能從免疫過的動物中檢測出患病動物，致使結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的特異性受到質(zhì)疑［6-9］。為解決以上難題，人們對鹿結(jié)核分支桿菌進行探索性試驗，期望能找到鹿結(jié)核病檢測的新方法。

2012年，湯俊明等研究發(fā)現(xiàn)了一個活性較強的B細胞抗原Rv3117［10］，雖然已進行了初步研究，但有關(guān)Rv3117抗原性的研究國內(nèi)外鮮有報道。Rv3117是RD5區(qū)編碼的蛋白［11-12］，該基因存在于結(jié)核分支桿菌中，而在卡介苗中缺失。本研究成功構(gòu)建了pGEX-4T-1-Rv3117重組質(zhì)粒，并對其進行誘導(dǎo)表達，對獲得的目的蛋白進行抗原性分析，以期該重組蛋白成為結(jié)核病診斷研究候選抗原的可能。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)核分支桿菌H37Rv菌株購自中國獸醫(yī)菌種保藏中心；pGEX-4T-1載體由軍事獸醫(yī)研究所惠贈；E.coliBL21感受態(tài)細胞、pMD-18TVector、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、EcoRⅠ、SamⅠ等限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒杭州維特潔生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品；鹿結(jié)核多克隆抗血清和HRP標記的兔抗鹿IgG由吉林農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟動物疫病實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分支桿菌的培養(yǎng)和染色體DNA的提取 將結(jié)核分支桿菌H37Rv接種于改良羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)。6周后按照如下方法對染色體DNA進行抽提：取100mL液體培養(yǎng)菌于85℃水浴中滅活1h；5 000r／min離心集菌15min；將沉淀用2.5 mL TE buffer溶解，于-20℃凍存4h使溶菌酶更為有效；加入0.5mL TE buffer溶解懸浮細胞；再加入等量的氯仿、甲醇（2∶1）搖勻；5 000r／min離心20min，去除上下兩層，留下中間的細胞層；將細胞層于55℃開蓋水浴10min～15min，以去除有機溶劑；加入0.5mL TE buffer劇烈振蕩；加入50μL的pH 為9.0的 Tris-HCl和10μL濃度為50 mg／mL的溶菌酶，37℃孵育12h～16h，加入后勿振蕩；加入0.1體積濃度為100mL／L的SDS和適量的蛋白酶K裂解液；加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1），輕輕搖勻30min；5 000r／min離心30min，小心吸取水相；用2.5倍體積700mL／L的乙醇沉淀2h；1 000r／min離心10min，沉淀用30μL的TE buffer溶解，于-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中的結(jié)核分支桿菌H37Rv株的Rv3117的基因序列設(shè)計

1.2.3 目的基因的PCR擴增及產(chǎn)物的純化 以結(jié)核分支桿菌H37Rv染色體DNA為模板，以P1、P2為引物，對Rv3117基因進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共35個循環(huán)；最后再于72℃延伸10min。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并用DNA回收純化試劑盒對其進行純化，操作方法按產(chǎn)品說明書進行。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將上述純化的PCR產(chǎn)物與pMD-18TVector連接，轉(zhuǎn)化E.coliJm109感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒pMD18TRv3117。經(jīng)酶切和PCR鑒定的重組質(zhì)粒并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，用EcoRⅠ和SamⅠ酶切pMD18T-Rv3117并應(yīng)用凝膠回收Rv3117片段，將其連入經(jīng)酶切處理的pGEX-4T-1載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)酶切和PCR鑒定后獲得重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Rv3117。

1.2.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達和SDS-PAGE分析將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Rv3117轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細胞，涂布于Amp＋（50mg／mL）的LB瓊脂平板上，挑取單菌落接種于5mL Amp＋的LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖OD600約0.6。加IPTG至終濃度為1mmol／L，繼續(xù)振搖6h，離心集菌，用SDSPAGE電泳分析重組蛋白質(zhì)的表達情況，同時設(shè)pGEX-4T-1空載體和IPTG誘導(dǎo)前的轉(zhuǎn)化菌作為對照。

1.2.6 Western blot分析 表達產(chǎn)物經(jīng)120mL／L的SDS-PAGE后，按文獻［13］的方法轉(zhuǎn)印至PVDF移膜上，經(jīng)牛血清白蛋白（BSA）封閉后，依次加入鹿結(jié)核多克隆抗血清、辣根過氧化物酶標記兔抗鹿IgG，最后在聯(lián)苯胺（DAB）溶液中顯色。一對引物。引物由上海生物工程股份有限公司合成。其序列如下：

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Rv3117為模板，P1，P2為引物進行PCR擴增，得到約800bp的基因片段（圖1）。以EcoRⅠ和SamⅠ雙酶切pGEX-4T-1-Rv3117重組質(zhì)粒，得到約4 900bp的pGEX-4T-1載體片段和800bp的插入片段（圖1）。序列測定證實該DNA片段大小為834bp，與GenBank中MycobacteriumtuberculosisH37Rv株 Rv3117 基因序列的同源性為100%。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Rv3117的PCR和雙酶切鑒定Fig.1 PCR and double restriction enzyme digestion identification of recombinant plasmid pGEX-4T-1-Rv3117

2.2 SDS-PAGE分析

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pGEX-4T-1-Rv3117于E.coliBL21中在各時間的表達情況見圖2，Rv3117基因獲得了表達，其表達量隨誘導(dǎo)時間的延長而增加，誘導(dǎo)6h達到高峰，融合蛋白的相對分子量約為60 ku（含約30ku的pGEX-4T-1部分肽段和約30ku的Rv3117肽段），與預(yù)期結(jié)果相一致。而對照的含空載體的pGEX-4T-1的E.coliBL21和誘導(dǎo)前則未見該蛋白質(zhì)表達。

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 Identification of recombinant protein by SDS-PAGE

2.3 Western blot分析

表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)移膜上，以鹿結(jié)核多克隆抗血清為一抗，辣根過氧化物酶標記的兔抗鹿IgG的抗體為酶標二抗，聯(lián)苯胺（DAB）為底物，進行蛋白印跡分析（圖3）。從圖中可見約60ku處有一條明顯的蛋白印跡帶，說明該表達產(chǎn)物具有結(jié)核分支桿菌抗原性。

圖3 表達蛋白的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of expressed protein

3 討論

在鹿結(jié)核病早期，對其進行快速、精確的診斷，可以降低其致病率和病死率，目前常用PPD變態(tài)反應(yīng)試驗，染色鏡檢，PCR檢測相結(jié)合的方法來診斷結(jié)核病，但這種方法靈敏度低，耗時較長，導(dǎo)致結(jié)核病最佳治療時機的延誤。因此，尋找新的檢測方法顯得尤為重要。

近年來，通過DNA序列雜交技術(shù)，DNA微陣列技術(shù)和全基因序列比對，對結(jié)核分支桿菌的流行株與卡介苗進行比較，發(fā)現(xiàn)了RD區(qū)［14］，其存在于結(jié)核分支桿菌中，而在卡介苗中缺失。表明RD區(qū)編碼的蛋白抗原可能對提高結(jié)核病免疫診斷的敏感度和特異性有特殊作用。RD5區(qū)存在于結(jié)核分支桿菌中，而在卡介苗（BCG-Danish，BCG-Pasteur［15］我國常用菌株）中缺失。張苗苗等研究發(fā)現(xiàn)RD5區(qū)的RV3117基因可能作為結(jié)核血清免疫診斷的潛在標志物［16］。生物信息學分析結(jié)果顯示，結(jié)核分支桿菌Rv3117開放閱讀框編碼的產(chǎn)物可能為硫代硫酸鹽硫轉(zhuǎn)移酶，它可能參與硫代硫酸鹽形成磺基轉(zhuǎn)移酶，也可能參與中間代謝和呼吸。

本研究采用了分子克隆的方法，經(jīng)PCR擴增H37Rv標準株和其他不同的臨床分離株均在同一位置處出現(xiàn)834bp片段，可以認為H37Rv標準株和臨床株均存在該目的基因Rv3117。對該重組工程菌進行誘導(dǎo)、表達，SDS-PAGE分析顯示一條大小約60ku（含30ku的pGEX-4T-1部分肽段和30 ku的Rv3117肽段）的蛋白誘導(dǎo)條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致。經(jīng)Western blot分析證實其具有結(jié)核分支桿菌的反應(yīng)原性。因此，Rv3117有望成為結(jié)核病檢測的診斷抗原，從而為結(jié)核病診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

［1］杜 銳.中國養(yǎng)鹿與疾病防治［M］.吉林長春：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：404.

［2］Stermann M，Sedlaeek L，Maass S，et al.A Promoter mutation causes differential nitrate reduetase activity ofMycobacterium tuberculosisandMycobacteriumbovis［J］.J Bacteriol，2004，186：2856-2861.

［3］陳穎鈺，郭愛珍.牛結(jié)核病防控技術(shù)研究進展［J］.中國奶牛，2014（16）：1-7.

［4］Casal C J，Bezos A，Diez-Guerrier J，et al.Evaluation of two cocktails containing ESAT-6，CFP-10and Rv-3615cin the intradermal test and the interferon-gamma assay for diagnosis of bovine tuberculosis［J］.Prev Vet Med，2012，105：149-154.

［5］李 丹.3種結(jié)核菌檢測方法在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究［D］.吉林長春：吉林大學，2014：7.

［6］劉增再.牛結(jié)核病診斷研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2005，26（5）：13-16.

［7］高玉然，張翠英，劉 琳，等.結(jié)核抗體檢測及結(jié)核菌素試驗在結(jié)核病診斷中的價值［J］.中國熱帶醫(yī)學，2011，11（5）：542-544.

［8］匡有吉.梅花鹿結(jié)核抗體檢測方法的建立和應(yīng)用［D］.湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2008：10-11.

［9］鑫 婷.重組牛分枝桿菌特異性蛋白在牛結(jié)核病診斷中的初步應(yīng)用研究［D］.北京：北京畜牧獸醫(yī)研究所，2013：6.

［10］Zhang M M，Zhao J W，Sun Z Q，et al.Identification of RD5-encodedMycobacteriumtuberculosisproteins as B-cell antigens used for serodiagnosis of tuberculosis［J］.Clin Dev Immunol，2012：738043.

［11］孟 闖.結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白的表達、免疫特性分析及在牛結(jié)核病檢測中的初步應(yīng)用［D］.江蘇揚州：揚州農(nóng)業(yè)大學，2011：19-21.

［12］Mehta P K，Kalra M，Khuller G K ，et al.Development of an ultrasensitive polymerase chain reaction-amplified immunoassay based on mycobacterial RD antigens：implications for the serodiagnosis of tuberculosis［J］.J Diagn Microbiol Infect Dis，2012，72（2）：166-174.

［13］薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南［M］.黃培堂，王嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等，譯.北京：科學出版社，2002.

［14］劉東旭.鹿結(jié)核菌野毒株與卡介苗差異基因文庫的構(gòu)建［D］.吉林長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2012：6-11.

［15］ParkashO，Singh B P，Pai M.Regions of differences encoded antigens as targets for immunodiagnosis of tuberculosis in humans［J］.Scand J Immunol，2009，70（4）：345-57.

［16］張苗苗.結(jié)核分枝桿菌特異的RD5區(qū)編碼蛋白應(yīng)用于結(jié)核血清免疫診斷的初步研究［D］.新疆烏魯木齊：新疆醫(yī)學院，2013：28.