補(bǔ)骨脂乙素對Tca8113細(xì)胞遷移及侵襲的抑制作用及其機(jī)制

史 毅，吳偉忠，霍 安，周 偉，朱志圖

(1.江蘇省丹陽市人民醫(yī)院口腔科，江蘇 丹陽 212300；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤科，遼寧 錦州 121001)

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補(bǔ)骨脂乙素對Tca8113細(xì)胞遷移及侵襲的抑制作用及其機(jī)制

史 毅1，吳偉忠1，霍 安1，周 偉1，朱志圖2

(1.江蘇省丹陽市人民醫(yī)院口腔科，江蘇 丹陽 212300；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤科，遼寧 錦州 121001)

目的 探究補(bǔ)骨脂乙素(Isobavachalcone，IBC)對人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用及其可能的作用機(jī)制。方法 將不同濃度的IBC作用于體外培養(yǎng)的Tca8113細(xì)胞，通過MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力；Western blot法檢測Akt、p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 IBC以濃度和時(shí)間依賴的方式有效抑制Tca8113細(xì)胞增殖。IBC降低Tca8113細(xì)胞遷移及侵襲能力。Western blot法顯示IBC能夠以濃度相關(guān)性下調(diào)p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá),而Akt蛋白水平不受IBC處理劑量的影響。結(jié)論 IBC可抑制Tca8113細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，其作用與下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白及抑制其上游Akt的磷酸化有關(guān)。

補(bǔ)骨脂乙素；舌鱗狀細(xì)胞癌；增殖；遷移；侵襲；機(jī)制

惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。惡性腫瘤細(xì)胞可以通過多種方式破壞機(jī)體的組織學(xué)屏障，隨血液、淋巴液轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，進(jìn)而侵犯正常組織和器官[1]。舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)與其他口腔惡性腫瘤相比，其惡性程度高，生長快，浸潤性強(qiáng)。由于舌部血供豐富，運(yùn)動(dòng)頻繁，導(dǎo)致TSCC常發(fā)生早期的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移率較高。近年來一些研究顯示，補(bǔ)骨脂乙素(isobavachalcone，IBC)具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等生物學(xué)活性。尤其是作為一種毒副作用小，來源經(jīng)濟(jì)的新型抗癌藥物，IBC的臨床應(yīng)用價(jià)值日益引起人們的重視。但是，IBC對舌癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是否有影響，尚未見報(bào)道。本研究將不同濃度的IBC作用于人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞遷移以及侵襲的影響，同時(shí)還觀察IBC對侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9及其上游Akt蛋白磷酸化表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、主要試劑IBC(純度>0.98)購自上海同田生物技術(shù)有限公司。MTT、Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。Transwell小室、基質(zhì)膠購于美國Sigma公司。所有抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(日本，MCO-20AIC，三洋電機(jī))；細(xì)胞涂片離心機(jī)(日本，Cyto-Tek Centrifuge，櫻花精機(jī)株式會社)；4℃高速離心機(jī)(日本，CF16RXⅡ，hitachi koki co.,ltd)；全波段酶標(biāo)儀(瑞士，M200，TECAN公司)；倒置顯微鏡(日本，IX51，OLYMPUS公司)；流式細(xì)胞儀(美國，F(xiàn)ACCSVERSE，Becton Dickinson公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國，IMAGE QUANT LAS 4000，GE HEALTHCARE公司)；半干轉(zhuǎn)機(jī)(美國，170-3940，BIO-RAD公司)。

1.3 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫。Tca8113細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基(含0.1的胎牛血清、1×105IU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)培養(yǎng)于37℃、0.05 CO2的培養(yǎng)箱中。

1.4 MTT分析將Tca8113細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL，大約5 000個(gè)細(xì)胞/孔。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的IBC，37℃、0.05 CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)12、24和48 h，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT溶液20 μL，到預(yù)定時(shí)間后小心吸去上清，避免藍(lán)色結(jié)晶脫落。隨后每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩搖勻10 min。用酶標(biāo)儀于490 nm波長條件下測定吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率/%=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100 %。計(jì)算IC50(藥物抑制50%細(xì)胞增殖時(shí)的藥物濃度)及繪制出細(xì)胞增殖抑制曲線。本次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行劃痕，加入不同濃度無血清的IBC培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在0 h及24 h取樣并拍照。遷移率/%=(原始劃痕平均距離-24 h劃痕平均距離)/ 原始劃痕平均距離×100%。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)Matrigel膠通過無血清培養(yǎng)基進(jìn)行1 ∶6稀釋。將稀釋后的Matrigel膠30 μL加入transwell上室，輕輕搖勻使其均勻鋪滿上室底部，放入培養(yǎng)箱30 min使其凝固，做成人工基底膜。將不含血清的培養(yǎng)基和5×104細(xì)胞(總體積為100 μL)加入上室，并加入不同濃度不含血清的IBC混勻。下室加入600 μL含0.10胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后取出小室，吸干上室內(nèi)液體，PBS沖洗后放入4%甲醛中固定15 min，加入0.1%結(jié)晶紫染液中染色15 min。用棉簽擦拭掉上室Matrigel凝膠及殘余細(xì)胞。高倍鏡下( ×400) 隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值作為穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot分析將0、10、20和40 μmol·L-1的IBC 作用Tca8113細(xì)胞24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)的裂解液采用含有蛋白酶抑制劑(100 mg·L-1PMSF，2 mg·L-1Aprotitin)的強(qiáng)RIPA裂解液(0.1% SDS，1% Triton-100，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA(pH 8.0)，10 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.5))。將收集到的細(xì)胞中加入適量裂解液冰上裂解30 min后，超聲震碎10 s，13 000 r·min-14℃離心20 min。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選用12%的SDS-聚丙烯凝膠，將20 μL蛋白樣品加入上樣孔中，電泳約2 h，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用5 %脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入Akt、p-Akt、MMP-2、MMP-9及β-actin抗體，4℃孵育過夜。TBST搖晃清洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗作用1 h，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 IBC對Tca8113細(xì)胞增殖的影響用0、10、20、40、80 μmol·L-1IBC分別處理舌癌Tca8113細(xì)胞12、24、48 h，通過MTT法檢測各組吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度IBC對Tca8113細(xì)胞均有增殖抑制作用(Fig 1)。IBC作用12、24和48 h的IC50分別為(280.22±7.45)、(128.31±6.83)和(56.37±6.75) μmol·L-1。12、24和48 h的IC50值相比，3組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，IBC可呈時(shí)間-劑量依賴性抑制Tca8113細(xì)胞的增殖。

Fig 1 Effects of IBC on Tca8113 cell proliferation (±s, n=3)

2.2 IBC對Tca8113細(xì)胞遷移及侵襲的影響為了明確IBC是否影響創(chuàng)傷修復(fù)，將采用了劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察。本次實(shí)驗(yàn)選用時(shí)間點(diǎn)為24 h，IBC處理濃度為10、20和40 μmol·L-1，是為了排除細(xì)胞凋亡對細(xì)胞遷移和侵襲的影響。20和40 μmol·L-1IBC作用于舌癌Tca8113細(xì)胞24 h后，劃痕愈合速度及侵襲性明顯低于對照組(P<0.05)(Fig 2、3)。這表明不同濃度的IBC可抑制Tca8113細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.3 IBC對Tca8113細(xì)胞MMP-2、MMP-9及其上游Akt蛋白表達(dá)的影響為探討IBC抑制Tca8113細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制，本次通過Western blot觀察0、10、20、40 μmol·L-1IBC處理舌癌細(xì)胞24 h后MMP-2、MMP-9蛋白的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20和40 μmol·L-1IBC可明顯下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，IBC具有明顯抑制Akt磷酸化的作用(Fig 4)。

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是癌癥最致命的特征，其占癌癥相關(guān)死亡率的90%以上[1]。由于舌部解剖學(xué)特征以及腫瘤篩查檢測靈敏性和特異性相對較低等原因，導(dǎo)致一部分TSCC患者確診時(shí)已出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這使得治療難以達(dá)到預(yù)期治療效果。目前TSCC最有效的治療方法為手術(shù)切除。然而，過度的手術(shù)切除常嚴(yán)重影響TSCC患者的口腔功能及術(shù)后生活質(zhì)量。放療、化療、免疫治療作為輔助性治療手段，使TSCC患者的生存率得到很大的改善，但仍沒有達(dá)到滿意的效果[2]。

Fig 2 IBC decreased invasion of Tca8113 cells(×200) Tca8113 cells were detected by an optical microscope

Fig 3 IBC decreased migration of Tca8113 cells(×400)

Tca8113 cells were detected by a optical microscope.A: Control group; B～D: 10, 20, 40 μmol·L-1IBC treated group

Fig 4 Effects of IBC on protein expression of Akt,p-Akt, MMP-2 and MMP-9 in Tca8113 cells

At 24 h after incubation with IBC, the expression levels of all proteins were analyzed by Western blot.

補(bǔ)骨脂作為中藥材，在我國廣泛分布?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)骨脂具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增強(qiáng)免疫力、抗菌及抗腫瘤等生理活性[3-4]。IBC最早是由Bhalla等[5]于1968年從補(bǔ)骨脂的果實(shí)中提取出來的一種活性成分。IBC屬查爾酮類，具有抗炎、抗菌、抗氧化等生物學(xué)活性。Nishimura等[6]研究表明，IBC通過線粒體途徑誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤凋亡，而對正常小腦顆粒細(xì)胞無細(xì)胞毒性。Jing等[7]也發(fā)現(xiàn)，IBC促進(jìn)腫瘤細(xì)胞OVCAR-8、PC3、A549、MCF-7的凋亡，同時(shí)又對正常細(xì)胞L-02、HUVEC無毒性作用。以上研究結(jié)果提示，IBC在對腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用的同時(shí)對血管內(nèi)皮細(xì)胞及正常肝細(xì)胞無明顯殺傷作用，也就意味著其對血管和肝臟無明顯毒副作用，這說明IBC有可能作為低毒高效的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。近期研究發(fā)現(xiàn)，IBC可抑制胃癌細(xì)胞的遷移以及侵襲。這表明IBC除了具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，還具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。

本研究通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察IBC對Tca8113細(xì)胞遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，Tca8113細(xì)胞的遷移能力逐漸減弱。然而，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程。腫瘤細(xì)胞通過降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)進(jìn)入血液或淋巴循環(huán)系統(tǒng)，并最終到達(dá)靶器官形成新的轉(zhuǎn)移灶。在本研究中，通過Transwell實(shí)驗(yàn)觀察IBC對舌癌細(xì)胞侵襲能力的影響。Transwell小室上鋪蓋了Matrigel膠，進(jìn)而模擬ECM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組的Tca8113細(xì)胞可以突破Matrigel膠進(jìn)入下室。隨著IBC藥物濃度的增高，Tca8113細(xì)胞逐漸失去穿透Matrigel膠的能力。以上結(jié)果表明，IBC呈劑量依賴性抑制舌癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力。

為了侵襲并擴(kuò)散到周圍的正常組織中，腫瘤細(xì)胞分泌以基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)為主的多種酶類，后者是一群鋅依賴性的內(nèi)肽酶，可以降解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)的成分[8]。Aparna等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9的高水平表達(dá)是舌癌患者腫瘤局部復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。此外，MMP-9還與舌癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及生存期密切相關(guān)。因此，MMPs是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白，尤其是MMP-2、MMP-9蛋白的高水平表達(dá)在一定程度上代表了舌癌細(xì)胞的高侵襲性[10]。本研究通過Western blot法證實(shí)，IBC明顯降低Tca8113細(xì)胞胞質(zhì)中MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)。這表明IBC通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)從而抑制了舌癌細(xì)胞的侵襲性。一些研究表明，異?；罨腁kt信號通路可激活一系列胞質(zhì)蛋白(如MMP-2、MMP-9)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IBC作用于Tca8113細(xì)胞可引起p-Akt蛋白表達(dá)的明顯降低。因此，抑制異常激活的Akt蛋白表達(dá)可能是IBC抑制舌癌Tca8113細(xì)胞侵襲性的機(jī)制之一。

本次研究證實(shí)了IBC通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)及其上游磷酸化Akt的蛋白表達(dá)從而抑制TSCC細(xì)胞遷移以及侵襲能力。然而，IBC通過何種通路抑制舌癌細(xì)胞的遷移和侵襲，還有待進(jìn)一步研究?？傊琁BC具有較明確的抑制舌鱗癌細(xì)胞遷移以及侵襲的作用，為IBC的進(jìn)一步藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

(本實(shí)驗(yàn)完成于遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室，在此對實(shí)驗(yàn)室的各位老師以及同學(xué)的幫助表示由衷的感謝！)

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Inhibitory effect of isobavachalcone on migration and invasion of Tca8113 cells and its mechanism

SHI Yi1, WU Wei-zhong1, HUO An1, ZHOU Wei1，ZHU Zhi-tu2

(1.DeptofStomatology,DanyangPeople′sHospitalofJiangsuProvince,DanyangJiangsu212300,China;2.DeptofOncology,FirstAffiliatedHospital,LiaoningMedicalCollege,JinzhouLiaoning121001,China)

Aim To explore the inhibitory effect of isobavachalcone (IBC) on migration and invasion of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells and its possible mechanism. Methods Tca8113 cells were treated in different concentrations of IBCinvitro. Cell proliferation was detected by MTT; Wound healing assay and Transwell chamber assay were used to detect the ability of cell migration and invasion; Western blot was applied to detect the expression of Akt, p-Akt, MMP-2 and MMP-9 proteins. Results IBC could inhibit the proliferation of Tca8113 cells in a concentration-and time-dependent manner. IBC can reduce cell migration and invasion. Western blot showed that IBC could an decrease the expression of p-Akt, MMP-2 and MMP-9 proteins in a concentration- dependent manner. However, the level of Akt was not affected by the concentration of IBC treatment. Conclusion IBC could inhibit the proliferation, migration and invasion in Tca8113 cells and its mechanism may be associated with the down-regulation of MMP-2 and MMP-9 proteins and the inhibition of phosphorylation of upstream Akt.

isobavachalcone; tongue squamous cell carcinoma; proliferation; migration; invasion; mechanism

時(shí)間：2015-11-24 11:00 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20151124.1100.044.html

2015-08-14,

2015-09-19

遼寧省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目資助課題(No L2010315)

史 毅(1987-)，男，碩士，醫(yī)師，研究方向：口腔頜面部惡性腫瘤，Tel: 0511-86553008,E-mail: shiyi6531110@163.com； 朱志圖 (1971-)，男，博士，教授，研究方向：腫瘤的分子靶向治療，通訊作者，Tel:0416-4673939,E-mail: jinxiaohong1986@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.12.022

A

1001-1978(2015)12-1741-05

R282.71；R329.24；R739.860.22；R979.1；R977.6