何首烏對(duì)潑尼松致大鼠股骨微結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)改變的預(yù)防作用

周滿如，李 近，吳敬開，曾小斌，陳景鋒，崔 燎，，劉鈺瑜

（廣東醫(yī)學(xué)院1．藥理學(xué)教研室、2．廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524023）

何首烏對(duì)潑尼松致大鼠股骨微結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)改變的預(yù)防作用

周滿如1，李 近1，吳敬開1，曾小斌2，陳景鋒1，崔 燎1，2，劉鈺瑜1

（廣東醫(yī)學(xué)院1．藥理學(xué)教研室、2．廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524023）

中國圖書分類號(hào)：R-332；R282．71；R284.1；R336；R681.01

摘要：目的 探討何首烏對(duì)潑尼松致大鼠股骨微結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)改變的預(yù)防作用。方法 6月齡SD♂大鼠按體重隨機(jī)分成9組：空白對(duì)照組、潑尼松組、羅蓋全組、何首烏30%醇提取物（高、中、低劑量）組、何首烏總提取物（高、中、低劑量）組。采用潑尼松連續(xù)灌胃21周建立骨丟失動(dòng)物模型，藥物預(yù)防組在給予潑尼松同時(shí)灌胃給予不同的藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取右股骨進(jìn)行Micro-CT掃描及三維重建，觀察松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)及檢測(cè)相關(guān)參數(shù)，并進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)定。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型組出現(xiàn)骨微結(jié)構(gòu)的破壞，BV／TV下降28.6%（P＜0.05），骨生物力學(xué)性能降低，剛度下降29.7% （P＜0.01）。與模型組比較，陽性組對(duì)骨微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)性能有明顯改善作用，BV／TV上升46．7%（P＜0.01），剛度上升25.9%（P＜0.01）。何首烏30%醇提取物中、低劑量對(duì)骨微結(jié)構(gòu)有改善作用，BV／TV分別上升46.7%（P＜0.01）和40.0%（P＜0.05），何首烏總提取物高劑量對(duì)生物力學(xué)有改善作用，剛度上升24.7%（P＜0.05），但改善作用比不上陽性組。結(jié)論 潑尼松可引起大鼠股骨生物力學(xué)性能降低，骨微結(jié)構(gòu)異常；何首烏30%醇提取物中、低劑量以及何首烏總提取物高劑量可以預(yù)防潑尼松導(dǎo)致的大鼠股骨松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)破壞和股骨生物力學(xué)性能的下降，其他劑量組對(duì)此無明顯的預(yù)防作用。

關(guān)鍵詞：何首烏；潑尼松；骨微結(jié)構(gòu)；骨生物力學(xué)；骨質(zhì)疏松；大鼠

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．019．html

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是在使用糖皮質(zhì)激素（glucocorti-coid，GC）治療疾病過程中引起的骨量丟失，以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨強(qiáng)度下降為特征的一種疾?。?］，易增強(qiáng)骨脆性，致患者發(fā)生骨折。GIOP是應(yīng)用GC后出現(xiàn)的常見不良反應(yīng)之一。GIOP的主要原因是骨形成明顯的下降，所以尋找療效確切、經(jīng)濟(jì)易得、不良反應(yīng)小的促骨形成藥物一直是骨藥理學(xué)，

尤其是糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松防治的研究熱點(diǎn)。何首烏（Polygonum Multiflorum，PM）作為一種中國傳統(tǒng)藥材，臨床上被廣泛應(yīng)用。已有研究報(bào)道，何首烏及其提取物有防治骨質(zhì)疏松的作用［2－4］。何首烏主要含3類成分：二苯乙烯苷類化合物、蒽醌類以及磷脂。我們前期研究初步探討了何首烏的主要成分大黃素，二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbene glucoside，TSG）對(duì)骨代謝相關(guān)細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)大黃素能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BM-SCs）向成骨細(xì)胞方向分化，抑制BMSCs向脂肪細(xì)胞方向分化［5－8］。二苯乙烯苷能促進(jìn)BMSCs堿性磷酸酶表達(dá)，刺激骨鈣素分泌，上調(diào)Col1a1和Runx2 mRNA的表達(dá)，增加Wnt信號(hào)通路核心蛋白（β-catenin）mRNA和蛋白的表達(dá)，本研究在活性指導(dǎo)下進(jìn)行何首烏提取、分離和純化［9］，并進(jìn)一步觀察其在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)GIOP的防治效果。我們課題組也曾發(fā)現(xiàn)何首烏能有效預(yù)防去卵巢大鼠的骨丟失［10］，但對(duì)何首烏及其有效成分對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)大鼠骨丟失的效果如何，目前仍不清楚，本文主要探討何首烏對(duì)糖皮質(zhì)激素致大鼠骨丟失的影響，為研究和開發(fā)何首烏抗骨質(zhì)疏松的作用及發(fā)現(xiàn)其抗骨質(zhì)疏松的有效成分提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只♂6月齡SD大鼠，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量（210±20）g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2008－0008。

1．2藥品及儀器 生何首烏藥材購自廣西玉林市祥生中藥飲片有限責(zé)任公司（產(chǎn)地：河南），醋酸潑尼松片購自廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司（批號(hào)：140602），羅蓋全購自上海羅氏制藥有限公司（批號(hào)：B40B5）。viva micro-CT 40（SCANCO Medi-calAG，瑞士）、858 Mini Bionix型材料測(cè)試機(jī)及測(cè)試系統(tǒng)（MTS，美國）。何首烏總提取物是采用75%乙醇溫浸提取后濃縮得浸膏，何首烏30%醇提取物是采用何首烏總提取物經(jīng)D101大孔樹脂富集，按照0 ～90%乙醇梯度洗脫，收集30%乙醇洗脫部位，濃縮制得。

1．3糖皮質(zhì)激素骨丟失模型的建立及動(dòng)物分組 6月齡SD♂大鼠按體重隨機(jī)分成9組：空白對(duì)照組、潑尼松模型組（6 mg·kg－1·d－1）；何首烏30%醇提取物高、中、低劑量組分別為：潑尼松6 mg·kg－1·d－1＋何首烏30%醇提取物400 mg·kg－1·d－1、潑尼松6 mg·kg－1·d－1＋何首烏30%醇提取物200 mg·kg－1·d－1、潑尼松6 mg·kg－1·d－1＋何首烏30%醇提取物100 mg·kg－1·d－1；何首烏總提取物高、中、低劑量組分別為：潑尼松6 mg·kg－1·d－1＋何首烏總提取物400 mg·kg－1·d－1、潑尼松6 mg·kg－1·d－1＋何首烏總提取物200 mg· kg－1·d－1、潑尼松6 mg·kg－1·d－1＋何首烏總提取物100 mg·kg－1·d－1；陽性對(duì)照組：潑尼松6 mg ·kg－1·d－1＋羅蓋全0.045 μg·kg－1·d－1。每組大鼠按5 mL－1·d－1灌胃給藥，連續(xù)給藥21周。每周稱體重1次，并按體重變化調(diào)整給藥量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠麻醉后心臟抽血處死，迅速取出右股骨保存。

1．4Micro-CT測(cè)量股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨定量參數(shù) 將右股骨上面殘存的肌肉剔除處理好的股骨遠(yuǎn)心端（完整）標(biāo)本沿長軸垂直固定于樣品固定器內(nèi)。Viva CT 40選擇掃描參數(shù)：圖像矩陣為2048×2048，整合時(shí)間（integration time）為200 ms，能量／強(qiáng)度為70kVp、114 μA、8W。以0°旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行掃描。掃描完成后，選取距生長板遠(yuǎn)端1.0 mm、層厚3.0 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域（ROI）行三維重組，以最低閾值為170提取圖像信息。獲得重組圖像后，使用Micro-CT自帶的軟件進(jìn)行定量分析。物理參數(shù)分析如下：骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume／total volume，BV／TV）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（structure model index，SMI）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb．N）、骨小梁分離度（trabecu-lar separation，Tb．Sp）、骨小梁厚度（trabecular thick-ness，Tb．Th）、連接密度（Dens）、H-h、B-b，見Fig 1。

Fig 1 The cross-sectional diagram of femur

1．5骨生物力學(xué)參數(shù)測(cè)定 檢測(cè)時(shí)，將50%乙醇—生理鹽水保存的右股骨置于流變儀上分別進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，加載速度為0.01 mm·s－1，跨距為15 mm［11］。記錄載荷－變形曲線，從曲線上直接獲取或依公式計(jì)算出相應(yīng)的力學(xué)指標(biāo)：彈性載荷（elas-tic load）、最大載荷（maximum load）、斷裂載荷（break load）、剛度（stiffness）參數(shù)。

2　結(jié)果

2．1各組大鼠給藥期間的體重變化 隨機(jī)分組后，每周稱體重1次調(diào)節(jié)飼料重量，自由飲水與進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)初期各組體重差別不大，實(shí)驗(yàn)后期模型組體重比正常組、給藥組體重低。給藥期間各組大鼠的體重變化，見Fig 2。

Fig 2 Changes of administration period（21 weeks）of weight in rats in different group

2．2各組大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨Micro-CT定量參數(shù)的變化 與空白對(duì)照組比較，模型組Micro-CT結(jié)果顯示，BV／TV下降28.6%（P＜0.05）、連接密度、H-h、B-b下降（P＜0.05），骨微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。①與模型組比較，羅蓋全組大鼠的BV／TV上升46.7%（P＜0.01）、連接密度、H-h、B-b、骨小梁數(shù)目明顯增加（P＜0.01），骨小梁分離度明顯減少（P＜0.01），骨微結(jié)構(gòu)有明顯的改善。②與模型組比較，何首烏30%醇提取物高劑量組的連接密度、H-h明顯上升（P＜0.01）、B-b上升（P＜0.05），對(duì)骨微結(jié)構(gòu)有一定程度的改善，骨密度無明顯改變。③與模型組比較，何首烏30%醇提取物中劑量組BV／TV上升46.7%（P＜0.01）、連接密度、H-h、B-b、骨密度明顯上升（P＜0.01），結(jié)構(gòu)模型指數(shù)下降、骨小梁分離度下降（P＜0.05），骨微結(jié)構(gòu)明顯改善。④與模型組比較，何首烏30%醇提取物低劑量組BV／TV上升40%（P＜0.05）、連接密度、骨密度上升（P＜0.05），H-h、B-b明顯上升（P＜0.01），結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、骨小梁分離度下降（P＜0.05），骨微結(jié)構(gòu)明顯改善。⑤與模型組比較，何首烏總提取物高劑量組連接密度、H-h、B-b明顯上升（P＜0.01），骨小梁數(shù)目增加（P＜0.05），對(duì)骨微結(jié)構(gòu)有一定程度的改善，骨密度無明顯改變。⑥與模型組比較，何首烏總提取物中、低劑量組H-h明顯上升（P＜0.01）、B-b上升（P＜0.05），對(duì)骨微結(jié)構(gòu)、骨密度無明顯改變。何首烏30%醇提取物中劑量、低劑量與何首烏總提取物高劑量可以預(yù)防潑尼松導(dǎo)致的大鼠股骨松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)破壞，增加骨密度，但作用不及陽性組，與陽性組相比，連接密度、Tb．N、BMD等參數(shù)降低，其他劑量組對(duì)此無明顯的預(yù)防作用。見Tab 1。

2．3各組大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨Micro-CT的3D圖Micro-CT的三維可視化成像結(jié)果形象地展示了各組大鼠股骨遠(yuǎn)心端松質(zhì)骨的形態(tài)變化情況。

空白對(duì)照組骨小梁走向一致，粗細(xì)均勻，形狀規(guī)則，排列密集；模型組骨小梁稀疏、排列不均、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失、呈現(xiàn)明顯的骨微結(jié)構(gòu)破壞，不能保持完整的微觀構(gòu)筑。與模型組比較，陽性對(duì)照組、何首烏30%醇提取物中、低劑量組、何首烏總提取物高劑量組的骨微結(jié)構(gòu)破壞較模型組有所減輕，表現(xiàn)為骨小梁增多，間隙變小，出現(xiàn)較多完整的骨小梁連接結(jié)構(gòu)，其中陽性組尤為明顯。與模型組相比，何首烏30%醇提取物高劑量組、何首烏總提取物中、低劑量組對(duì)此無改善作用。見Fig 3。

Fig 3 Segmented（SEG）image of micro-CT of distal femur in rats in different groups

與陰性對(duì)照組比較，骨小梁分離度圖中模型組紅色部分明顯增多，橙色、黃色也較多，提示模型組分離度增大，骨小梁之間的距離明顯變大。與模型

組比較，陽性對(duì)照組、何首烏30%醇提取物中、低劑量組綠色增多，紅色、橙色、黃色減少，提示這些組骨小梁分離度變小，骨小梁之間的距離變小，陽性組的現(xiàn)象更為明顯。何首烏30%醇提取物高劑量組、何首烏總提取物高、中、低劑量組的綠色變多，紅色、橙色、黃色變少，提示這些組的骨微結(jié)構(gòu)有一定改善作用。見Fig 4。

Tab 1 Changes of microstructural parameters of distal femur in rats in different groups（±s）

Tab 1 Changes of microstructural parameters of distal femur in rats in different groups（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Pred；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs CAL

Group　BV／TV／%　Dens　SMI　H-h／mm　B-b／mm　Tb．N／mm－1　Tb．Th／mm　Tb．Sp／mm　BMD／mg·cm－2CON　0．21±0．04　56．18±9．53　1．54±0．295　1．04±0．13　1．14±0．11　2．34±0．51　0．09±0．01　0．48±0．14　155．40±30．39 Pred　0．15±0．04　39．25±8．20**1．96±0．42　0．73±0．08　0．83±0．084**1．89±0．36　0．08±0．01　0．58±0．12　116．68±38．35 CAL　0．22±0．08△△　66．03±16．41△△1．54±0．57　0．94±0．09△△　0．97±0．05△△　3．04±0．82△△0．09±0．01　0．37±0．13△△178．06±50．44△△30%ethanol eluent of the PM（H）　0．18±0．05　54．94±11．38△△1．73±0．44　0．90±0．11△△　0．93±0．08△　2．25±0．46＃?！?．08±0．01　0．49±0．10?！?45．52±42．46 30%ethanol eluent of the PM（M）　0．22±0．05△△　58．74±9．78△△1．37±0．51△　0．93±0．08△△　0．97±0．05△△　2．37±0．39?！?．09±0．01　0．46±0．08△　172．27±35．76△△30%ethanol eluent of the PM（L）　0．21±0．07△　54．07±11．90△＃1．39±0．66△　0．91±0．04△△　1．01±0．06△△　2．31±0．32＃＃　0．09±0．01　0．47±0．06　161．01±48．97△PM（H）　0．19±0．02　62．13±13．11△△1．59±0．25　0．90±0．05△△　1．03±0．09△△　2．55±0．71△　0．08±0．01　0．45±0．14△　150．74±15．68 PM（M）　0．18±0．07　47．67±13．29＃＃1．73±0．59　0．94±0．08△△　0．93±0．09△　2．13±0．49＃?！?．09±0．01　0．51±0．10?！?33．85±54．79＃PM（L）　0．19±0．05　56．06±11．93△△1．66±0．43　0．91±0．10△△　0．91±0．21　2．30±0．61＃?！?．09±0．01　0．49±0．15＃142．74±41．03

Fig 4 Trabecular separation image of micro-CT of distal femur in rats in different groups

與陰性對(duì)照組比較，骨小梁厚度圖中模型組紅色部分減少不明顯，說明骨小梁厚度變薄不明顯。與模型組比較，所有的給藥組紅色部分都沒有明顯增多，說明厚度增加不明顯。見Fig 5。

Fig 5 Trabecular thickness image of micro-CT of distal femur in rats in different groups

2．4各組大鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)的變化 與空白對(duì)照組比較，模型組出現(xiàn)骨生物力學(xué)參數(shù)減小，彈性載荷下降19.7%（P＜0.01）、最大載荷下降14.6% （P＞0.05）、斷裂載荷下降16.2%（P＞0.05）、剛度下降29.7%（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組生物力學(xué)參數(shù)彈性載荷上升21.9%（P＜0.05）、斷裂

載荷上升12.2%（P＞0.05）、最大載荷上升8.7% （P＞0.05）、剛度上升25.9%（P＜0.01），提示對(duì)骨生物力學(xué)性能有明顯改善作用。與模型組比較，何首烏30%醇提取物中劑量彈性載荷上升8.1%（P ＞0.05）、最大載荷上升10.7%（P＞0.05）、斷裂載荷上升15.1%（P＞0.05）、剛度上升15.7%（P＞0.05）。與模型組比較，何首烏30%醇提取物低劑量組彈性載荷上升12.3%（P＞0.05）、最大載荷上升9.1%（P＞0.05）、斷裂載荷上升4.8%（P＞0.05）、剛度上升14.5%（P＞0.05）。與模型組比較，何首烏總提取物高劑量組彈性載荷上升24.1% （P＜0.05）、最大載荷上升9.3%（P＞0.05）、斷裂載荷上升8.1%（P＞0.05）、剛度上升24.7%（P＜0.05），提示對(duì)生物力學(xué)參數(shù)有一定改善作用，但改善作用不及陽性組。何首烏30%醇提取物高劑量與何首烏總提取物中、低劑量對(duì)骨微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)參數(shù)改善作用不明顯。見Tab 2。

3　討論

3．1長期給予糖皮質(zhì)激素可致大鼠骨微結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)改變 由Tab 1～2和Fig 3～5可見，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠體重明顯下降。Micro-CT結(jié)果顯示，模型組骨體積分?jǐn)?shù)、連接密度、H-h、B-b下降。骨體積分?jǐn)?shù)是描述松質(zhì)骨細(xì)微結(jié)構(gòu)一個(gè)非常重要的參數(shù)，其意義在于能反映松質(zhì)骨樣本內(nèi)骨組織體積的含量。從Micro-CT的三維重建圖像和數(shù)據(jù)中，可以直接得出骨體積分?jǐn)?shù)準(zhǔn)確值，結(jié)果提示，潑尼松可使大鼠股骨的骨體積分?jǐn)?shù)下降。此外，可從三維結(jié)構(gòu)重建后的大鼠股骨遠(yuǎn)心端股骨分割圖直接觀察骨小梁的結(jié)構(gòu)形態(tài)。骨小梁分離度圖可直接反映骨小梁的距離情況，從綠到紅，反映了骨小梁之間的距離越來越大，骨質(zhì)疏松越來越嚴(yán)重。骨小梁厚度圖除了可見骨小梁的結(jié)構(gòu)和幾何信息外，還可直接反映骨小梁的厚度分布情況，從綠到紅，反映了骨從薄到厚，從骨骼的結(jié)構(gòu)參數(shù)及力學(xué)參數(shù)的定量數(shù)值，觀察骨微結(jié)構(gòu)變化［11］。本實(shí)驗(yàn)從Micro-CT 的3D圖可見，潑尼松組大鼠骨小梁變稀疏、數(shù)目減少、變細(xì)、間距變寬、形態(tài)不規(guī)則、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀疏、排列不均，呈現(xiàn)出明顯的骨微結(jié)構(gòu)異常，不能保持完整的微觀構(gòu)筑，表明大鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生了骨質(zhì)疏松樣改變。同時(shí)潑尼松組骨生物力學(xué)參數(shù)（彈性載荷、剛度）減小，提示骨量減少的同時(shí)骨的結(jié)構(gòu)、力學(xué)特性也明顯減弱，內(nèi)在硬度、抗變形能力下降，承重負(fù)重能力下降。

糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制為［12－13］：①激素直接抑制成骨細(xì)胞產(chǎn)生，加速成骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)可抑制胰島素樣生長因子在成骨細(xì)胞表達(dá)，降低骨轉(zhuǎn)換率。②增加繼發(fā)性甲狀旁腺素分泌，激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收，導(dǎo)致骨量減少。③抑制胃腸道對(duì)鈣的吸收，增加鈣磷排泄。④引起睪酮缺乏，抑制十二指腸跨膜鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性，減少鈣離子結(jié)合蛋白的合成，導(dǎo)致腸道鈣吸收障礙，繼而抑制骨形成，促進(jìn)骨吸收。⑤抑制雌激素分泌，降低鈣磷在骨質(zhì)的沉著。⑥引起脂質(zhì)代謝異常，造成骨髓微脂肪栓形成，骨髓微循環(huán)壓力增高，骨缺血壞死。

3．2羅蓋全和何首烏提取物對(duì)糖皮質(zhì)激素大鼠骨微結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)改變的預(yù)防作用 由Tab 1～2，F(xiàn)ig 3～5可見，與模型組比較，羅蓋全組大鼠的骨體積分?jǐn)?shù)、連接密度、H-h、B-b、骨小梁數(shù)目明顯增加，骨小梁分離度明顯減少，骨微結(jié)構(gòu)有明顯的改善。彈性載荷、剛度明顯增加，骨生物力學(xué)性能得到改善。羅蓋全即骨化三醇，是維生素D3生物活性的主要代謝產(chǎn)物，其作用機(jī)制主要為通過與作用部位的受體結(jié)合，促進(jìn)腸道對(duì)鈣離子的吸收及腎小管對(duì)鈣的重吸收，抑制甲狀旁腺激素的合成與分泌，從而調(diào)節(jié)骨代謝，促進(jìn)骨形成［14］。

Tab 2 Changes of biomechanical properties of femur in rats in different groups（±s）

Tab 2 Changes of biomechanical properties of femur in rats in different groups（±s）

**P＜0.01 vs CON；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Pred；＃P＜0.05 vs CAL

733．60±101．84 Pred　80．80±16．70　170．24±22．36　161．19±30．45　515．57±127．80**CAL　98．52±15．14△　185．03±26．45　180．78±32．70　649．34±110．87△△30%ethanol eluent of the PM（H）　84．25±16．22　183．00±34．09　180．18±31．56　546．11±93．56＃30%ethanol eluent of the PM（M）　87．31±9．68　188．48±27．78　185．59±28．64　596．70±81．76 30%ethanol eluent of the PM（L）　90．73±11．07　185．78±35．82　168．94±46．64　603．23±98．72 PM（H）　100．25±16．27△　185．99±23．94　174．23±37．78　642．83±89．27△PM（M）　86．52±18．98　181．10±38．01　175．96±37．56　575．74±120．33 PM（L）　90．08±16．45　179．41±29．95　169．61±26．57　595．Group　Elastic load／N　Maximum load／N　Break load／N　Stiffness／N·mm－1CON　100．60±15．77　199．25±27．99　192．33±36．27 99±97．08

由Tab 1～2，F(xiàn)ig 3～5可見，與模型組比較，①何首烏30%醇提取物高劑量組的連接密度、H-h明顯上升、B-b上升，結(jié)果提示該組對(duì)骨微結(jié)構(gòu)與生物

力學(xué)雖有一定趨勢(shì)的改善，但并無明顯變化。②何首烏30%醇提取物中、低劑量組骨體積分?jǐn)?shù)、連接密度、H-h、B-b、骨密度明顯上升，結(jié)構(gòu)模型指數(shù)下降、骨小梁分離度下降，結(jié)果提示該組對(duì)骨微結(jié)構(gòu)明顯改善，但對(duì)骨生物力學(xué)性能并無明顯改變。③何首烏總提取物高劑量組連接密度、H-h、B-b明顯上升，骨小梁數(shù)目、彈性載荷、剛度上升。結(jié)果提示該組對(duì)骨微結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)都有一定程度的改善。④何首烏總提取物中、低劑量組H-h明顯上升、B-b上升，結(jié)果提示該組對(duì)骨微結(jié)構(gòu)、骨密度與骨生物力學(xué)性能無明顯改變。此外，本實(shí)驗(yàn)從Micro-CT的3D圖可見，與模型組比較，陽性對(duì)照組、何首烏30%醇提取物中、低劑量組、何首烏總提取物高劑量組的骨微結(jié)構(gòu)破壞較模型組有所減輕，表現(xiàn)為骨小梁增多，間隙變小，出現(xiàn)較多完整的骨小梁連接結(jié)構(gòu)。同時(shí)骨小梁分離度變小，骨小梁之間的距離變小。這3個(gè)何首烏提取物組對(duì)潑尼松大鼠骨的改善作用相近，他們之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余用藥組沒有看到這種對(duì)骨的改善作用。所有給藥組骨的厚度增加都不明顯，厚度與模型組相近。

何首烏是中醫(yī)常用的傳統(tǒng)藥材，補(bǔ)腎活血，藥理作用廣，藥用價(jià)值高。有效預(yù)防去卵巢大鼠的骨量丟失，具有抑制骨吸收的作用［10］，但目前還不清楚何首烏有效成分及其提取物對(duì)抗糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松的防治作用。本文主要從股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨Micro-CT定量參數(shù)和骨生物力學(xué)觀察何首烏對(duì)糖皮質(zhì)激素致大鼠骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用?，F(xiàn)代文獻(xiàn)對(duì)何首烏抗骨質(zhì)疏松的機(jī)制研究主要?dú)w結(jié)為“腎論”和雌激素樣作用［2］。已經(jīng)有研究結(jié)果表明，何首烏抗骨質(zhì)疏松機(jī)制可能為提高腎的1α-羥化酶活性，增加骨鈣、骨磷和骨羥脯氨酸含量，增加堿性磷酸酶活性，減少骨丟失。何首烏飲片還可作為氧化自由基清除劑，提高血清中超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量，改善腎臟形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，減少腎小球和腎小管間質(zhì)纖維化從而對(duì)抗骨質(zhì)疏松［15］。此外，何首烏抗骨質(zhì)疏松還與激素水平有關(guān)。何首烏中抗骨質(zhì)疏松的主要有效成分為二苯乙烯苷類和何首烏多糖［2］，有氧自由基清除劑作用，增加機(jī)體抗氧化酶活性，延緩肝腎衰老。二苯乙烯苷還具有植物雌激素功效，從雌激素替代治療來抗骨質(zhì)疏松。另外，何首烏本身含有豐富的鈣，亦能增加機(jī)體骨鈣含量。已有實(shí)驗(yàn)表明，何首烏煎劑可以抑制去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松可能與其抑制大鼠的骨吸收增強(qiáng)和骨高轉(zhuǎn)換有關(guān)［9］。何首烏提取液明顯增強(qiáng)去卵巢大鼠中血清和骨組織中成骨細(xì)胞的標(biāo)志酶（ALP）活性，但降低破骨細(xì)胞的標(biāo)志酶（TRAP）活性的作用不明顯，提示何首烏的防治作用以促骨形成為主［2］。

綜上所述，潑尼松可引起大鼠股骨生物力學(xué)性能降低，骨微結(jié)構(gòu)異常；何首烏30%醇提取物中劑量（200 mg·kg－1·d－1）、何首烏30%醇提取物低劑量組（100 mg·kg－1·d－1）、何首烏總提取物高劑量（400 mg·kg－1·d－1）給藥21周可預(yù)防潑尼松致大鼠骨密度的下降、改善股骨松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)、提高股骨生物力學(xué)性能。但此防治作用的具體作用機(jī)制、發(fā)揮作用的有效成分、最佳劑量等都有待更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究和探討。

（致謝：本文在廣東醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室、廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、深圳清華大學(xué)研究院創(chuàng)新中藥平臺(tái)完成，在此對(duì)以上實(shí)驗(yàn)室的老師們表示感謝。）

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Preventive effect of Polygonum Multiflorum on deteriorated micro-structure and biomechanical properties induced by prednisone

ZHOU Man-ru1，LI Jin1，WU Jing-kai1，ZENG Xiao-bin2，CHEN Jing-feng1，CUI Liao1，2，LIU Yu-yu1
（1．Dept of Pharmacology；2．Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical College，Zhanjiang Guangdong 524023，China）

Abstract：Aim To investigate the preventive effect of Polygonum Multiflorum（PM）on the deteriorated mi-cro-structure and biomechanical properties induced by prednisone．Methods Ninety 6-month-old male Sprague-Dawley rats were randomly divided into nine groups，which were control，prednisone，CAL，30% ethanol eluent of the PM（H，M，L），PM（H，M，L）．Prednisone was gavaged to rat for 21 weeks as model group of osteoporosis．Meanwhile，tested herbal ab-stract were orally administrated to the modeled rats in-duced by prednisone．At the end of the experiment，the right femur was collected for micro-CT scanning，three-dimensional reconstruction and biomechanical test．Results Compared with the control group，mod-el group showed destruction of bone microarchitecture，BV／TV fell 28．6%（P＜0.05），bone biomechanical parameters decreases，and stiffness fell 29．7%（P＜0.01）．Compared with the model group，positive group had significantly improved effect on bone micro- architecture，and biomechanical parameters，BV／TV increased 46．7%（P＜0.01），and stiffness increased 25.9%（P＜0.01）．30%ethanol eluent of the PM （M，L）dose may improve bone microstructure by in-creasing BV／TV 46.7%（P＜0.01），40.0%（P＜0.05）respectively，PM（H）may improve the biome-chanical parameters by increasing stiffness 24.7%（P ＜0.05），and 30%ethanol eluent of the PM（H）and PM high-dose may improve the biomechanical parame-ters，but not as positive group．Conclusions Predni-sone reduces biomechanical properties of rat femur and deteriorates femoral microstructure．30%ethanol eluent of the PM（M，L）and PM（H）plays a preventive role in the changes of micro-structural and biomechanical properties by prednisone，and increases BMD，whereas other groups have no significant preventive effect．

Key words：Polygonum Multiflorum；prednisone；bone micro-structure；bone biomechanics；osteoporo-sis；rats

作者簡介：周滿如（1989－），女，碩士生，研究方向：骨質(zhì)疏松的藥物防治，E-mail：1093475585＠qq．com；劉鈺瑜（1976－），女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者，研究方向：骨質(zhì)疏松的藥物防治，Tel：0759-2388588，E-mail：liuyuyu77＠163．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81102450）；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（No 2012B031800225）；廣東省教育廳特色創(chuàng)新項(xiàng)目（自然科學(xué)類，No 2014KTSCX084）

收稿日期：2015－05－11，修回日期：2015－06－06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1273－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．019