吡拉格雷鈉對氧糖剝奪/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫及AQP4表達(dá)的影響

許淑紅，尹茂山，吳玉林

(1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 211198;2.濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250200;3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062)

腦水腫是缺血性腦卒中、顱腦創(chuàng)傷等眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病共同的病理過程［1］。腦組織的進(jìn)行性水腫使顱內(nèi)壓升高，腦的血流量減少，是導(dǎo)致腦功能障礙和死亡的主要原因之一。水通道蛋白4(aquaporin，AQP4)是膜水通道蛋白家族的一員，在腦組織中廣泛表達(dá)，是控制水出腦組織的通道，在腦組織水平衡、星形細(xì)胞遷移、神經(jīng)興奮及炎癥等方面均起著重要作用［2］。大量研究［2－3］表明，AQP4 與腦水腫關(guān)系密切，AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞周足處表達(dá)明顯，調(diào)控水分子出入腦組織，因此在腦水腫的形成和消退的各個階段起著重要作用，參與了多種疾病所引起的腦水腫的病理過程。進(jìn)一步研究［4－6］顯示，AQP4定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，Ac)上，被發(fā)現(xiàn)在腦水腫的形成中能明顯促進(jìn)Ac的腫脹，AQP4作為一個潛在的藥物作用靶點成為預(yù)防和治療腦水腫的研究熱點之一。腦水腫形成的因素很多，其中血小板功能異常是參與腦血栓形成的重要因素，與腦水腫關(guān)系密切。奧扎格雷鈉是TXA2合成酶抑制劑，抑制TXA2的生成，抑制血小板聚集，同時促進(jìn)PGI2的產(chǎn)生，從而使凝血過程受到有效抑制，達(dá)到改善微循環(huán)，增加腦血液供應(yīng)，達(dá)到消除腦水腫的作用。臨床試驗［7］證明，奧扎格雷鈉具有見效快、療程短、價格適中、無毒副作用等諸多優(yōu)點。吡拉格雷鈉(tetramethylpyrazine-2'-O-sodium ferulate，TSF)是以奧扎格雷鈉為先導(dǎo)物進(jìn)行改良的結(jié)構(gòu)新型的血栓烷素A2合成酶抑制劑。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，吡拉格雷可以明顯減輕大鼠腦缺血/再灌注后的腦水腫，很好地保護(hù)血腦屏障的完整性，但其減輕腦水腫的具體途徑及機(jī)制目前都尚不清楚。本研究通過對體外星形膠質(zhì)細(xì)胞行氧糖剝奪/復(fù)氧處理，建立細(xì)胞水腫模型，觀察TSF對星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫模型的治療效果及其對AQP4表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1 實驗動物 出生3 d內(nèi)的SD新生乳鼠(由江蘇大學(xué)動物中心提供)。

1.1.2 材料及試劑 戊巴比妥鈉(美國Sigma公司);胎牛血清，0.25%胰蛋白酶(含0.025%EDTA)，DMEM無糖培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基(美國Sig-ma公司);D-Hanks緩沖液;3-氧 － 甲基-［1-3H］-D-葡萄糖;根皮素;NaOH溶液;HCl溶液;BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime公司);AQP4一抗(Abcam公司);酶標(biāo)儀;低溫離心機(jī);二氧化碳孵箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 取SD乳鼠腦組織，用預(yù)冷D-Hanks緩沖液清洗表面血跡，并快速除去腦膜和血管，制備單細(xì)胞懸液，以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。將單細(xì)胞懸液接種入培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶置于二氧化碳孵箱(5%CO2，20%O2)，37℃恒溫培養(yǎng)1 h;將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)換至另一培養(yǎng)瓶，繼續(xù)置于二氧化碳孵箱培養(yǎng)，隔2～3 d換液，7 d后于37℃，200 r·min－1振蕩 18 h，換液，細(xì)胞長滿至90%～95%瓶底時，以0.25%胰蛋白酶消化離心，重復(fù)傳代至第3代，此時即得到成熟純化的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞［8］。

1.2.2 氧糖剝奪/復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫模型的建立 棄去星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的正常培養(yǎng)基，PBS快速沖洗2次。加入無糖DMEM培養(yǎng)基，置于低氧(1%O2，5%CO2)孵箱，進(jìn)行2 h的氧糖剝奪培養(yǎng);氧糖剝奪后，棄去無糖DMEM培養(yǎng)基，置于DMEM/F 12培養(yǎng)基，正常條件培養(yǎng)。

1.2.3 實驗分組 將體外原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分為4個組:① 正常組:正常星形膠質(zhì)細(xì)胞在二氧化碳孵箱(5%CO2，20%O2)，37℃ 恒溫，以 10% 胎牛血清的DMEM/F 12培養(yǎng)基培養(yǎng);② 氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/Reox)損傷組:將正常星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行2 h氧糖剝奪培養(yǎng)，恢復(fù)正常條件培養(yǎng)至6、12、24和48 h 4個時間點;③ Ozagrel陽性對照組:在星形膠質(zhì)細(xì)胞行OGD/Reox損傷各時間點在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入治療濃度的Ozagrel治療;④ TSF治療組:星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/Reox損傷模型建立后各時間點在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度梯度的TSF治療。

1.2.4 細(xì)胞體積測定 各時間點實驗結(jié)束前30 min，加3-氧 － 甲基-［1-3H］-D-葡萄糖于細(xì)胞培養(yǎng)基中，使其終濃度為1.85×108Bq·L－1，以此作示蹤物測定細(xì)胞體積。各時間點取樣，用預(yù)冷根皮素(1 mmol·L－1)培養(yǎng)基快速洗6遍，以終止反應(yīng)，NaOH消化10 min，以等濃度HCl中和，加閃爍液混勻，取0.5 mL用于流體閃爍計數(shù)，取0.1 mL用于BCA法蛋白質(zhì)含量測定，換算成細(xì)胞內(nèi)水含量(Kletzien法)，結(jié)果以L·g－1蛋白表示。

1.2.5 LDH漏出率測定 星形膠質(zhì)細(xì)胞分別在氧糖剝奪/復(fù)氧培養(yǎng)至各時間點，各組取約0.3 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，結(jié)果計算采用公式:LDH漏出率/%=［培養(yǎng)基 LDH/(胞質(zhì) LDH+培養(yǎng)基 LDH)］×100%。

1.2.6 星形膠質(zhì)細(xì)胞活性鑒定(MTT法) 取星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×108·L－1密度種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)至所需的天數(shù)，DMEM培養(yǎng)基沖洗3次，加5 μL的MTT(5 g·L－1)，孵育4 h，棄去 MTT及培養(yǎng)基，每孔加入200 μL的二甲基亞砜，振蕩5 min，酶標(biāo)儀(A570 nm)測定，取均值，采用公式計算結(jié)果:細(xì)胞存活率/%=［A(實驗組)/A(對照組)］×100%。

1.2.7 Western blot測定星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白表達(dá)水平 去除培養(yǎng)液，加入蛋白裂解液，置于冰上裂解20 min;4℃下14 000×g離心10 min，取上清，用BCA法測定總蛋白濃度。30～50 μg總蛋白上樣量以濃度為8%的凝膠電泳分離。冰水浴下恒流(300mA)濕法轉(zhuǎn)膜1.5 h，以體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉封閉1 h，加AQP4一抗(1∶300)，4℃共孵育過夜。TBS-T洗滌，與二抗共孵育2 h，用增強型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析，以β-actin的灰度值標(biāo)化蛋白表達(dá)水平。

1.2.8 RT-PCR測定星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 取各組別星形膠質(zhì)細(xì)胞，均勻粉碎后按TRIzol提取程序(說明書)提取組織總 RNA;按AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，4℃保存。擴(kuò)增引物:AQP4上游引物5'-GGAATTTCTGGCCATGCTTA-3'，下游引物 5'-AAGACAGACTTGGCGATGCT-3'，擴(kuò)增片段產(chǎn)物長231 bp。β-actin上游引物5'-CTGCCGCATCCTCTTCCTC-3'，下游引物5'-CTCCTGCTTGCTGATCCACTA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長398 bp。擴(kuò)增條件:94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，共35個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀察，用 Band Scan 5.0軟件測定條帶灰度值，將AQP4 mRNA、分別與β-actin mRNA灰度值的比值作為觀察指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，組間比較均采用單因素方差分析(One-way analysis of variance，ANOVA)處理。

2 結(jié)果

2.1 TSF對OGD/Reox后星形膠質(zhì)細(xì)胞體積變化的影響

2.1.1 OGD/Reox后不同時間點星形膠質(zhì)細(xì)胞體積變化 經(jīng)過2 h時長的氧糖剝奪后，星形膠質(zhì)細(xì)胞不同時間點細(xì)胞體積隨著時間延長呈不斷增高趨勢。與正常組相比，OGD/Reox后48 h時差異有顯著性(P ＜0.01)。見 Tab 1、Fig 1。

Tab 1 Changes of astrocytes volume in different time points(±s，n=6)

Tab 1 Changes of astrocytes volume in different time points(±s，n=6)

#P＜0.05，##P＜0.01 vs control

Group Control Time points after OGD/Reox 6 h 12 h 24 h 48 h Cell volume 5.49 ±0.44 6.33 ±0.64 6.81 ±0.41 7.20 ±0.45#7.67 ±0.38##

Fig 1 Changes of astrocytes volume in different time points(±s，n=6)

2.1.2 不同濃度梯度TSF對OGD/Reox后48 h星形膠質(zhì)細(xì)胞體積的影響 星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪2 h復(fù)氧48 h后，與模型組相比，不同濃度梯度的TSF(10－7、10－6、10－5、10－4mol·L－1)處理的細(xì)胞體積均有明顯降低(P＜0.05)，各濃度梯度之間差異無顯著性(P＞0.05);Ozagrel組與TSF組各濃度梯度之間差異也無顯著性(P＞0.05)。見Tab 2、Fig 2。

Fig 2 Effects of different concentrations of TSF on astrocytes volume after OGD/Reox(±s，n=6)

2.1.3 LDH漏出率檢測結(jié)果 實驗表明，正常供氧條件下，LDH漏出率也僅為2.3%，氧糖剝奪2 h復(fù)氧后各時間點隨著復(fù)氧時間的延長LDH的漏出率增加，與正常對照組差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01)，與模型組對比，TSF給藥組的LDH漏出率明顯降低(P＜0.05);Ozagrel組與TSF組各濃度梯度之間差異無顯著性(P＞0.05)。見Tab 3、Fig 3。

Fig 3 The leakage rate of LDH in astrocytes(±s，n=6)

2.2 MTT檢測細(xì)胞活力結(jié)果與正常組相比，OGD 12、24和48 h細(xì)胞的MTT值明顯降低(P＜0.05)，比較星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/Reox后各個時間點MTT值，隨缺氧/復(fù)氧時間增加，MTT值逐漸下降，顯示細(xì)胞活力降低;與OGD/Reox比較，TSF治療組細(xì)胞活力均有增高(P＜0.05);Ozagrel組與TSF組各濃度梯度之間差異也無顯著性(P＞0.05)。見 Fig 4、5。

Fig 4 Changes of MTT in OGD/Reox group(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different concentrations of TSF on astrocytes volume after OGD/Reox(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different concentrations of TSF on astrocytes volume after OGD/Reox(±s，n=6)

##P＜0.01 vs control;*P＜0.05 vs OGD/Reox

Group Control OGD/Reox Ozagrel Different concentration of TSF/mol·L－1 10 －7 10 －6 10 －5 10－4 Cell volume 5.49 ±0.44 7.63 ±0.45## 6.41 ±0.27* 7.48 ±0.34 6.80 ±0.54* 6.44 ±0.33* 6.57 ±0.73*

Tab 3 The leakage rate of LDH in astrocytes(±s，n=6)

Tab 3 The leakage rate of LDH in astrocytes(±s，n=6)

#P＜0.05，##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs OGD/Reox

Group Leakage rate of LDH after OGD/Reox/%6 h 12 h 24 h 48 h Control 2.30 ±0.21 2.19 ±0.25 2.38 ±0.21 2.33 ±0.28 OGD/Reox 3.91 ±0.39 4.98 ±0.37# 7.21 ±0.36## 8.13 ±0.34##Ozagrel 3.13 ±0.04 3.83 ±0.19 4.72 ±0.46＊＊ 5.63 ±0.37＊＊TSF 3.06 ±0.31 3.73 ±0.31 4.89 ±0.38＊＊ 5.80 ±0.41＊＊

Fig 5 Changes of MTT in TSF group compared with OGD/Reox group(± s，n=6)

2.3 Western blot檢測 TSF對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/Reox后AQP4表達(dá)的影響

2.3.1 Western blot檢測不同濃度梯度TSF對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/Reox后AQP4表達(dá)的影響 星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/Reox后48 h，以TSF處理，與模型組相比，不同濃度梯度TSF處理組AQP4蛋白表達(dá)水平均有明顯降低(P＜0.05)，與正常組及Ozagrel組相比，差異均無顯著性(P＞0.05)。見Fig 6。

2.3.2 Western blot檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞 OGD/Reox后各時間點AQP4的表達(dá)及TSF的影響 正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定量的AQP4蛋白表達(dá);與正常組相比，OGD/Reox組細(xì)胞AQP4蛋白在2 h氧糖剝奪/復(fù)氧培養(yǎng)至48h時達(dá)最高值明顯高于正常組(P＜0.01);TSF處理組AQP4蛋白在2 h氧糖剝奪/復(fù)氧后的表達(dá)變化趨勢與OGD/Reox相似，但在各個時間點的表達(dá)水平均有明顯降低(P＜0.05);Ozagrel組與TSF組之間也差異無顯著性(P＞0.05)。見Fig 7。

Fig 6 Expression of AQP4 in TSF group for different concentrations via WB(±s，n=6)

Fig 7 Expression of AQP4 in TSF group compared with OGD/Reox group for different time points via WB(±s，n=6)

2.4 RT-PCR檢測TSF對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/Reox后AQP4 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

2.4.1 RT-PCR檢測不同濃度梯度TSF對星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/Reox后AQP4 mRNA表達(dá)的影響 星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/Reox后48 h，與 OGD/Reox組相比，不同濃度梯度TSF處理組AQP4 mRNA表達(dá)水平均有明顯降低(P＜0.05)，與正常組及Ozagrel組相比，差異均無顯著性(P＞0.05)。見Fig 8。

Fig 8 Expression of AQP4 mRNA in TSF group compared with OGD/Reox group for different concentration via RT-PCR(±s，n=6)

2.4.2 RT-PCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/Reox后各時間點AQP4 mRNA轉(zhuǎn)錄及TSF的影響 正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定量的AQP4 mRNA的表達(dá)，但表達(dá)量不隨時間的變化而變化。與正常組相比，OGD/Reox組細(xì)胞AQP4 mRNA在2 h氧糖剝奪并復(fù)氧培養(yǎng)至48 h時達(dá)最高值明顯高于正常組(P＜0.01);與OGD/Reox組相比較 Ozagrel組及 TSF處理組AQP4 mRNA在2 h氧糖剝奪并復(fù)氧后的表達(dá)也提高，但在各個時間點的表達(dá)水平均有明顯較低;Ozagrel組與TSF組之間差異也無顯著性(P＞0.05)。見Fig 9。

3 討論

腦水腫是一種過多的水分異常潴留在腦組織內(nèi)的病理過程。其存在于多種腦疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，屬于急慢性腦部疾病的重要病理過程。尤其是在腦梗死的患者中，梗死灶周圍發(fā)展出現(xiàn)水腫，形成腦水腫。目前，盡管對于腦水腫進(jìn)行了大量臨床及實驗學(xué)研究，關(guān)于其具體的發(fā)生機(jī)制尚未闡明。

Fig 9 Expression of AQP4 mRNA in TSF group compared with OGD/Reox group for different time points via RT-PCR( ± s，n=6)

王婷婷等［9］在對腦缺血損傷的治療研究中發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷Ⅱ能夠清除自由基、抗氧化，下調(diào)AQP4蛋白的表達(dá)，抑制TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)通路，從而緩解腦水腫、改善大腦的神經(jīng)功能。Arii［10］的研究表明，奧扎格雷鈉可通過減少腦梗死患者TXA2水平減少大鼠腦水腫的形成。但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍未探明。徐斌等［7］進(jìn)一步研究顯示，奧扎格雷鈉與巴曲酶合用通過減低MMP-9、TXA2水平保護(hù)血管內(nèi)皮，減少梗死后腦水腫以及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。吡拉格雷鈉，是以奧扎格雷鈉為先導(dǎo)物進(jìn)行改良的結(jié)構(gòu)新型的TXA2合成酶抑制劑，可能也是抑制TXA2的產(chǎn)生，保護(hù)血管內(nèi)皮的損傷，從而影響了星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移速率，改善水分子進(jìn)出腦組織平衡狀態(tài)，產(chǎn)生腦水腫的治療作用。

本研究通過對星形膠質(zhì)細(xì)胞體外OGD/Reox，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體及突起明顯腫脹，建立了細(xì)胞水腫模型，以此模擬體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血/再灌注損傷引起腦水腫的病理過程［11］。實驗過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪/復(fù)氧處理后，細(xì)胞逐漸腫脹，至48h時腫脹不斷明顯，LDH活性的不斷增高和MTT值得不斷降低正是星形膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷的表現(xiàn)。而在OGD/Reox后加入不同濃度的TSF處理，可以使細(xì)胞的腫脹明顯減輕，LDH活性增高的程度也同樣明顯降低，表明TSF能夠明顯減輕氧糖剝奪引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。Western blot及RTPCR的結(jié)果更分別從蛋白水平和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平印證了這一結(jié)果。

AQP4是腦內(nèi)主要的水通道蛋白，越來越多的研究表明AQP4與腦水腫關(guān)系密切。Lopez-Rodriguez等［12］發(fā)現(xiàn)，形態(tài)和生長特征無明顯差異的AQP4基因敲除小鼠和AQP4+/+野生型小鼠的星型膠質(zhì)細(xì)胞相比，前者對水的通透性比后者低，提示AQP4是水分子快速進(jìn)出的通道。Papadopoulos等［13］利用體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞建立人類在腦水腫模型的研究中發(fā)現(xiàn)，AQP4敲除小鼠的腦水腫程度明顯輕于野生小鼠。由此可見，AQP4表達(dá)水平的高低與細(xì)胞毒性腦水腫的嚴(yán)重程度直接相關(guān)。在2 h氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重水腫的過程中，AQP4蛋白的表達(dá)量呈上升趨勢。而在加入TSF后，氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的表達(dá)水平較模型組均明顯降低，細(xì)胞水腫也明顯減輕，由此可以推測，TSF通過作用于AQP4有關(guān)蛋白阻止細(xì)胞水腫過程中胞外水分異常過多的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到減輕氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的作用。這種保護(hù)作用可能是TSF作為新型TXA2合成酶抑制劑，明顯減低了TXA2水平，從而保護(hù)血管內(nèi)皮，修復(fù)損傷內(nèi)皮細(xì)胞及對AQP4蛋白調(diào)節(jié)保護(hù)，產(chǎn)生治療細(xì)胞水腫的效果。

TSF作為TXA2合成酶抑制劑具有調(diào)節(jié)AQP4表達(dá)的作用，對于減輕氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫作用明顯，為臨床治療顱內(nèi)瘤周腦水腫、創(chuàng)傷性腦水腫等腦水腫也提供了新的思路。最新研究表明，TSF可通過調(diào)節(jié)鈣－鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)、ERK信號通路等的活化減輕創(chuàng)傷性腦水腫［14］，但其具體分子機(jī)制研究有待于我們進(jìn)一步的研究來探討。

(致謝:本實驗全部由中國藥科大學(xué)藥理學(xué)實驗室吳玉林老師課題組獨立完成，感謝我的導(dǎo)師吳玉林老師在實驗設(shè)計思路上提出的建議和意見及實驗技術(shù)上給予的指導(dǎo)。)

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