不可逆電穿孔治療胰腺癌的動物實(shí)驗(yàn)研究

寧周雨 王鵬 陳顥 解婧 朱曉燕 陳其文 高嵩 徐立濤 莊麗萍 宋利斌 姜峰 孟志強(qiáng)

·論著·

不可逆電穿孔治療胰腺癌的動物實(shí)驗(yàn)研究

寧周雨 王鵬 陳顥 解婧 朱曉燕 陳其文 高嵩 徐立濤 莊麗萍 宋利斌 姜峰 孟志強(qiáng)

目的觀察胰腺癌移植瘤不可逆電穿孔(IRE)術(shù)后腫瘤細(xì)胞凋亡情況，探討IRE技術(shù)對胰腺癌移植瘤的抗腫瘤效果及其安全性。方法 12只荷載VX2胰腺癌移植瘤的新西蘭大白兔隨機(jī)分為IRE治療組(10只)和對照組(2只)。治療組胰腺移植瘤行IRE治療，對照組不進(jìn)行處理。治療后第1、3、5、7、14 d各處死2只，取血分離血漿或血清檢測血肝腎功能及淀粉酶、肌酸激酶、caspose-3、TNF-α、VEGF、肌鈣蛋白I水平。取移植瘤行常規(guī)病理學(xué)檢查，采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，免疫組化法檢測瘤組織Bcl-2、HSP70、VEGF表達(dá)。結(jié)果 對照組及IRE 1、3、5、7、14 d組移植瘤平均最大徑分別為2.0、2.0、1.8、1.7、1.5、1.3 cm。治療組移植瘤的治療壞死區(qū)域和正常區(qū)域邊界清晰，壞死區(qū)邊緣可見大量紅細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，治療后14 d治療區(qū)邊緣出現(xiàn)腫瘤再生跡象。對照組瘤組織及IRE 1、3、5、7、14 d組移植瘤治療區(qū)邊緣組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)分別為52、78、98、135、196、217個/每200倍視野，隨時間延長而增加；Bcl-2陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為 39.3%、37.5%、51.9%、17.7%、31.0%、34.5%，總體呈下降趨勢；HSP70陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為12.6%、33.6%、27.4%、24.3%、31.4%、23.4%，術(shù)后均升高；VEGF陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為28.3%、27.2%、12.3%、8.7%、32.2%、12.2%，術(shù)后有所下降；血caspase-3 水平分別為0.185、0.345、0.312、0.210、0.558、0.173 μg/L，術(shù)后不同程度升高，7 d達(dá)峰值；血TNF-α水平分別為24.48、60.54、61.83、28.59、44.71、64.78 ng/L，術(shù)后維持在較高水平，14 d達(dá)峰值；血VEGF水平分別為75.18、123.76、178.66、58.2、68.68、64.09 ng/L，術(shù)后3 d達(dá)峰值，之后下降；血淀粉酶活性于術(shù)后1 d升高，3 d開始下降，14 d恢復(fù)正常；血肌酸激酶有不同程度升高；肝腎功能均未見明顯異常；血漿肌鈣蛋白I水平在正常范圍內(nèi)。結(jié)論 IRE通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生特異抗腫瘤免疫效應(yīng)及抑制血管生成來抑制胰腺移植瘤的生長，治療方法安全、有效。

胰腺腫瘤； 不可逆電穿孔； 細(xì)胞凋亡； 兔

冷凍消融、高強(qiáng)度聚焦超聲、微波消融術(shù)和射頻消融治療局部晚期及轉(zhuǎn)移性胰腺癌均可延長患者的生存期，但受到適應(yīng)證、禁忌證和不良反應(yīng)等因素的限制，治療效果仍不理想。不可逆電穿孔(irreversible electroporation, IRE)治療腫瘤是通過釋放kV級高壓的直流電，以電脈沖方式產(chǎn)生強(qiáng)力的電場，在細(xì)胞膜上產(chǎn)生永久性的納米孔，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。與前4種消融技術(shù)相比，它的滅活時間短、產(chǎn)熱少，對局部血運(yùn)影響小。它通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式滅活腫瘤，促使腫瘤抗原釋放，誘發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)[1-2]，同時最大限度地保留腫瘤周圍的正常組織，因此IRE的臨床應(yīng)用頗受期待。本研究觀察IRE治療新西蘭大白兔胰腺移植瘤的效果，探討其作用機(jī)制。

材料與方法

一、胰腺VX2移植瘤模型分組及IRE實(shí)施

VX2細(xì)胞株為兔鱗狀細(xì)胞癌，新西蘭大白兔胰體尾部VX2移植瘤模型由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心制備，共12只，體質(zhì)量2.1～3.4 kg。生長2周后分為對照組及IRE1、3、5、7、14 d組，每組2只。IRE組兔采用氯胺酮全麻，行氣管插管，注射肌松藥氯化琥珀膽堿，開腹后觀察成瘤情況。將Angio Dynamics 公司制造的Nami-Knife正負(fù)兩電極平行插入移植瘤內(nèi)，電極間距為1.0～1.5 cm，進(jìn)針深度1.0～1.5 cm，電壓1 800～2 400 V/cm，脈沖長度70 μs，脈沖數(shù)10次，脈沖時值90 μs。IRE術(shù)畢關(guān)腹，簡易呼吸器復(fù)蘇。

二、實(shí)驗(yàn)室檢測

對照組于術(shù)后1 d處死，各IRE組按相應(yīng)天數(shù)處死，取血分離血清或血漿，上全自動生化儀檢測肝腎功能、淀粉酶、肌酸激酶，采用ELISA法測定血caspase-3、TNF-α、VEGF、肌鈣蛋白I 水平。

三、胰腺組織病理檢查

取對照組移植瘤組織及IRE組治療交界處腫瘤組織，常規(guī)行病理學(xué)檢查。另取切片行TUNEL染色，按試劑盒(德國 Roche 公司)說明書操作。鏡下取3個200倍視野計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，取均值。采用免疫組化染色檢測Bcl-2、VEGF、HSP70蛋白表達(dá)。胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。鏡下取3個400倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，取均值。

四、PET/CT檢查

術(shù)前及術(shù)后14 d各取1只兔置于德國SIMENS Biography 16 sensation行PET/CT顯像。先行CT透射掃描，掃描電流80 mA，電壓120 kV；后行PET-3D采集。整個掃描時間為5 min。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般情況

治療過程中實(shí)驗(yàn)兔均出現(xiàn)脈沖式肌肉強(qiáng)直收縮，術(shù)后均存活。對照組及IRE1、3、5、7、14 d組移植瘤平均最大徑分別為2.0、2.0、1.8、1.7、1.5、1.3 cm。

PET/CT檢查見腹膜后明顯高代謝結(jié)節(jié)，邊緣模糊，與周圍組織分界不清，直徑大小均為2 cm，對照兔的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV max)為2.6，IRE 14 d兔的SUV max為4.1(圖1)。

二、VX2胰腺移植瘤組織病理改變

對照組兔的胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)可見直徑約2 cm腫瘤結(jié)節(jié)，表面灰紅色，質(zhì)偏軟，見豐富的供瘤血管(圖2A)；鏡下癌細(xì)胞密集生長，核大染色深，大小及形態(tài)各異，異常分裂象多見。IRE治療后1 d見移植瘤血管豐富，瘤組織充血水腫，無光澤，觸之較硬，中心有出血壞死灶；光鏡下治療區(qū)與周圍腫瘤組織邊界清晰，治療區(qū)內(nèi)腫瘤細(xì)胞核固縮、碎裂或溶解，血管腔結(jié)構(gòu)完整，但血竇內(nèi)皮結(jié)構(gòu)塌陷或血竇內(nèi)有較多的紅細(xì)胞積聚(圖2B)。3 d時移植瘤直徑縮小至約1.8 cm，表面淤血，中心為凝固性壞死；鏡下見治療區(qū)內(nèi)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)嗜伊紅染色明顯增加，部分區(qū)域腫瘤細(xì)胞完全溶解(圖2C)。5 d時移植瘤表面淤血，與周圍正常組織分界清晰；鏡下見治療區(qū)內(nèi)凝固性壞死物開始吸收，中心出現(xiàn)空腔，邊緣有大量成纖維細(xì)胞。7 d時移植瘤縮小至約1.5 cm，表面淤血，切面充血，觸之較硬；鏡下見凝固性壞死區(qū)大量液化吸收，肉芽組織從周邊長入壞死組織，血管增多。14 d時移植瘤直徑縮小至約1.3 cm，治療區(qū)與非治療區(qū)實(shí)質(zhì)邊界變清，觸之較硬；鏡下見治療區(qū)內(nèi)凝固性壞死消失，呈空腔化，血管腔結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)見紅細(xì)胞血栓形成，邊緣有大量的成纖維細(xì)胞，肉芽組織生長(圖2D)。

三、移植瘤組織細(xì)胞凋亡及Bcl-2、HSP70、VEGF蛋白表達(dá)的變化

對照組瘤組織及IRE 1、3、5、7、14 d組移植瘤治療區(qū)邊緣組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)分別為52、78、98、135、196、217個/每200倍視野，TUNEL陽性凋亡細(xì)胞隨時間逐漸增多(圖3A、3E、3I)；Bcl-2陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為39.3%、37.5%、51.9%、17.7%、31.0%、34.5%，術(shù)后第3天表達(dá)升高，但總體呈下降趨勢(圖3B、3F、3J)；HSP70陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為12.6%、33.6%、27.4%、24.3%、31.4%、23.4%，術(shù)后HSP70表達(dá)均升高，術(shù)后第1天上升最明顯(圖3C、3G、3K)；VEGF陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為28.3%、27.2%、12.3%、8.7%、32.2%、12.2%，術(shù)后VEGF水平有所下降(圖3D、3H、3L)。

四、各組兔血caspase-3、TNF-α、VEGF、肝腎功能、淀粉酶、肌酸激酶、肌鈣蛋白I水平

對照組及IRE 1、3、5、7、14 d組的血caspase-3水平分別為0.185、0.345、0.312、0.210、0.558、0.173 μg/L，各治療組均較對照組有不同程度升高，治療后7 d達(dá)峰值；血TNF-α水平分別為24.48、60.54、61.83、28.59、44.71、64.78 ng/L，各治療組均較對照組升高，治療后14 d達(dá)峰值；血VEGF水平分別為75.18、123.76、178.66、58.20、68.68、64.09 ng/L，治療后3 d達(dá)峰值，之后下降并趨于穩(wěn)定(表1)。IRE術(shù)后血肌酸激酶有不同程度升高；血清淀粉酶在術(shù)后1 d升高，3 d后下降，14 d恢復(fù)正常水平；肝腎功能均未見明顯異常；血漿肌鈣蛋白I水平均在正常范圍內(nèi)(表1)。

圖1 對照兔(1A、1B)和IRE 14 d(1C、1D)兔的CT平掃及PET/CT融合圖

圖2 荷瘤兔胰腺大體標(biāo)本(2A)及IRE治療后1(2B)、3(2C)、14(2D)d移植瘤組織病理改變(HE ×400)

圖3 對照組和IRE 3、14 d組胰腺癌移植瘤治療邊緣組織的細(xì)胞凋亡(3A、3E、3I，TUNEL ×200)及Bcl-2(3B、3F、3J)、HSP70(3C、3G、3K)、VEGF(3D、3H、3L)表達(dá)(Envision法 ×400)

討 論

IRE在前列腺[3]、 頸動脈[4]、心耳[5]、胰腺[6-7]、小腸[8]、腎臟[9]和肺[10]的應(yīng)用顯示其有效且安全。IRE可造成消融組織壞死，但可保留組織周圍重要結(jié)構(gòu)及其功能，如前列腺IRE時周圍盆腔神經(jīng)節(jié)，腎臟IRE 時腎盂，胰頭IRE時十二指腸和周圍血管均未明顯損傷。

目前IRE已應(yīng)用于多種腫瘤的治療。美國的一項(xiàng)臨床研究[11]共納入150例，包括66例肝、6 例腎臟、59例胰腺、18例肺和18其他腫瘤(腎癌、前列腺癌、 食道、骶骨、縱隔和腎上腺)，術(shù)后主要并發(fā)癥為圍手術(shù)期死亡，惡心、嘔吐，感染，劇烈疼痛，自限性ST段壓低，膽漏，膽道狹窄，因出血需要輸血，門靜脈血栓形成，消融不完全等。該研究中位隨訪期18個月，其中35例(31%)腫瘤復(fù)發(fā)(局部和遠(yuǎn)處)，平均復(fù)發(fā)時間為6.7個月。有學(xué)者[12-13]對肝癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚腫瘤動物模型施行體內(nèi)IRE術(shù)，均取得了良好的治療效果，術(shù)后心臟、肌肉及各大重要臟器功能未見明顯損傷。本研究結(jié)果顯示，兔移植瘤直徑從治療前的2 cm縮小至治療2周后的1.3 cm，同時肝腎功能、肌鈣蛋白I水平均在正常值以內(nèi)，表明IRE治療腫瘤有效且安全，與董曉靜等[14]的結(jié)果一致。由于實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)兔均出現(xiàn)肌肉強(qiáng)直收縮，雖然應(yīng)用琥珀膽堿能減輕肌肉收縮強(qiáng)度，但不能完全避免，因此導(dǎo)致血CK-MB水平升高。減小脈沖長度，降低電場強(qiáng)度有助于減少肌肉收縮[13]，故在臨床應(yīng)用時應(yīng)不斷優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，減少術(shù)中的不良反應(yīng)。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)的變化(均值)

注：ALB：白蛋白；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；GGT：谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；ALP：堿性磷酸酶；BUN：尿素氮；CREA：血肌酐；AMY：血清淀粉酶；CK-MB：肌酸磷化脢-同功脢MB；CTnI：肌鈣蛋白I

IRE療法的主要作用機(jī)制是不可逆性電穿孔效應(yīng)[15]，此外，IRE能下調(diào)Bcl-2/Bax表達(dá)的比值，上調(diào)caspase-3的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。Mi等[17]的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，瞬間高壓脈沖電場能增加Wister大鼠T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的免疫活性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的能力，增強(qiáng)荷瘤鼠的機(jī)體細(xì)胞免疫功能。TNF-α是一多效的促炎因子，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)功能；HSP70是熱休克蛋白家族中最保守、最重要的一族，通過交叉遞呈激活更強(qiáng)烈的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，抑制腫瘤的生長[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IRE組移植瘤治療區(qū)邊緣組織Bcl-2蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡數(shù)增加，血清caspase-3、TNF-α、HSP70水平升高，表明IRE術(shù)后移植瘤細(xì)胞凋亡呈持續(xù)性增強(qiáng)，有效地激發(fā)機(jī)體自身免疫系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫瘤的后繼效應(yīng)。

血管內(nèi)皮生長因子是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移重要的啟動子之一。Mi等[19]另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，陡脈沖還可破壞腫瘤營養(yǎng)血管和毛細(xì)淋巴管，使其栓塞并凝固性壞死，導(dǎo)致組織血供減少而造成細(xì)胞死亡；同時下調(diào)VEGF-A和VEGF-C表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的遷移。本研究結(jié)果顯示，IRE術(shù)后治療區(qū)的小血管內(nèi)可見紅色血栓形成；治療邊緣區(qū)組織VEGF表達(dá)水平下調(diào)，血VEGF水平下降，提示IRE能阻斷腫瘤血供，有效抑制腫瘤生長。

由于本研究實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)較少，IRE促凋亡、刺激免疫、抑制侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制以及治療各項(xiàng)參數(shù)的優(yōu)化和選擇還需更多臨床前的研究。

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(本文編輯：呂芳萍)

《中華胰腺病雜志》第二屆編輯委員會成員名單

(以下名單按漢語拼音排列)

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劉 榮 劉善榮 劉小偉 劉續(xù)寶 劉玉蘭 樓文暉 陸建平 呂 賓 呂農(nóng)華 呂 毅 麻樹人 馬清涌

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Irreversible electroporation treatment of pancreatic cancer xenograft in New Zealand white rabbits

NingZhouyu,WangPeng,ChenHao,XieJing,ZhuXiaoyan,ChenQiwen,GaoSong,XuLitao,ZhangLiping,SongLibing,JiangFeng,MengZhiqiang.DepartmentofIntegrative,CancerHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

Correspondingauthor:MengZhiqiang,Email:mengzhq@yeah.net

Objective To investigate the apoptosis of pancreatic cancer xenograft after irreversible electroporation (IRE) treatment, and observe the antitumor effect and safety of IRE technique. Methods Twelve New Zealand white rabbits with pancreatic cancer xenograft were randomly divided into IRE treatment group (n=10) and control group (n=2). The treatment group received IRE; the control group received no treatment. Two rabbits were sacrificed at 1st, 3rd, 5th, 7th, 14th day after IRE treatment, the blood plasma or blood serum was separated to detect the liver and renal function, amylase, creatine kinase, caspase-3, TNF-α, VEGF, CTnI. Pancreatic cancer xenograft was taken for routine pathological examination. TUNEL assay was used to detect the apoptosis of tumor cells. Immunohistochemistry was applied to detect Bcl-2, HSP70 and

Pancreatic neoplasms; Irreversible electroporation; Apoptosis; Rabbits

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.06.004

200032 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系(寧周雨、王鵬、陳顥、解婧、朱曉燕、陳其文、高嵩、徐立濤、莊麗萍、宋利斌、孟志強(qiáng))；濰坊諸城中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科(姜峰)

孟志強(qiáng)，Email: mengzhq@yeah.net

2015-04-20)

VEGF protein expression. Results The median maximum pancreatic cancer xenograft of control group and IRE 1st, 3rd, 5th, 7th, 14th d group was 2.0, 2.0, 1.8, 1.7, 1.5, 1.3 cm. HE staining showed a clear borderline between the necrotic and normal area of IRE treated tumor, and with a large number of red blood and inflammatory cells infiltrated near the necrotic area′s edge. After 14 days of treatment, regeneration appeared in the treatments edge. The number of TUNEL positive cell near the treatment′s edge was 52, 78, 98, 135, 196, 217/ per 200 magnification in control group and IRE 1st, 3rd, 5th, 7th, 14th d group, and the number increased with time; the percent of positive cell of Bcl-2 was 39.3%, 37.5%, 51.9%, 17.7%, 31.0%, 34.5%, and it showed a decreasing trend; the percent of positive cell of HSP70 was 12.6%, 33.6%, 27.4%, 24.3%, 31.4%, 23.4%, and it all increased when compared with that of control group; the percent of positive cell of VEGF was 28.3%, 27.2%, 12.3%, 8.7%,32.2%, 12.2%, which decreased when compared with that of control group; the serum caspase 3 level was 0.185, 0.345, 0.312, 0.210, 0.558, 0.173 μg/L, which increased when compared with that of control group and reached the peak at 7 d; the serum TNF-α level was 24.48, 60.54, 61.83, 28.59, 44.71, and 64.78 ng/L, which remained at high level and reached the peak at 14 d; the serum VEGF level was 75.18, 123.76, 178.66, 58.2, 68.68, 64.09 ng/L, which reached the peak at 3rd day and gradually decreased. The serum amylase level increased at the 1st day, and decreased at 3rd day, and it returned to normal at 14th day. The liver and kidney functions, and serum CTnI levels were within the normal range, higher level of serum creatine kinase was found. Conclusions IRE can inhibit the growth of pancreatic tumors via inducing apoptosis, producing specific anti-tumor immune response, and inhibiting angiogenesis, which is a safe and effective approach for pancreatic cancer.