源性成分鑒別檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

李麗娟，袁曉龍（.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院畢節(jié)試驗(yàn)區(qū)研究院，貴州畢節(jié)55700；.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州5064）

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源性成分鑒別檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

李麗娟1，袁曉龍2
（1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院畢節(jié)試驗(yàn)區(qū)研究院，貴州畢節(jié)551700；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642）

摘 要：自瘋牛病和禽流感等疾病暴發(fā)以來，世界各國(guó)將食品安全、飼料安全視為涉及國(guó)家公共安全的重大問題。隨著生活水平的提高，人們?cè)絹碓阶⒅厣钯|(zhì)量，但是在生產(chǎn)實(shí)踐中，常有以假亂真和以次充好的現(xiàn)象，源性成分的檢測(cè)成為判別的標(biāo)準(zhǔn)已涉及到各行各業(yè)。論文對(duì)源性成分檢測(cè)的起源、應(yīng)用和常用的方法做了綜述，以期為商品真?zhèn)舞b別、品質(zhì)鑒定、防止動(dòng)物疫病病原體傳播等提供參考。

關(guān)鍵詞：源性成分；物種鑒別；檢測(cè)技術(shù)

1986年，在英國(guó)的牛肉骨粉中首次檢測(cè)到瘋牛病病原體，動(dòng)物源性飼料存在危害人類健康的潛在威脅，導(dǎo)致許多國(guó)家禁止或嚴(yán)格限制以動(dòng)物源性蛋白作為動(dòng)物飼料蛋白供體［1］。在經(jīng)濟(jì)、交通和科技高速發(fā)展的今天，人們對(duì)食物安全越來越重視，迫切需要對(duì)食品、飲料、飼料等物品貼上準(zhǔn)確和嚴(yán)格的標(biāo)簽。源性成分檢測(cè)已成為當(dāng)前鑒別物品類別最主要的方法［2］。源性成分檢測(cè)是指通過物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法，對(duì)食品、飼料、衣服等物品的成分進(jìn)行種類來源檢測(cè)和鑒別［3］。進(jìn)行動(dòng)物源性成分檢測(cè)主要有3個(gè)原因：①含有瘋牛病、羊癢病和禽流感等可傳染性疫病的病原體飼料嚴(yán)重威脅著畜牧養(yǎng)殖，通過食物鏈也威脅人類的健康；②不同地區(qū)的人們有不同的宗教信仰和飲食習(xí)慣，對(duì)進(jìn)食何種肉制品有不同的需求，比如穆斯林地區(qū)的人們不吃豬肉，印度地區(qū)的人們不吃牛肉等，需要對(duì)食品進(jìn)行源性檢測(cè)，準(zhǔn)確標(biāo)明食品成分；③一些不法制造商為了牟取不正當(dāng)利益，以低價(jià)值的物品充當(dāng)高價(jià)值的物品，欺騙消費(fèi)者，進(jìn)行不公平交易［3］。源性成分檢測(cè)有很多現(xiàn)實(shí)的意義，可以鑒別肉制品的種別、性別、年齡和地理區(qū)域等，判定其是否是有機(jī)肉類制品；也可以鑒別肉制品經(jīng)過何種加工處理，鑒定肉制品是冷鮮肉還是冷凍肉，是烘烤肉還是烹飪?nèi)猓灰嗫梢澡b定肉制品中是否含有添加劑及是否是注水肉［4］。源性成分的檢測(cè)已涉及到各行各業(yè)，與人們的生活息息相關(guān)，檢測(cè)方法也從最初的耗時(shí)、復(fù)雜、單一和準(zhǔn)確性低的檢測(cè)技術(shù)，發(fā)展為多種多樣、方便操作和準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法。

1　源性成分檢測(cè)方法

早期的源性成分檢測(cè)方法主要是物理和化學(xué)的鑒別方法，依據(jù)物品的物理、組織學(xué)等特點(diǎn)和化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。20世紀(jì)70年代，主要為基于蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)方法，包括蛋白質(zhì)電泳、液相色譜和免疫化學(xué)法；1983年隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)展了很多基于DNA序列的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，有隨即擴(kuò)增多態(tài)性DNA法（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）、物種特異引物法（species-specific primers）、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性法（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（real-time PCR）。隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，也發(fā)展了基于代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和基因組學(xué)的源性成分檢測(cè)方法。

1.1早期動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法

早期的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法包括物理和化學(xué)的鑒別方法。物理鑒別方法是通過人的感覺器官對(duì)產(chǎn)品的真?zhèn)渭百|(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)和判斷，主要依據(jù)物品的物理和解剖特點(diǎn)，包括肌肉粗細(xì)、顏色、氣味、椎骨數(shù)和其他組織學(xué)特點(diǎn)等判斷。例如利用顯微鏡根據(jù)肌纖維的長(zhǎng)度、大小和骨質(zhì)密度的不同，鑒別物種源性。光鏡檢測(cè)也是現(xiàn)在歐盟官方檢測(cè)加工性動(dòng)物源性蛋白的唯一方法［5］。這種檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便、直觀、判決快、成本低和實(shí)用等特點(diǎn)，能及時(shí)檢驗(yàn)出食品的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，以及食品質(zhì)量有無異常。但食品一旦經(jīng)過加工處理，檢驗(yàn)的難度將增加以及準(zhǔn)確性將大大降低。同時(shí)對(duì)檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)要求較高，而且

檢驗(yàn)人員的主觀性差異容易對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。

化學(xué)鑒別方法主要包括色譜鑒別法和光譜鑒別法，色譜鑒別法是通過氣相、液相等色譜進(jìn)行源性分析。色譜的圖譜相對(duì)復(fù)雜，無法檢測(cè)混合樣本，且樣品制備比較繁瑣，檢測(cè)儀器相對(duì)較貴，使得色譜法在源性成分檢測(cè)上的應(yīng)用受到限制；光譜鑒別法是通過光譜照射，檢測(cè)其吸光度進(jìn)行分析。常用的光譜有近紅外光譜和中紅外光譜。這些光譜可以單獨(dú)使用，也可以聯(lián)合使用。由于近紅外光譜分析技術(shù)具有速度快、重復(fù)性好、成本低和測(cè)量方便等優(yōu)點(diǎn)，被越來越多地被應(yīng)用于食物、石油化工、制藥等領(lǐng)域。例如Boselli E等［6］利用蒸發(fā)光散射和串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)豬肉的磷脂分子，鑒別了豬肉的物種源性。

1.2基于蛋白質(zhì)的鑒別方法

20世紀(jì)70年代，源性檢測(cè)技術(shù)發(fā)展了很多基于蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)方法，包括蛋白質(zhì)電泳法、層析法和免疫化學(xué)法［2］。電泳法是指在電泳介質(zhì)存在的條件下，不同的蛋白質(zhì)因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)和帶電量的不同，有不同的遷移速度，從而鑒別物種源性。常用的電泳介質(zhì)是聚丙烯酰胺凝膠電泳和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。層析法是利用流動(dòng)的相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離效果。免疫化學(xué)方法是依據(jù)抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，最常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。Chen Y等［7］用ELISA鑒別三明治中是否含有魚的物種源性物質(zhì)，為對(duì)魚蛋白過敏的人提供有效的參考。但這種方法有很大的局限性，用兔抗豬的血清球蛋白和兔抗羊的血清球蛋白通過ELISA的方法，鑒別牛肉中混雜的豬肉和羊肉，在沒有烹飪的條件下，ELISA能鑒別牛肉中含豬肉和羊肉的靈敏度為5%，烹飪后ELISA不能鑒別出牛肉中混合的豬肉，并且羊肉的鑒別信號(hào)下降70%～74%。

1.3基于DNA序列的分子生物學(xué)方法

源性檢測(cè)方法中無論物理方法和化學(xué)方法，亦或者是基于蛋白質(zhì)特性的檢測(cè)方法，都存在很大的局限性，物理方法和化學(xué)方法需要有長(zhǎng)期實(shí)踐積累的經(jīng)驗(yàn)，并且結(jié)果有很大成分的人為主觀因素?；诘鞍踪|(zhì)的源性檢測(cè)方法也有很大的局限性，比如高溫加熱肉制品后，這類方法的準(zhǔn)確性和可靠性變得很低。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)面世后，源性檢測(cè)方法有了里程碑意義的突破，基于PCR源性檢測(cè)的方法操作方便，結(jié)果可靠性高。

因?yàn)椴煌锓N的基因組不同，依據(jù)物種的特異序列，可以用引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增特異的產(chǎn)物來鑒別物種源性，比如用PCR的方法鑒別了肉食桿菌的不同種屬，鑒別了肉制品中是否含有某種致病菌，也檢測(cè)了海魚產(chǎn)品中是否含有葡萄球菌［8］。RAPD方法是通過提取樣品DNA后，設(shè)計(jì)特異引物，隨機(jī)的擴(kuò)增DNA片段，形成多個(gè)片段紋路，每個(gè)物種有自己獨(dú)特的DNA片段多態(tài)性，依此來區(qū)分物種源性。Saez R等［9］利用這種方法，快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)了牛肉、豬肉、羊肉和火雞肉產(chǎn)品的物種源性。物種特異引物的方法是對(duì)物種間特異的DNA序列，設(shè)計(jì)特異的引物，擴(kuò)增出特異的片段來鑒別物種源性［10］。RFLP的方法是針對(duì)物種間保守或非保守的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出DNA片段，用不同的限制內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增片段得到不同的產(chǎn)物，從而區(qū)別物種源性［11］。Murugaiah C等［12］針對(duì)牛、豬、水牛、鵪鶉、雞、山羊和兔的線粒體cyt b基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出359bp的片段，然后用不同的限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)酶切產(chǎn)物來區(qū)分這6個(gè)物種的動(dòng)物源性成分。Mahajan M V等［13］針對(duì)線粒體的12S rRNA基因設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出456bp的片段，用AluI、HhaI、BapTI和ApoI限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增的片段，得到不同的酶切產(chǎn)物片段來鑒別物種源性。real-time PCR的方法也是基于DNA上穩(wěn)定的基因序列設(shè)計(jì)定量引物，不僅能鑒別物種源性，也能一定程度上鑒別摻雜量。Kesmen Z等［14］針對(duì)線粒體的ND2、ND5和ATP6-8基因設(shè)計(jì)引物，利用real-time PCR的方法鑒別出驢、豬和馬的物種源性，靈敏度高達(dá)0.1pg。Soares S等［15］針對(duì)線粒體的cyt b和12SrRNA基因序列設(shè)計(jì)定量引物，產(chǎn)物大小分別為149bp和183bp，可以高靈敏度的區(qū)分并定量家禽肉中摻雜了多少豬肉。

用DNA作為動(dòng)物源性成分檢測(cè)的標(biāo)記比較穩(wěn)定并且特異性比較高，其以便捷經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)被廣泛的運(yùn)用到各個(gè)領(lǐng)域的檢測(cè)。選擇作為標(biāo)記的DNA序列，有的基于核DNA序列，也有的基于mtDNA、rRNA和mRNA序列，選擇作為標(biāo)記的核DNA序列多是一些加熱前后穩(wěn)定的基因序列，比如豬的leptin基因［16］和牛的β-actin基因［17］等，選擇作為標(biāo)記的mtDNA多是D-loop區(qū)域、cyt b基因、COI基因、16SrRNA和12SrRNA等［18］。對(duì)豬線粒體的D-loop區(qū)域設(shè)計(jì)引物，無論是風(fēng)干的豬肉還是烹飪的豬肉提取的DNA都能擴(kuò)增出531bp的片段，這對(duì)引物在牛肉、羊肉和雞肉提取的DNA中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，并且利用AvaⅡ限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增的產(chǎn)物，能區(qū)分豬肉是否是野豬肉。Dalmasson A等［19］針對(duì)線粒體的12SrRNA和16SrRNA設(shè)計(jì)

引物，對(duì)反芻動(dòng)物、家禽、魚類和豬的基因組DNA樣品分別擴(kuò)增出102bp～104bp、183bp、220bp～230bp和290bp的產(chǎn)物，鑒別了樣品的源性成分，并且檢測(cè)靈敏度為0.000 4%。Lin C C等［20］利用線粒體COI基因設(shè)計(jì)引物，能夠檢測(cè)混合樣品中含有幾種動(dòng)物源性物質(zhì)。

基于DNA序列的源性檢測(cè)方法，有的研究表明加熱樣品后對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響，Ulca P等［21］利用PCR的方法對(duì)摻雜了豬肉的牛肉、雞肉和火雞肉，進(jìn)行源性檢測(cè)，分別在常溫和200℃下處理20min，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)靈敏度為0.1%。有研究結(jié)果表明溫度和加熱的時(shí)間會(huì)影響檢測(cè)的結(jié)果，Sakalar E等［22］對(duì)牛、豬和雞的線粒體設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為374、290、240bp，然后對(duì)牛肉、豬肉和雞肉在200℃下烘烤10、20、30、40、50min，在30、60、90、120、150、180、210℃烘烤30min，在99℃下蒸煮10、30、60、90、120、150、180、210min，通過RT-PCR的方法定量，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)受溫度和時(shí)間的影響。

源性成分檢測(cè)技術(shù)也隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展，特別是新一代高通量測(cè)序技術(shù)大大減少了基因組測(cè)序的成本和時(shí)間，通過組學(xué)的分析獲得生物的遺傳多樣性和分子生物學(xué)信息，為物種源性的鑒別提高了更為嚴(yán)密可高的檢測(cè)技術(shù)。例如2014 年Smolina I等［29］利用新一代測(cè)序技術(shù)分析了飛馬哲水蚤和北極哲水蚤的基因組和轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)缺失插入標(biāo)記，從分子水平上非常精確的鑒別了哲水蚤。

2　源性成分檢測(cè)的應(yīng)用

隨著源性成分檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，源性成分的檢測(cè)已被應(yīng)用到各個(gè)行業(yè)，技術(shù)不斷提高，范圍不斷擴(kuò)大。隨著研究的深入，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中已對(duì)雞、鴨、鵝、鷓鴣、火雞、鵪鶉、馬、驢、鹿、貓、狗、魚以及禽類等物種做了鑒別檢測(cè)方法的各種研究。自瘋牛病和禽流感暴發(fā)以來，世界各國(guó)將食品安全、飼料安全視為涉及國(guó)家公共安全的問題，加強(qiáng)了監(jiān)控畜禽類肉食品及其飼料的源性產(chǎn)品安全監(jiān)督，因而在畜牧養(yǎng)殖業(yè)動(dòng)物源性成分的檢測(cè)技術(shù)顯得尤為需要。邵碧英等［24］對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品及飼料中牛源和羊源性成分PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，使牛源性成分的最低檢測(cè)限可達(dá)10μg/g；趙冉等［25］用PCR檢測(cè)方法，能特異地鑒別檢測(cè)出牛、山羊和綿羊的源性成分，且敏感性比現(xiàn)行國(guó)標(biāo)PCR法高100倍；陳永鋒［26］用雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，檢測(cè)到飼料及動(dòng)物性食品中的山羊和綿羊源性成分比國(guó)標(biāo)法（GB/T20190-2006）的靈敏性高100倍。

食品餐飲業(yè)的摻雜涉假已滲入到農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、餐飲飯館，乃至深受消費(fèi)者信賴的知名超市。在牛、羊、鹿等高價(jià)肉制品中摻雜豬、鴨等低價(jià)肉原料；在牛奶中添加三聚氰胺提高含氮量，或用牛奶冒充羊奶。名貴中藥材的數(shù)量往往稀有，價(jià)格昂貴，市場(chǎng)上假冒偽劣產(chǎn)品較多，真?zhèn)坞y。不法分子使用馬皮、牛皮、豬皮、病死動(dòng)物之皮等來取代驢皮進(jìn)行熬制，損害了消費(fèi)者的利益。學(xué)者們也初步建立了一些鑒別檢測(cè)的方法［27-31］，還需要進(jìn)行較深入的研究，為消費(fèi)者建立公平放心的交易和消費(fèi)平臺(tái)。

3　展望

動(dòng)植物源性成分廣泛存在于食品、飼料、藥品、保健品和服裝等領(lǐng)域，與我們的生活密切相關(guān)。各種動(dòng)物疫病的暴發(fā)和商品中摻假現(xiàn)象層出不窮，源性成分檢測(cè)技術(shù)已成為商品真?zhèn)舞b別和品質(zhì)鑒定等工藝中迫切需要的技術(shù)。但源性檢測(cè)技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在選擇何種檢測(cè)方法時(shí)，需要考慮檢測(cè)目的、樣品性質(zhì)、樣品數(shù)量、可用的儀器和設(shè)備及費(fèi)用等。對(duì)源性成分檢測(cè)進(jìn)行較深入的研究，對(duì)于防止商品欺詐、動(dòng)物疫病病原體傳播和宗教飲食禁忌引發(fā)的民族矛盾等方面都有著十分重要的意義。挖掘高靈敏度和高特異性的源性成分檢測(cè)技術(shù)也已成為擺在科研工作者面前的重大課題。

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專論與講座

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Progress on Detection Techniques of Derived Materials

LI Li-juan1，YUAN Xiao-long2
（1.Institute of Bijie Test Area，Guizhou University of Engineering Science，Bijie，Guizhou，551700，China；2.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong，510642，China）

Abstract：Since the BSE and avian influenza erupted，most of the countries has regarded the safety of foods and feed as a major issue that relates to national public safety.With the increasing of living standard，people pay more attention to the quality of life，however，there are often fakes and shoddy phenomenon in practices.Consequently it urgently needs the source detection of components，and the source detection becomes the criterion.As far as it goes，the source detections of components have been related to all sectors of all our life.The origin of the source detection of components，its application and the methods were reviewed. Through the summary we expected to provide certain theoretical basis for detecting authenticity of merchandises，making an appraisal of quality and preventing the spread of animal diseases.

Key words：animal-derived material；species identification；detection technology

作者簡(jiǎn)介：李麗娟（1983-），女，甘肅白銀人，碩士，助理研究員，主要從事分子遺傳育種研究。

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù) （黔科合J字LKB［2013］18號(hào)）

收稿日期：2014-08-28

中圖分類號(hào)：S852.743

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）05-0107-04