葛根素對MPP＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞凋亡過程中p53和mir-34a表達的影響

趙素晨，程月發(fā)，吳慶文，閆春林，郝曉惠

（華北理工大學(xué)1．護理與康復(fù)學(xué)院；2．冀唐學(xué)院、3．醫(yī)學(xué)中心實驗室，河北唐山 063000）

葛根素對MPP＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞凋亡過程中p53和mir-34a表達的影響

趙素晨1，程月發(fā)2，吳慶文1，閆春林1，郝曉惠3

（華北理工大學(xué)1．護理與康復(fù)學(xué)院；2．冀唐學(xué)院、3．醫(yī)學(xué)中心實驗室，河北唐山 063000）

Effect of puerarin on expression of p53 and mir-34a in apoptosis of SH-SY5Y cell induced by MPP＋

ZHAO Su-chen1，CHENG Yue-fa2，WU Qing-wen1，YAN Chun-lin1，HAO Xiao-hui3

（1．College of Nursing and Rehabilitation of North China Univer-sity of Science and Technology，Tangshan Hebei 063000，Chi-na；2．Jitang College of North China University of Science and Technology，Tangshan Hebei 063300，China；3．Medical Ex-periment Research Center of North China University of Science and Technology，Tangshan Hebei 063000，China）

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．062．html

近年來，部分以p53為靶點的化合物研究推動著蛋白相互作用和蛋白突變體構(gòu)象領(lǐng)域藥物的新發(fā)現(xiàn)［1］，但有關(guān)中藥單體分子對神經(jīng)細胞退行性變過程中p53及其相關(guān)基因變化的研究尚不多見。本研究在前期相關(guān)實驗基礎(chǔ)上［2－4］，采用MPP＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞凋亡模型，進一步探討葛根素是否通過調(diào)節(jié)p53及mir-34a表達來影響多巴胺神經(jīng)細胞凋亡。

1　材料與方法

1．1細胞株 SH-SY5Y細胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞中心。

1．2主要藥物與試劑 葛根素（中國食品藥品檢定研究院，純度為96%）。MPP＋、Annexin-V／PI和Pifithrin-ɑ（Sigma）；DMEM／F12＝1∶1培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（Gibco）；GADPH抗體（華安生物），p53抗體（Cell Signaling Technology）；SYBR Green qPCR和反轉(zhuǎn)錄試劑盒及引物（Invitrogen），引物序列見Tab 1。

Primer nameSequences u6RT primer 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′Forward primer 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′Reverse primer 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′mir-34aRT primer 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACT

GGATACGACACAACCA-3′

GSP 5′-GGGGGAATGGCAGTGTCT-3′R 5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′β-actinForward primer CTTTGAGTTCGGTGGGGTCA Reverse primer GGGCCGTACAGTTCCACAAA p53Forward primer TTTTCCCCTCCCATGTGCTC

Reverse primer CAGTCTGGCTGCCAATCCA

GSP is the specific primer corresponding to miRNA，R is matched with the RT primer。

1．3儀器 CO2培養(yǎng)箱、凝膠成像系統(tǒng)及CFX96 Real-Time Systerm（Bio-Rad），倒置顯微鏡（Olympus），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），低溫高速離心機（Hitachi），流式細胞儀（FACS Calibuar，BD）。

1．4細胞培養(yǎng)及分組 SH-SY5Y細胞接種于培養(yǎng)瓶中，DMEM／F12培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清，青霉素1×105U· L－1，鏈霉素100 mg·L－1），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實驗分對照組，MPP＋模型組，葛根素低、中、高（50、100、150 μmol·L－1）＋MPP＋處理組以及Pifithrin-ɑ＋MPP＋處理組，共6組。

1．5流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞用低、中、高劑量的葛根素及40 mg·L－1的Pifithrin-ɑ預(yù)先作用3 h后，加入1 mmol·L－1的MPP＋繼續(xù)培養(yǎng)24 h，消化，收集，PBS清洗，加入400 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸，加5 μL Annexin V-FITC染料，室溫避光孵育15 min，加10 μL的PI染色液，室溫避光孵育5 min，上機檢測。

1．6Western blot檢測p53蛋白的表達 提取蛋白，測濃度，蛋白變性，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育，ECL顯色，Image J軟件對結(jié)果進行分析。

1．7RT-PCR檢測p53及mir-34a基因的表達 提取RNA，測RNA濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成，用CFX96 Real-Time Systerm儀進行RT-PCR擴增，實驗結(jié)果應(yīng)用CFX軟件分析。

1．8統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2　結(jié)果

2．1細胞形態(tài)學(xué)的改變 顯微鏡下觀察，模型組細胞大部分細胞回縮，突起結(jié)構(gòu)減少，細胞變圓，貼壁細胞減少；而葛根素預(yù)處理和給予Pifithrin-ɑ干預(yù)的細胞形態(tài)與模型組比較均有明顯改善。

2．2流式細胞儀檢測細胞凋亡 本次試驗結(jié)果與前期的統(tǒng)計分析結(jié)果基本趨于一致［4］，葛根素可抑制MPP＋引起的細胞凋亡，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；給予Pifithrin-ɑ阻斷p53基因表達后，細胞凋亡率與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2．3Western blot檢測p53蛋白表達 模型組與對照組比較，p53蛋白的表達量明顯升高（P＜0.05），而給予葛根素干預(yù)后，p53蛋白的表達量又隨葛根素濃度的增高逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。并且，給予Pifithrin-ɑ干預(yù)后，p53蛋白表達與模型組比較也明顯降低（P＜0.05）。

2．4RT-PCR檢測p53、mir-34a基因表達 本次檢測p53基因表達結(jié)果與前期結(jié)果也基本相同，具有統(tǒng)計學(xué)分析的一致性［4］；加入p53抑制劑后，p53基因表達與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組mir-34a基因表達量與對照組比明顯升高（P＜0.05），給予葛根素干預(yù)后，隨葛根素濃度的增加mir-34a基因表達量與模型組相比又明顯降低（P＜0.05）；給予p53抑制劑阻斷p53基因激活后的mir-34a基因表達量和模型組比較明顯下降（P＜0.05），見Tab 2。

Tab 2 Expression of p53 and mir-34a gene in each group（±s，n＝6）

Tab 2 Expression of p53 and mir-34a gene in each group（±s，n＝6）

＃P＜0．05 vs control group；P＜0．05 vs model group．

Group　p53 gene　mir-34a gene Control　1．00±0．00　1．00±0．00 MPP＋model　1．79±0．08?！?．02±0．16＃Pifithrin-ɑ　1．10±0．02　1．24±0．2450 μmol·L－1Pue＋MPP＋　1．66±0．03　1．64±0．14100 μmol·L－1Pue＋MPP＋　1．35±0．10　1．45±0．25150 μmol·L－1Pue＋MPP＋　1．19±0．04　1．31±0．20

3　討論

3．1p53-mir-34a反饋調(diào)節(jié)環(huán)路與細胞凋亡 研究表明，miRNA-34家族作為p53的直接調(diào)控因子參與了細胞分化、凋亡和衰老等生物學(xué)進程，結(jié)合有關(guān)實驗分析，mir-34a是受p53激活表達水平較高的miRNA。本研究結(jié)果，MPP＋使細胞中p53蛋白及p53mRNA的表達增高，且mir-34a基因表達也增高。而加入p53抑制劑干預(yù)后的細胞，mir-34a基因表達下降，可能是由于p53水平的降低影響了mir-34a的活性。目前研究發(fā)現(xiàn)，mir-34a能夠通過E2F3和SIRT1上調(diào)p53，從而形成p53-mir-34a正向反饋調(diào)節(jié)環(huán)路［5－6］。后期我們將繼續(xù)進行相關(guān)實驗，進一步研究p53與mir-34a的反饋調(diào)節(jié)關(guān)系。

3．2葛根素保護PD的研究 近年來，研究發(fā)現(xiàn)葛根素可以抑制由H2O2氧化引起的細胞凋亡［7－8］。體、內(nèi)外PD模型的相關(guān)研究表明，葛根素對p53表達具有一定調(diào)節(jié)作用［9］，本結(jié)果證明葛根素能降低MPP＋引起的細胞凋亡外，還從p53-mir-34a通路角度對葛根素抑制細胞凋亡的機制進行了一些初步新探索，結(jié)果顯示，葛根素和p53抑制劑干預(yù)使得p53蛋白及p53和mir-34a基因的相對表達較MPP＋模型組降低，提示葛根素有可能通過抑制p53轉(zhuǎn)錄從而減少mir-34a基因表達。

（致謝：本實驗在華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實驗室完成。感謝老師們實驗過程中的耐心指導(dǎo)，使得本研究順利完成。）

參考文獻：

［1］ 代曉麗，劉 靜，羅 瑛，張繼虹．靶向作用p53藥物的研究進展［J］．中國藥理學(xué)通報，2014，30（7）：912－6．

［1］ Dai X L，Liu J，Luo Y，Zhang J H．Research progress on drugs tar-geting p53［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30（7）：912－6．

［2］ Cheng Y F，Zhu G Q，Wang M，et al．Involvement of ubiquitin pro-teasome system in protective mechanisms of puerarin to MPP＋－e-licited apoptosis［J］．Neurosci Res，2009，63（1）：52－8．

［3］ 程月發(fā)，朱國旗，關(guān)亞麗，等．葛根素對MPP＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞線粒體途徑凋亡的保護作用［J］．中國中藥雜志，2011，36 （9）：1222－6．

［3］ Cheng Y F，Zhu G Q，Guan Y L，et al．The protective effect of pu-erarin to MPP＋－induced SH SY5Y cells on the apoptosis of mito-chondrial pathways［J］．China J Chin Mat Med，2011，36（9）：1222－6．

［4］ 閆春林，程月發(fā)，吳慶文，等．葛根素對MPP＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞凋亡過程中p53mRNA及相關(guān)基因表達的影響［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（4）：154－8．

［4］ Yan C L，Cheng Y F，Wu Q W，et al．Role of p53 in neuroprotec-tive effects of puerarin against MPP＋-induced human neuroblasto-ma SH-SY5Y cell death［J］．Chin J Exp Tradit Med Formul，2014，20（4）：154－8．

［5］ Welch C，Chen Y，Stallings R L．MicroRNA-34a functions as a po-tential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells［J］．Oncogene，2007，26（34）：5017－22．

［6］ Yamakuchi M，F(xiàn)erlito M，Lowenstein C J．mir-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008，105 （36）：13421－6．

［7］ Jiang B，Liu J H，Bao Y M，An L J．Hydrogen peroxide-induced ap-optosis in PC12 cells and the protective effect of puerarin［J］．Cell Bio Int，2003，27（12）：1025－31．

［8］ Bo J，Ming B Y，Gang L Z，et al．Protection by puerarin against MPP＋-induced neurotoxicity in PC12 cells mediated by inhibiting mitochondrial dysfunction and caspase-3-like activation［J］．Neu-rosci Res，2005，53（2）：183－8．

［9］ Li X Z，Zhang S N，Liu S N，Lu F．Recent advances in herbal med-icines treating Parkinson′s disease［J］．Fitoterapia，2013，84：273 －85．

中國圖書分類號：R284.1；R329.25；R341；R745.7；R977.6

關(guān)鍵詞：帕金森??；葛根素；p53；mir-34a；SH-SY5Y細胞；凋亡

Key words：Parkinson′s disease；puerarin；p53；mir-34a；SH-SY5Y cell；apoptosis

作者簡介：趙素晨（1988－），女，碩士生，研究方向：神經(jīng)康復(fù)學(xué)，Tel：0315-3725252，E-mail：zhaosuchen＠126．com；程月發(fā)（1967－），男，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物藥理學(xué)，通訊作者，Tel：0315-8114108，E-mail：arthurcyf＠163．com

基金項目：河北省衛(wèi)生廳重點醫(yī)學(xué)研究項目（No 20110160）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（No 2013180）；河北省自然科學(xué)基金資助項目（No H2014209300）

收稿日期：2015－06－20，修回日期：2015－08－23

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1479－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．031