丹參酮IIA抗乳腺癌T47D細胞增殖的GPER途徑研究

趙丕文，臧金鳳，陶仕英，陳 夢，牛建昭

（北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京 100029）

丹參酮IIA抗乳腺癌T47D細胞增殖的GPER途徑研究

趙丕文，臧金鳳，陶仕英，陳 夢，牛建昭

（北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京 100029）

中國圖書分類號：R284．1；R329．24；R392．11；；R394．2；R737.902.2

摘要：目的 利用經(jīng)典雌激素受體（estrogenic receptor，ER）和G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen recep-tor，GPER）陽性乳腺癌T47D細胞，探索丹參酮IIA（Tanshi-none IIA）對細胞增殖活性的影響及其GPER介導與調(diào)節(jié)功能。方法 以GPER激動劑G1和GPER拮抗劑G15為工具藥干預，并應用GPER SiRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建GPER基因沉默的T47D細胞，利用MTT細胞增殖實驗觀察丹參酮IIA對T47D細胞增殖速率的影響及GPER的介導作用。利用Western blot方法檢測丹參酮IIA對T47D細胞GPER表達情況的影響。結(jié)果 1×10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA能夠明顯抑制T47D細胞增殖，且該抑制作用可被G1拮抗，可被G15增強。丹參酮IIA作用于GPER基因沉默的T47D細胞，該細胞表現(xiàn)出更為明顯的生長抑制效應。West-ern blot測定結(jié)果表明，1×10－5mol·L－1和1×10－6mol· L－1丹參酮IIA可使T47D細胞GPER蛋白表達明顯降低。結(jié)論 丹參酮IIA具有抑制乳腺癌T47D細胞增殖的作用，該抑制作用可經(jīng)GPER途徑介導；且丹參酮IIA具有對靶細胞GPER表達的調(diào)節(jié)功能。

關(guān)鍵詞：丹參酮IIA；乳腺癌；T47D細胞；細胞增殖；G蛋白偶聯(lián)雌激素受體；雌激素受體；基因沉默

網(wǎng)絡出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．052．html

雌激素是女性體內(nèi)最重要的性激素之一。內(nèi)源性雌激素及植物所含具有雌激素活性的化學成分——植物雌激素（phytoestrogen）發(fā)揮調(diào)節(jié)效應的共有關(guān)鍵途徑是經(jīng)典的雌激素核受體（estrogen re-ceptor，ER），包括ERα和ERβ兩種亞型。但隨著相關(guān)領(lǐng)域研究的不斷深入和擴展，上述兩種經(jīng)典的ER亞型介導機制已被發(fā)現(xiàn)無法確切、全面地闡明雌激素樣成分的作用途徑，特別是其所具有的與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能無關(guān)的快速細胞信號應答反應和傳導過程［1－3］。其后的進一步研究為闡釋上述問題提供了新的線索：20世紀末多個實驗室在多項研究中相繼報道了一種新型膜受體——膜G蛋白偶聯(lián)受體30 （G protein-coupled receptor 30，GPR30）［4－6］，雖然其在結(jié)構(gòu)上與經(jīng)典ER沒有同源性，但也可特異性結(jié)合雌激素及雌激素樣物質(zhì)并介導其效應，因此GPR30之后被賦予了另一與該效應更相吻合的名稱——G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）［7］，該受體效應的揭示為詮釋雌激素的快速應答反應提供了新的重要切入點。

近年來的研究表明，多種能夠結(jié)合經(jīng)典雌激素受體的化合物也可結(jié)合、活化GPER［8］。在多種雌激素相關(guān)腫瘤的發(fā)生和演變中，GPER發(fā)揮了重要的介導作用［9］。GPER也成為了特異性雌激素相關(guān)腫瘤細胞抗腫瘤藥物的候選新靶標［10］。本課題組在既往研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，丹參的重要活性成分丹參酮IIA（Tanshinone II-A）可通過ER途徑明顯抑制乳腺癌T47D細胞的增殖，但ER調(diào)節(jié)和介導功能并不能完全解釋其效應［11］，GPER是否也是其抗癌效應的重要靶點和介導者？本研究旨在進一步探討丹參酮IIA抗乳腺癌效應及其GPER靶向和介導機制，以期為臨床乳腺癌的治療提供更加全面的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1　材料

1．1試劑 DMEM（高糖）、無酚紅DMEM（高糖）、胎牛血清、活性炭－葡聚糖苷處理的胎牛血清（CDT-FBS）為Hyclone公司產(chǎn)品；雌二醇（Estradiol，E2）、MTT、DMSO為Sigma公司產(chǎn)品；GPER抗體、β-肌動蛋白抗體、對照SiRNA、GPER SiRNA為Santa Cruz公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipofectamine-2000購自In-vitrogen公司；GPER特異性激動劑G1、GPER特異性拮抗劑G15為Tocris公司產(chǎn)品；甘氨酸、Tween-20 為Amresco公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA

裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、30%丙烯酰胺、濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液、蛋白分子量Marker、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉、脫脂奶粉、TEMED、SDS-PAGE上樣緩沖液、ECL超敏發(fā)光液為普利萊基因有限公司產(chǎn)品；二抗Anti-Rabbit IgG／HRP為北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品。

1．2藥物 丹參酮IIA購自中國生物制品檢定所，純度：98%；實驗時以DMSO溶解，終濃度為：1× 10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1。

1．3細胞株 人乳腺癌T47D細胞購自協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心。

1．4儀器 CO2培養(yǎng)箱（Binder）；酶聯(lián)免疫檢測儀（Epson LX-800）；倒置顯微鏡（Olympus）；凝膠成像分析儀（Pharmacia）；流式細胞儀（BD）。

2　方法

2．1細胞培養(yǎng) 人乳腺癌T47D細胞，常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，相對飽和濕度。實驗開始前4天將細胞用PBS洗滌2次后，改為在無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）中培養(yǎng)，以耗盡細胞內(nèi)儲存的雌激素。

2．2MTT細胞增殖試驗 T47D細胞傳代3次，經(jīng)無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d后，選取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，加入無血清DMEM，以細胞密度3×103個／孔接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液總體積為200 μL。培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，換為含1×10－8mol·L－1雌二醇、1×10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)；在GPER干預組中同時加入1×10－8mol·L－1GPER激動劑G1或GPER拮抗劑G15；每種受試物均設6個復孔。于48 h后加入MTT（5 g·L－1，15 μL／孔），繼續(xù)孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL。以DMSO調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm下測定各孔光吸收值（A），計算平均A值和增殖率（prolifera-tion rate，PR）。

PR／%＝（實驗組A值／溶劑對照組A值）×100%

2．3Western blot檢測GPER SiRNA轉(zhuǎn)染效果T47D細胞傳代3次，經(jīng)無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d后，選取對數(shù)生長期細胞，以2×105個／孔密度將細胞接種于6孔培養(yǎng)板中。在細胞密度達到80%時進行對照SiRNA或GPER SiRNA轉(zhuǎn)染：5 μL siRNA／孔應用脂質(zhì)體Lipofectamine-2000按試劑盒說明進行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后收集細胞，加入細胞裂解液，并以14 000×g離心20 min，將上清部分進行蛋白含量測定后用于免疫印跡分析。蛋白變性后上樣，SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V，分離膠120 V），半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（60 V，120 min）。5%脫脂奶粉37℃振搖1 h將膜封閉；加入GPER一抗，4℃孵育過夜。HRP標記的二抗37℃振搖1 h后，將PVDF膜置ECL混合液中室溫下振蕩孵育5 min，X膠片曝光，顯影、定影、掃描后，以β-肌動蛋白表達量為對照觀察結(jié)果。

2．4GPER SiRNA轉(zhuǎn)染T47D細胞增殖試驗T47D細胞處理及GPER SiRNA轉(zhuǎn)染過程同“2.3”。應用上述轉(zhuǎn)染成功的T47D細胞，以細胞密度3× 103個／孔接種于96孔板內(nèi)，24 h后按上述“2.2”步驟換為含1×10－8mol·L－1雌二醇、1×10－5mol· L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，每種受試物均設6個復孔。于48 h后應用MTT法檢測藥物對GPER SiRNA轉(zhuǎn)染T47D細胞增殖的影響。

2．5Western blot檢測丹參酮IIA對細胞GPER蛋白表達的影響 取經(jīng)無酚紅DMEM（含5%CDT-FBS）培養(yǎng)4 d的T47D細胞，以5×105個／瓶的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，以無血清DMEM接種24 h待細胞貼壁后，換為含1×10－8mol·L－1雌二醇、1×10－5mol·L－1或1×10－6mol·L－1丹參酮IIA的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用48 h后收集細胞，加入細胞裂解液，并以14 000×g離心20 min，將上清部分進行蛋白含量測定后用于GPER免疫印跡分析。蛋白變性、SDS-PAGE電泳及結(jié)果檢測方法均與“2.3”步驟相同。

3　結(jié)果

3．1MTT細胞增殖試驗檢測丹參酮IIA對T47D細胞增殖的抑制效應及G1或G15的干預作用 從Tab 1可見，陽性藥物（1×10－8mol·L－1雌二醇）在48 h時可使T47D細胞增殖速率明顯增加（P＜0.01），加入G1后其促增殖作用明顯有所增強，加入G15后其促增殖作用有所減弱（P＜0.05）。而1 ×10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA對T47D細胞增殖均具有明顯抑制作用（P＜0.01）。加入G1后其增殖抑制作用被部分拮抗（P＜0.05）；加入G15后其增殖抑制作用進一步增強（P＜0.05）。

3．2Western blot檢測GPER SiRNA轉(zhuǎn)染對T47D細胞GPER蛋白表達的沉默效應 Fig 1顯

示，GPER SiRNA轉(zhuǎn)染可使T47D細胞GPER蛋白表達水平明顯降低，與正常對照組相比差異有顯著性（P＜0.01），即GPER SiRNA轉(zhuǎn)染可構(gòu)建GPER蛋白表達水平明顯降低的T47D細胞。

Tab 1 Effect of tanshinone IIA on proliferation of T47D cells（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of tanshinone IIA on proliferation of T47D cells（±s，n＝6）

P＜0．05，P＜0．01 vs EtOH control；△P＜0．05 vs same concentration of estradiol or tanshionoe IIA without G1 or G15

Treatment　48 h　48 h＋G1 1×10－8mol·L－148 h＋G15 1×10－8mol·L－1EtOH　0．2%　0．524±0．017　0．517±0．024　0．514±0．018 Estradiol　1×10－8mol·L－1　0．652±0．013　0．672±0．011　0．586±0．008△Tanshinone IIA　1×10－7mol·L－1　0．452±0．022　0．487±0．018△　0．409±0．028△Tanshinone IIA　1×10－6mol·L－1　0．393±0．027　0．451±0．018△　0．356±0．016△Tanshinone IIA　1×10－5mol·L－1　0．292±0．024　0．364±0．020△　0．266±0．026

Fig 1 Effect of GPER SiRNA transfection on GPER protein expression in T47D cells

3．3GPER SiRNA轉(zhuǎn)染對丹參酮IIA抑制T47D細胞增殖效應的干預作用 從Tab 2可見，與“3.1”結(jié)果一致，1×10－8mol·L－1雌二醇在48 h時可使T47D細胞增殖速率明顯增加（P＜0.01），GPER SiRNA轉(zhuǎn)染后其促增殖作用明顯減弱（P＜0.01）。而1×10－5mol·L－1～1×10－7mol·L－1丹參酮IIA 對T47D細胞增殖具有明顯抑制作用（P＜0.05或0.01），GPER SiRNA轉(zhuǎn)染促進了丹參酮IIA抗增殖作用的進一步增強，與相應濃度未轉(zhuǎn)染組相比差異有顯著性（P＜0.05或0.01）。

3．4丹參酮IIA對T47D細胞GPER蛋白表達的影響 Fig 2顯示，藥物作用48 h后，1×10－8mol· L－1雌二醇可使T47D細胞GPER蛋白表達水平稍有降低，但與正常對照組相比差異沒有顯著性。1× 10－5mol·L－1和1×10－6mol·L－1丹參酮IIA可誘導T47D細胞GPER蛋白表達水平明顯下降（P＜0.01）。

Tab 2 Effect of tanshinone IIA on proliferation of T47D cells transfected with GPER SiRNA（±s，n＝6）

Tab 2 Effect of tanshinone IIA on proliferation of T47D cells transfected with GPER SiRNA（±s，n＝6）

P＜0．05，P＜0．01 vs EtOH control；△P＜0．05，△△P＜0．01 vs same concentra-tion of estradiol or tanshionoe IIA in untransfected group

Treatment　48 h　48 h＋SiRNA EtOH　0．2%　0．516±0．022　0．498±0．006 Estradiol　1×10－8mol·L－1　0．633±0．007　0．544±0．013△△Tanshinone IIA 1×10－7mol·L－1　0．466±0．011　0．372±0．029△△Tanshinone IIA 1×10－6mol·L－1　0．407±0．030　0．344±0．029△Tanshinone IIA 1×10－5mol·L－1　0．296±0．007　0．256±0．005△△

1：EtOH；2：1×10－8mol·L－1estradiol；3：1×10－5mol·L－1tanshinone IIA；4：1×10－6mol·L－1tanshinone IIA．P＜0．01 vs EtOH control

4　討論

丹參酮為中藥丹參的一組脂溶性菲醌類有效成分，丹參酮IIA是其中的代表性化合物，是丹參發(fā)揮藥效的重要活性成分，其抗腫瘤作用，包括抗乳腺癌

細胞生長的作用已為實驗所證實［12－13］。本課題組在以前的研究中曾發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA對ER陽性T47D細胞增殖具有明顯的抑制作用［11］；而且已證明了丹參酮IIA在發(fā)揮該抗癌效應過程中經(jīng)過了ER介導途徑，并具有升高ERα／ERβ比值的作用。但值得注意的是，據(jù)文獻報道，與ERβ相比，ERα在激活促增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄上作用明顯，而ERβ在抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄上活性更強［14－15］；而丹參酮IIA可升高ERα／ERβ比值，故推測其發(fā)揮抗癌效應還有其他的作用靶點和相關(guān)途徑的參與。

如前所述，已有研究證實，多種能夠與經(jīng)典ER結(jié)合的化合物也可結(jié)合、活化GPER，而且GPER在多種雌激素相關(guān)腫瘤的發(fā)生及演變中發(fā)揮了重要介導作用，GPER也成為了特異性雌激素相關(guān)腫瘤細胞抗腫瘤藥物的候選新靶標。本實驗結(jié)果顯示：丹參酮IIA對T47D細胞的增殖抑制作用可被GPER激動劑減弱、被GPER抑制劑增強，說明GPER可介導丹參酮IIA抗T47D細胞增殖作用，而且GPER活性與丹參酮IIA的抗增殖活性成負相關(guān)。同時，從Wester blot結(jié)果中可見，丹參酮IIA還具有降低GPER表達量，即GPER表達調(diào)節(jié)功能，這與某些既往研究結(jié)果具有一致性。例如，有研究發(fā)現(xiàn)TAM的活性代謝產(chǎn)物4-OHT（4-hydroxytamoxifen）可通過GPER途徑上調(diào)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC1A細胞的c-fos表達、促進兩種細胞的增殖；而拮抗GPR30的作用可導致OHT促增殖作用的消失［16－17］。Filardo等［18］曾發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞GPER有過量表達且表達量與腫瘤大小成正比。Smith等［19］也發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細胞中有GPER過量表達，而且表達量與癌癥的嚴重程度呈正相關(guān)，患者生存率隨著GPER的超量表達明顯降低。本研究中基因沉默實驗結(jié)果也進一步證實，GPER表達減少可致丹參酮IIA抗T47D細胞增殖活性增強。Che-valier等［20］在2012年也曾報道，GPER基因沉默可致其介導的人精原細胞癌增殖效應受到明顯抑制。Scaling等［21］在2014年也曾發(fā)現(xiàn)G1誘導的MCF10A乳腺癌細胞增殖活性可因GPER基因沉默而明顯降低。

另有報道也證實［22］：GPER對于甲狀腺癌等雌激素相關(guān)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤的治療具有重要應用價值，特別是應用于ER陰性、GPER陽性的病例。因此，針對GPER蛋白的研究對于解析疾病的發(fā)生、發(fā)展并據(jù)此進行患者的個體化治療和預后均具有重要意義。與上述實驗結(jié)果和分析一致，本項研究不但表明丹參酮IIA可以通過GPER途徑抑制T47D乳腺癌細胞增殖，而且還可通過降低GPER表達水平進一步促進其抑癌效應。

針對靶向經(jīng)典雌激素受體治療中遇到的組織選擇性或特異性問題，以及在某些治療中存在的抗藥性問題，目前也迫切需要尋找更好的作用靶點和更廣泛而有效的治療策略來抑制乳腺癌細胞中的雌激素信號轉(zhuǎn)導體系。隨著對GPER的深入研究和認識，以GPER作為靶標，為乳腺癌治療提供了新的重要切入點。同時，綜合本研究結(jié)論及課題組先期研究成果，提示靶細胞內(nèi)ERα、ERβ含量及比值的變化必須與GPER的改變情況及其介導效應綜合考慮，才能對雌激素樣活性調(diào)節(jié)成分影響細胞增殖、發(fā)揮雌激素樣效應的最終結(jié)果、趨勢和程度進行較為全面的分析和預測，為臨床婦科腫瘤的治療提供更加可靠的實驗依據(jù)。

（致謝：本文實驗在北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞生物化學實驗室完成，謹此致謝?。?/p>

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Research on anti T47D breast cancer activity and its G protein-coupled estrogen receptor pathway of tanshinone IIA

ZHAO Pi-wen，ZANG Jin-feng，TAO Shi-ying，CHEN Meng，NIU Jian-zhao
（School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract：Aim To explore the effects of tanshinone IIA on cell proliferation via G protein-coupled estrogen receptor inductive and regulative pathway in typical es-trogen receptor and G protein-coupled estrogen receptor positive T47D breast cancer cells．Methods The pro-liferation rate of T47D cells influenced by tanshinone IIA was analyzed by MTT assay．G protein-coupled es-trogen receptor agonist G1 and GPER antagonist G15 were employed as tools．GPER SiRNA was applied to build GPER gene silence T47D cells．GPER expres-sion influenced by tanshinone IIA was measured by Western blot．Results The proliferation rates of T47D cells treated with 1×10－5mol·L－1－1×10－7mol· L－1of tanshinone IIA were decreased significantly． Such effects could be attenuated by G1 or enhanced by G15．Growth of GPER SiRNA transfected T47D cells were significantly inhibited by 1×10－5mol·L－1－1 ×10－7mol·L－1of tanshinone IIA treating．Result of Western blot showed that tanshinone IIA at 1×10－5mol·L－1and 1×10－6mol·L－1could induce de-crease of GPER protein expression in T47D cells．Conclusions Tanshinone IIA shows inhibitory effects on proliferation rate of T47D breast cancer cells via GPER pathway．Tanshinone IIA could perform regula-tive function on GPER expression level in target cells．

Key words：tanshinone IIA；breast cancer；T47D cell；cell proliferation；G protein-coupled estrogen re-ceptor；estrogen receptor；gene silence

作者簡介：趙丕文（1967－），女，博士，教授，研究方向：婦科常用中藥的作用機制，Tel：010-64286976，E-mail：pwzhao＠263．net；牛建昭（1945－），女，碩士，教授，博士生導師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治重大疾病的基礎(chǔ)，通訊作者，Tel：010-64286813，E-mail：niujjzz＠263．net

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81273887）；高等學校創(chuàng)新引智計劃（No B07007）；北京中醫(yī)藥大學自主科研課題（No JYBZZ-JS014）

收稿日期：2015－05－11，修回日期：2015－07－14

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1458－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．026