三七皂苷R1對肺高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞SOCE的抑制作用

王瑞幸，戴 耄，穆云萍，江 嬌，黃秋虹，吳枝娟，焦海霞，林默君

（福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，心血管科學研究室，福建福州 350108）

三七皂苷R1對肺高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞SOCE的抑制作用

王瑞幸，戴 耄，穆云萍，江 嬌，黃秋虹，吳枝娟，焦海霞，林默君

（福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，心血管科學研究室，福建福州 350108）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R322．121；R322．74；R543.502；R544.02；R845.22

摘要：目的 探討三七皂苷R1（notoginsenoside R1）對慢性低氧（chronic hypoxia，CH）及野百合堿（monocrotaline，MCT）致肺高壓（pulmonary hypertension，PH）大鼠肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）鈣池操縱性鈣內流（store-operated calcium entry，SOCE）的作用。方法制備CH及MCT致PH大鼠模型，通過Mn2＋淬滅Fura-2熒光和Fluo-3熒光檢測胞質游離Ca2＋濃度（intracellular free calcium concentration，［Ca2＋］i）觀察三七皂苷R1對CH及MCT致PH大鼠PASMCs SOCE的作用。結果 成功制備CH及MCT致PH大鼠模型；在硝苯地平預處理情況下，10 μmol·L－1三七皂苷R1可明顯降低環(huán)匹阿尼酸（cyclopia-zonic acid，CPA）誘導CH及MCT致PH大鼠PASMCs Mn2＋淬滅幅度、Mn2＋最大淬滅率、胞膜Ca2＋內流量和靜息［Ca2＋］i。結論 三七皂苷R1對CH及MCT致PH大鼠PASMCs具有抑制SOCE和降低靜息［Ca2＋］i的作用。

關鍵詞：肺高壓；慢性低氧；野百合堿；三七皂苷R1；鈣池操縱性鈣內流；肺動脈平滑肌細胞

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．054．html

肺高壓（pulmonary hypertension，PH）是與許多不同病理特征和發(fā)病機制的疾病密切相關的病理生理學改變［1］。它是一種以進行性肺血管重構為特征的嚴重疾病，表現(xiàn)為肺血管阻力增高，肺動脈壓力增高，右心室肥厚，最終可引起右心衰竭，甚至死亡［2］。目前研究表明，肺動脈平滑肌細胞（pulmona-ry arterial smooth muscle cells，PASMCs）靜息胞質游離Ca2＋濃度（intracellular free calcium concentration，［Ca2＋］i）水平持續(xù)性增高，在血管收縮增強和血管重塑以及PH致病過程中起重要作用［3］。在特發(fā)性肺動脈高壓患者、慢性低氧（chronic hypoxia，CH）和野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導PH模型動物中靜息［Ca2＋］i的升高和肺動脈（pulmonary arter-ies，PAs）血管張力的增加主要是由鈣池操縱性鈣內流（store-operated calcium entry，SOCE）功能增強引起［4－7］。雖然PH的研究取得了明顯的進展，但迄今尚缺乏有效的治療手段。目前，主要治療方法是應用血管擴張劑，如前列腺素、磷酸二酯酶抑制劑和內皮素-1受體拮抗劑等，但這些藥物價格昂貴，且療效有限。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，從傳統(tǒng)中藥三七中提取的活性成分三七皂苷R1（notoginsenoside R1）具有減輕低氧和高碳酸血癥誘導游離大鼠肺動脈環(huán)收縮的作用［8］，我們先前研究也發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1可能通過抑制SOCE，降低血管激動劑對肺高壓模型大鼠肺動脈的收縮作用［9］。本研究進一步觀察三七皂苷R1對CH及MCT致PH模型大鼠PASMCs SOCE的作用。

1　材料與方法

1．1實驗動物和分組 清潔級SD大鼠，♂，體質量180～200 g，購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心［SCXK（閩）2012－0001］，隨機分成正常對照組（CON組）、CH致PH模型組（CH組）和MCT誘發(fā)PH模型組（MCT組）3組。

1．2試劑 MCT、膠原酶Ⅰ、木瓜蛋白酶、環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA）、硝苯地平（nifedipine，Nif）、CaCl2、MnCl2、EGTA和A23187均為Sigma公司產品；Fluo-3，AM和Fura-2，AM（Invitrogen公司）；三七皂苷R1（成都格雷西亞化學技術有限公司）。

1．3PH大鼠模型的建立

1．3．1CH誘發(fā)PH大鼠模型的建立大鼠置于常壓低氧（體積分數為0．1）密封的有機玻璃飼養(yǎng)箱內，飼養(yǎng)21 d。

1．3．2MCT誘發(fā)PH大鼠模型的建立［7］大鼠按

50 mg·kg－1劑量一次腹腔注射61．5 mmol·L－1MCT后，常規(guī)飼養(yǎng)21 d。

1．4PH大鼠模型的鑒定

1．4．1右心室收縮壓測定 大鼠腹腔注射肝素（Heparin，3125 IU·kg－1）5min后，氨基甲酸乙酯（1 g·kg－1）腹腔麻醉后，經右頸外靜脈行右心室插管術，記錄大鼠右心室收縮壓（right ventricular sys-tolic pressure，RVSP）。

1．4．2右心室質量指數測定 測完RVSP后，迅速剪開胸腔取出大鼠的心臟和肺。沿房室交界處剪去左右心房及血管，分離右心室（RV）及左心室＋室間隔（LV＋S），并用濾紙吸去多余水分，分別稱重，計算RV／（LV＋S）即右心室質量指數（right ventricular mass index，RVMI）。

1．4．3肺動脈形態(tài)學檢測 將取下的肺以1.47 kPa壓力沿氣管注入甲醛，固定24 h，石蠟包埋，在距離肺尖約0．5 cm處切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察肺血管形態(tài)。用Image Pro 6.0軟件分別測量并計算直徑為51－100 μm和101－150 μm肺動脈的管腔面積與總面積的百分比，以及管壁厚度與動脈半徑的百分比。

1．5PASMCs的分離和培養(yǎng) 大鼠麻醉后，迅速剪開胸腔取出肺葉，在解剖顯微鏡下分離肺葉內PAs，沿PAs縱軸剪開暴露內壁，用棉簽在PAs內壁小心擦拭以去內皮。分離好的PAs放在4℃含1.5 mmol·L－1CaCl2的HBSS液（mmol·L－1：NaCl 130.0，KCl 5.0，MgCl21.2，HEPES 10.0，Glucose 10.0，pH 7.2）中靜置30 min，隨后取出放入室溫下含20 μmol·L－1CaCl2的HBSS液中靜置20 min。再將PAs放入酶溶液（L－1：膠原酶Ⅰ1.75×106U，木瓜蛋白酶9.50×103U，牛血清白蛋白0.03 mmol，DTT 1.00 μmol；用含20 μmol·L－1CaCl2的HBSS液配制）中37℃水浴消化20 min，后用尼龍網濾去酶溶液，并用含20 μmol·L－1CaCl2的HBSS液清洗PAs，后再將其置于0.5 mL含20 μmol·L－1CaCl2的HBSS液中慢慢吹打，使細胞脫落并分散于溶液中。將細胞懸液滴于細胞培養(yǎng)皿中，加F12細胞培養(yǎng)液，于體積分數為0.21氧氣的培養(yǎng)箱（CON組和MCT組細胞）或體積分數為0.03氧氣的三氣培養(yǎng)箱（CH組細胞）中37℃培養(yǎng)18～24 h。

1.6Mn2＋淬滅Fura-2熒光實驗 培養(yǎng)好的PASMCs用Fura-2 AM（5 μmol·L－1）在室溫下培養(yǎng)液中負載40 min，負載結束后，細胞用含2 mmol· L－1CaCl2的Tyrode液（mmol·L－1：NaCl 137.0，KCl 5.4，MgCl21.0，HEPES 10.0，Glucose 10.0，pH 7.4）沖洗以去除細胞外的Fura-2 AM，并靜置20 min，以使細胞內染料完全脫酯化。將細胞放置于倒置顯微鏡上，選擇視野中形態(tài)好且密集的細胞團。啟動實時細胞動態(tài)熒光強度系統(tǒng)，設置激發(fā)光波長為360 nm，發(fā)射光波長為510 nm，按實驗程序經給藥灌流系統(tǒng)加入相應的灌流液，記錄與分析Fura-2熒光變化。Fura-2熒光變化的計算公式為：ΔFluorescence%＝（F－Fbs）（Fbs－Fbg）×100%，F(xiàn)為實時測量熒光值，F(xiàn)bs為含0.1 mmol·L－1EGTA的無鈣Tyrode液中得到的基礎熒光值，F(xiàn)bg為10 μmol·L－1A23187和10 mmol·L－1MnCl2誘發(fā)的背景熒光值。并用Clampfit 8.2軟件計算Mn2＋最大淬滅率（maximum rate of quenching）。三七皂苷R1處理組為實驗前培養(yǎng)液中加入10 μmol·L－1三七皂苷R1預孵育細胞10 min，并在給藥灌流系統(tǒng)各灌流液中加入10 μmol·L－1三七皂苷R1。

1．7Fluo-3熒光檢測PASMCs的［Ca2＋］i培養(yǎng)好的PASMCs用Fluo-3 AM（5 μmol·L－1）在室溫下培養(yǎng)液中負載40 min，負載結束后，細胞用含2 mmol·L－1CaCl2的Tyrode液沖洗以去除細胞外的Fluo-3 AM，并靜置20 min，以使細胞內染料完全脫酯化。將細胞放置于倒置顯微鏡上，選擇視野中形態(tài)好且密集的細胞團。啟動實時細胞動態(tài)熒光強度系統(tǒng)（美國PTI公司），設置激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為510 nm，按實驗程序經給藥灌流系統(tǒng)加入相應的灌流液，記錄與分析Fluo-3熒光變化。［Ca2＋］i的計算公式為：［Ca2＋］i＝KD×（F－Fbg）／（Fmax－F），其中Fluo-3的KD值為1.1 μmol·L－1，F(xiàn)為實時測量熒光值，F(xiàn)bg為10 mmol·L－1MnCl2誘發(fā)的背景熒光值，F(xiàn)max為10 μmol·L－1A23187和10 mmol·L－1CaCl2誘發(fā)的最大熒光值。三七皂苷R1處理組為實驗前培養(yǎng)液中加入10 μmol·L－1三七皂苷R1預孵育細胞10 min，并在給藥灌流系統(tǒng)各灌流液中加入10 μmol·L－1三七皂苷R1。

2　結果

2．1PH大鼠模型的鑒定

2．1．1RVSP和RVMI的變化 CH組和MCT組大鼠的RVSP和RVMI均明顯高于CON組（Fig 1），這表明CH和MCT均可致大鼠的右心室內壓增高，肺動脈阻力增高；右心室肥大，右心室重構。

Fig 1 Change of RVSP（A），RVMI（B），and PAs morphology（C and D）of control，CH-and MCT-treated rats

2．1．2肺動脈形態(tài)學的改變 與CON組相比（Fig 1）：CH組和MCT組大鼠肺動脈的管腔面積與總面積的百分比均明顯減??；管壁厚度與動脈半徑的百分比則均明顯升高。以上結果表明，CH和MCT均可致大鼠的肺內動脈平滑肌增生，血管重構。

2．2三七皂苷R1對CPA誘導大鼠PASMCs胞膜Ca2＋內流的作用 用Mn2＋淬滅技術觀察10 μmol ·L－1CPA的無鈣Tyrode液（含0.1 mmol·L－1EGTA和3 μmol·L－1Nif）作用PASMCs 15 min后的胞膜Ca2＋（Mn2＋代替Ca2＋）內流即SOCE的變化［10］。結果顯示（Fig 2）：CH組和MCT組大鼠CPA誘導PASMCs胞膜Ca2＋內流速率均明顯高于正常組大鼠［500 s的ΔFluorescence值：CON組＝（－41.7±9.5）%，n＝10；CH組＝（－53.4± 10.5）%，n＝10，P＜0.01；MCT組＝（－70.3± 7.0）%，n＝10，P＜0.01。Mn2＋最大淬滅率：CON組＝（－1.34±0.40）%·s－1，n＝10；CH組＝（－2.61±0.88）%·s－1，n＝10，P＜0.01；MCT組＝（－3.51±1.56）%·s－1，n＝10，P＜0.01］，提示CH組和MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能增強。10 μmol·L－1三七皂苷R1預處理均可明顯抑制CH組和MCT組大鼠CPA誘導PASMCs胞膜Ca2＋內流速率［500 s的ΔFluorescence值：CON組＝（－31.1±7.5）%，n＝10，P＜0.05；CH組＝（－38.2±8.2）%，n＝10，P＜0.01；MCT組＝（－50.4 ±8.3）%，n＝9，P＜0.01；Mn2＋最大淬滅率：CON組＝（－0.86±0.36）%·s－1，n＝10，P＜0.01；CH組＝（－1.75±0.42）%·s－1，n＝10，P＜0.01；MCT組＝（－1.64±0.51）%·s－1，n＝9，P＜0.01］。這提示三七皂苷R1均可抑制CH組及MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能。

Fig 2 Effect of notoginsenoside R1 on CPA-induced Ca2＋entry by Mn2＋quenching in PASMCs of control，CH-and MCT-treated rats

Fig 3 Effect of notoginsenoside R1 on CPA-induced Ca2＋transients in PASMCs of control，CH-and MCT-treated rats

2．3三七皂苷R1對CPA誘導大鼠PASMCs ［Ca2＋］i變化的作用 10 μmol·L－1CPA的無鈣Tyrode液（含0.1 mmol·L－1EGTA和3 μmol·L－1Nif）作用PASMCs 15 min，隨后加入Ca2＋（2 mmol· L－1）觀察Ca2＋內流引起［Ca2＋］i的升高即SOCE的變化［10］。結果顯示（Fig 3）：相比CON組，CH組和MCT組大鼠的靜息［Ca2＋］i明顯增高［靜息［Ca2＋］i：CON組＝（119.9±43.5）nmol·L－1，n ＝8；CH組＝（285.6±72.5）nmol·L－1，n＝9，P ＜0.01；MCT組＝（271.2±94.6）nmol·L－1，n＝8，P＜0.01）］；CH組和MCT組大鼠的CPA誘導

Ca2＋內流量也明顯增高［Ca2＋內流：CON組＝（213.2±49.1）nmol·L－1，n＝8；CH組＝（406.1 ±103.5）nmol·L－1，n＝9，P＜0.01；MCT組＝（581.1±147.5）nmol·L－1，n＝8，P＜0.01］；但CH組和MCT組大鼠的CPA誘導Ca2＋釋放量無明顯變化。這也說明CH組和MCT組大鼠PASMCs 對CPA的高反應性，從另一方面進一步提示MCT組大鼠PASMCs SOCE功能增強。10 μmol·L－1三七皂苷R1預處理可明顯降低CH組和MCT組大鼠PASMCs靜息［Ca2＋］i靜息［Ca2＋］i：CON組＝（75.9±31.1）nmol·L－1，n＝9，P＜0.05；CH組＝（151.6±34.0）nmol·L－1，n＝9，P＜0.01；MCT組＝（149.9±45.2）nmol·L－1，n＝8，P＜0.01］和抑制CPA誘導Ca2＋內流量［Ca2＋內流：CON組＝（139.6±34.9）nmol·L－1，n＝9，P＜0.01；CH組＝（231.1±45.5）nmol·L－1，n＝9，P＜0.01；MCT組＝（267.1±66.7）nmol·L－1，n＝8，P＜0.01］；但對CPA誘導Ca2＋釋放量也無變化。這從另一方面進一步證實三七皂苷R1可抑制CH組和MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能。

3　討論

PH是指由不同發(fā)病機制引起的肺動脈壓力增高所表現(xiàn)的疾病狀態(tài)，可導致右心室肥厚，最終引起右心衰竭而死亡。PH屬于進展性疾病，嚴重威脅人類健康，迄今尚缺乏有效的治療手段。2013年第五次全球PH會議將PH重新分為以下5類［1］：①肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH），如特發(fā)性PAH和藥物和毒素引起PAH等；②左心疾病相關的PH；③與肺部疾病或低氧有關的PH；④慢性血栓栓塞性PH；⑤其他各種原因所造成的PH。本研究采用CH或MCT誘發(fā)PH模型分別代表第三類和第一類的PH。研究發(fā)現(xiàn)兩種造模大鼠RVSP、RVMI和肺動脈管壁厚度與動脈半徑的的百分比均明顯升高，而肺動脈管腔面積與總面積百分比均明顯減小，說明CH或MCT均可致大鼠肺內動脈平滑肌增生、血管重構、肺動脈阻力增高，右心室內壓增高導致右心室肥大和重構。這些結果表明CH或MCT誘發(fā)的PH大鼠模型均成功建立。

雖然不同類型的PH的發(fā)病機制各不相同，但它們都具有血管基礎張力和血管反應性增加、血管平滑肌增生和血管重構等肺血管功能異常的共同特點，說明它們在疾病發(fā)展過程中可能存在著某些共同的信號通路。目前研究表明，［Ca2＋］i水平的增加在PH形成和血管重構等過程中起重要作用［3］。SOCE是肺動脈平滑肌中一個很重要鈣內流通路，由Ca2＋池耗竭而激活［11］。先前的研究發(fā)現(xiàn)：特發(fā)性PAH患者PASMCs的SOCE增強［4］；CH致PH大鼠中，SOCE增強，PASMCs靜息［Ca2＋］i水平上升和肺動脈緊張度增加［5］，并在CHPH發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用［6］；MCT誘發(fā)PH大鼠中，SOCE增強，且SOCE在ET-1高血管反應性中起重要作用［7］。這說明［Ca2＋］i增加和SOCE通路是不同PH發(fā)病機制中的共同通路。

三七總皂苷是人參屬中藥三七的主要有效活性成分。三七皂苷R1是三七總皂苷的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化應激、抗凋亡等藥理作用，可用于心血管系統(tǒng)疾病的治療［12－13］。我們研究發(fā)現(xiàn)，人參屬的人參皂苷Rb1抑制SOCE，降低正常和肺高壓大鼠肺動脈對血管激動劑的收縮作用［14］。相同的是，有研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1具有減輕低氧和高碳酸血癥誘導游離大鼠肺動脈環(huán)收縮的作用［7］。我們先前研究也發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1可能通過抑制SOCE，降低肺高壓模型大鼠肺動脈對血管激動劑的收縮作用［8］。然而，三七皂苷R1對CH及MCT致PH模型大鼠PASMCs SOCE的作用，目前尚不清楚。

為明確三七皂苷R1對PASMCs SOCE的作用，本研究采用SOCE特異性激活劑CPA。CPA是內質網Ca2＋泵抑制劑，通過抑制Ca2＋泵，將Ca2＋泵入內質網，引起內質網Ca2＋釋放所致的瞬時胞內Ca2＋濃度升高，然后隨著內質網Ca2＋的耗竭，特異性激活SOCE。通過Mn2＋淬滅Fura-2熒光實驗，在Nif預處理情況下，本研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1可明顯抑制CH組和MCT組大鼠CPA誘導PASMCs胞膜Ca2＋內流速率，提示三七皂苷R1可抑制CH組及MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能。通過另一種觀察SOCE的方法Fluo-3熒光檢測［Ca2＋］i［10］，在Nif預處理情況下，本研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1可明顯降低CH及MCT致PH大鼠PASMCs靜息［Ca2＋］i和抑制CPA誘導Ca2＋內流，從另一方面進一步證實三七皂苷R1可抑制CH組及MCT組大鼠PASMCs的SOCE功能，這可能是三七皂苷R1降低CH及MCT 致PH大鼠PASMCs靜息［Ca2＋］i的主要因素。

總之，三七皂苷R1具有抑制CH和MCT致PH大鼠PASMCs SOCE和降低靜息［Ca2＋］i的作用，而［Ca2＋］i增加和SOCE通路是不同PH發(fā)病機制中的共同通路，因此三七皂苷R1對PH的臨床治療前景可觀。

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Inhibition of notoginsenoside R1 on SOCE in pulmonary arterial smooth muscle cells of pulmonary hypertension rats

WANG Rui-xing，DAI Mao，MU Yun-ping，JIANG Jiao，HUANG Qiu-hong，WU Zhi-juan，JIAO Hai-xia，LIN Mo-jun
（Dept of Physiology and Pathophysiology，Laboratory of Cardiovascular Science，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350108，China）

Abstract：Aim To evaluate the effects of notoginsen-oside R1 on store-operated calcium entry（SOCE）in pulmonary arterial smooth muscle cells（PASMCs）of chronic hypoxia（CH）-and monocrotaline（MCT）-in-duced pulmonary hypertension（PH）rats．Methods Mn2＋quenching of Fura-2 and measurement of intra-cellular free calcium concentration（［Ca2＋］i）using fluo-3 were examined in PASMCs of CH-exposed and MCT-treated rats．Results ①CH-exposed and MCT-treated rats exhibited profound PH when examined 3 weeks after hypoxia exposure or MCT injection，respec-tively．②In the presence of 3 μmol·L－1nifedipine，10 μmol·L－1notoginsenoside R1 significantly re-duced cyclopiazonic acid（CPA）-induced the percent reduction in Fura-2 fluorescence measured 500 sec af-ter application of Mn2＋，the maximal rate of Mn2＋quenching，the amplitude of the Ca2＋influx transient and the resting［Ca2＋］iin PASMCs of CH-exposed and MCT-treated rats．Conclusion Notoginsenoside R1 inhibits SOCE and reduces resting［Ca2＋］iin PASMCs of CH-and MCT-induced PH rats．

Key words：pulmonary hypertension；chronic hypoxia；monocrotaline；notoginsenoside R1；store-operated cal-cium entry；pulmonary arterial smooth muscle cell

作者簡介：王瑞幸（1976－），男，博士，講師，研究方向：肺高壓致病機制，E-mail：wrx530＠163．com；戴 耄（1989－），男，碩士，研究方向：肺高壓致病機制，并列第一作者，E-mail：daimao890629＠163．com；林默君（1964－），男，博士，教授，研究方向：肺高壓致病機制，通訊作者，Tel：0591-22862429，E-mail：mjlin＠m(xù)ail．fjmu．edu．cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 31171104，31371165，81400236）；福建省自然科學基金資助項目（No 2015J01313）

收稿日期：2015－06－18，修回日期：2015－07－06

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1463－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．027