組織自發(fā)熒光在大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷中的應用

田樹紅，王日超，邢桂蘭，符 健

（海南醫(yī)學院海南省藥物安全性評價研究中心，海南?？?571199）

組織自發(fā)熒光在大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷中的應用

田樹紅，王日超，邢桂蘭，符 健

（海南醫(yī)學院海南省藥物安全性評價研究中心，海南?？?571199）

中國圖書分類號：R-332；R322.81；R445；R743.31

摘要：目的 基于特定的熒光檢測技術(shù)，探討組織自發(fā)熒光在大鼠局灶性腦缺血及再灌注損傷中的應用。方法 本研究通過caliper精諾真IVIS活體成像技術(shù)檢測大鼠腦組織的自發(fā)熒光。通過熒光檢測，比較正常大鼠和局灶性腦缺血／再灌注損傷大鼠腦組織對應部位自發(fā)熒光強弱的變化，并進行定量分析。結(jié)果 實驗結(jié)果表明，局灶性腦缺血／再灌注損傷腦組織的自發(fā)熒光發(fā)生了明顯變化，損傷部位的自發(fā)熒光信號明顯增強，將熒光信號通過活體成像系統(tǒng)進行定量，與正常腦組織比較差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01。結(jié)論 大鼠腦組織在局灶性腦缺血／再灌注損傷后，腦組織的自發(fā)熒光明顯增強，為大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷模型的研究及其評價提供新的方法。

關(guān)鍵詞：大鼠；腦組織；自發(fā)熒光；局灶性腦缺血／再灌注；活體成像系統(tǒng)

網(wǎng)絡出版時間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．058．html

大腦中動脈是人類腦卒中的多發(fā)部位［1］。腦卒中又稱中風或腦血管意外，是由腦部血液循環(huán)障礙導致局部神經(jīng)功能缺失的疾病，包括顱內(nèi)和顱外動脈、靜脈及靜脈竇的疾病，其中以動脈疾病較為常見［2］。大腦中動脈阻塞模型是局灶性腦缺血的標準動物模型。然而在該模型的定量評價指標中主要以腦梗死面積及含水量測定為主［1，3］。在梗死面積的測定時，需要做腦切片，采用氯化三苯基四氮唑染色顯示梗死的腦組織，其中粉紅色為正常腦組織，白色為梗死區(qū)，然后拍照，運用相關(guān)軟件計算每片腦組織的梗死面積，或者用“梗死范圍”法，將白色腦組織挖下稱重，以梗死組織質(zhì)量占總腦質(zhì)量的百分比作為腦梗死范圍。很明顯，傳統(tǒng)的方法只能計算每片腦組織1個切面的梗死面積，“梗死范圍”法誤差更大，都無法精確的表現(xiàn)出腦梗死的真實情況。

組織自發(fā)熒光是一種常見的現(xiàn)象［1－3］，如果能用一種精密儀器，能檢測到組織自發(fā)熒光并將其定量，那么就能解決傳統(tǒng)方法不能解決的局灶性腦缺血／再灌注損傷模型梗死部位腦組織的精確定量評價問題。目前，應用熒光檢測技術(shù)對正常大鼠和局灶性腦缺血／再灌注損傷大鼠腦組織進行自發(fā)熒光檢測和熒光強度的定量分析還未見報道。Caliper Ki-netics IVIS活體成像系統(tǒng)能檢測到較微弱的組織自發(fā)熒光，

而且能夠?qū)晒鈴姸冗M行定量分析。本研究運用該系統(tǒng)更加形象的展示出大鼠腦組織不同部位的自發(fā)熒光情況，更為精確的計算出腦梗死的面積，為大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷模型的研究及其評價提供新的依據(jù)。

1　材料與方法

1．1實驗動物及飼養(yǎng)條件 SPF級SD大鼠購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，體質(zhì)量280～300 g，♂。實驗動物飼養(yǎng)的環(huán)境條件符合國家標準（GB14925－2010）對SPF級實驗動物環(huán)境條件的要求。實驗室溫度為20℃－26℃，最大日溫差／℃≤4，相對濕度為40%－70%，最小換氣次數(shù)≥15（次／h），空氣潔凈度為7級，相同區(qū)域的最小壓差≥10 Pa，沉降菌最大平均濃度≤3（CFU／0.5 h·Φ 90 mm平皿），氨濃度≤14 mg／m3，噪聲不高于60 dB，動物照度為15－20 lx。

1．2實驗動物飼料及飲用水 實驗動物飼料購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，符合GB-14924.3-2010標準。飲用水經(jīng)海口市疾病預防控制中心現(xiàn)場采樣進行理化指標及微生物指標檢測，所檢測項目結(jié)果均符合現(xiàn)行國家《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB 5749-2006）規(guī)定的限值要求。

1．3SD大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷模型的制備 采用線栓法（thread occlusion of the middle cerebral artery）制備SD大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷模型［1，4］：選擇檢疫合格的♂SD大鼠，體質(zhì)量為280－300 g。經(jīng)腹腔注射水合氯醛（300 mg·kg－1劑量）麻醉，取仰臥位固定，剪去手術(shù)部位毛發(fā)，安爾碘消毒皮膚，切開頸部皮膚，鈍性分離，顯露右側(cè)頸總動脈（CCA）及迷走神經(jīng)。結(jié)扎CCA、頸外動脈（ECA），動脈夾夾閉右側(cè)頸內(nèi)動脈（ICA）。在ECA結(jié)扎處用眼科剪剪一個小口，將準備好的線栓經(jīng)該口插入，經(jīng)ECA、ICA分叉處進入ICA，再向前推進18－20 mm時會有阻擋感，說明線栓已穿過MCA，到達大腦前動脈的起始部，堵塞MCA開口，造成腦組織局部缺血。2 h后緩慢拔出線栓實施再灌注損傷。

1．4局灶性腦缺血／再灌注模型神經(jīng)癥狀和體征的評價局灶性腦缺血／再灌注模型神經(jīng)癥狀和體征的評價參照Zea-longa［1，5］的5分測評方法進行評分。0分：無神經(jīng)功能缺失，活動正常；1分：不能伸展對側(cè)前爪；2分：爬行時出現(xiàn)外側(cè)轉(zhuǎn)圈（追尾征）；3分：行走時身體向?qū)?cè)倒；4分：不能行走，意識喪失。24 h后麻醉放血處死動物，取出大腦，9 000 mg·L－1氯化鈉注射液洗干凈，置于干凈的紗布上吸干表面的氯化鈉注射液備用。

1．5SD大鼠腦組織自發(fā)熒光檢測 采用caliper精諾真IVIS活體成像技術(shù)檢測大鼠腦組織的自發(fā)熒光，選擇熒光檢測。依據(jù)Zealonga評分標準，選擇分值為2分的動物進行腦組織自發(fā)熒光檢測。將準備好的腦組織放入活體成像儀內(nèi)合適的位置，然后進行拍照、數(shù)據(jù)分析和保存。先對腦組織進行完整分析，然后再橫向切成數(shù)片進行局部分析，以確定損傷的部位和損傷的程度。

1．6SD大鼠正常腦組織和局灶性腦缺血／再灌注損傷腦組織自發(fā)熒光部位的比較 選擇檢疫合格的SD大鼠，挑選體重較為接近的動物進行比較。根據(jù)活體成像系統(tǒng)所得到的正常腦組織和局灶性腦缺血／再灌注損傷腦組織自發(fā)熒光所在的不同部位及其熒光強度差異分析，可以得出它們之間所存在的明顯差異。

1．7組織自發(fā)熒光定量分析 采用caliper精諾真IVIS活體成像分析軟件對實驗結(jié)果進行定量分析。

2　結(jié)果

2．1SD大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷模型的制備 采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷模型，并依據(jù)Zea-longa的測評方法進行評分。結(jié)果表明，在12只造模動物中，有7只動物分值為2分（Fig 1A），表現(xiàn)體征為不能伸展對側(cè)前爪，爬行時出現(xiàn)外側(cè)轉(zhuǎn)圈；有5只動物分值為3分，表現(xiàn)體征為不能伸展對側(cè)前爪，行走時身體向?qū)?cè)跌倒。Fig 1B為Fig 1A中所示動物的腦組織，從中可以看出，大腦右半球出現(xiàn)水腫，體積比左半球略大，且其顏色也比左半球的白。

Fig 1 Preparation of focal cerebral ischemia reperfusion injury model in rats

2．2灶性腦缺血／再灌注損傷腦組織自發(fā)熒光檢測 采用小動物活體成像的熒光檢測技術(shù)對局灶性腦缺血／再灌注損傷腦組織進行熒光檢測（Fig 2），結(jié)果表明，局灶性腦缺血／再灌注損傷模型的左半球大腦和右半球大腦熒光呈現(xiàn)出明顯的區(qū)別，右半球大腦熒光強度明顯比左半球大腦強。從Fig 2 A－I可以看出，大腦組織損傷的部位和損傷的程度，熒光強度越強，損傷越嚴重。

2．3大鼠大腦組織TTC染色與自發(fā)熒光檢測的比較 將正常大鼠和模型大鼠的大腦切片，先用小動物活體成像系統(tǒng)進行熒光檢測，然后再進行TTC染色。實驗結(jié)果如Fig 3所示。結(jié)果表明，局灶性腦缺血／再灌注損傷大腦梗死部位未被TTC染色，但其熒光強度明顯增強。分別選取了7只正常和局灶性腦缺血／再灌注損傷SD大鼠的腦組織進行自發(fā)熒光檢測和分析。其中損傷組動物的神經(jīng)癥狀和體征的評分均為2分。將正常組和損傷組2個組的動物分別變?yōu)?－7號，相同號數(shù)同時檢測，不同號數(shù)用不同的顏色表示。結(jié)果表明，正常動物同一腦組織左側(cè)和右側(cè)自發(fā)熒光強度無明顯差異，基本一致。而損傷同一腦組織左側(cè)和右側(cè)自發(fā)熒光強度存在明顯差異，如圖中綠色箭頭所示部分，其熒光強度明顯高于其它部位。

Fig 2 Autofluorescence of focal cerebral ischemia reperfusion injury of brain tissue by IVIS

2．4組織自發(fā)熒光定量分析 從Fig 4中可以清晰的看出損傷腦組織的部位和范圍。但是還需要將結(jié)果進行定量分析，即計算出整個腦組織的熒光強度。從Fig 4中還可以看出，腦組織的自發(fā)熒光強度和腦組織的損傷程度直接相關(guān)，損傷程度越重，自發(fā)熒光強度越強。因此，可以通過Caliper Kinetics IVIS活體成像系統(tǒng)對整個腦組織或者是感興趣部位的自發(fā)熒光強度進行定量分析（Fig 5，Tab 1），所得到的數(shù)據(jù)再通過如SPSS等統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，比較正常腦組織和損傷腦組織的差異是否具有統(tǒng)計學意義。如Fig 5所示，可以隨意定量分析自己所感興趣的部位，或是將腦組織從這里切開再進行分析。如Tab 1所示，損傷組腦組織自發(fā)熒光強度與正常腦組織比較明顯增強，且差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01。

Tab 1 Data analysis of brain tissue autofluorescence for normal control group and draw focal cerebral ischemia reperfusion group（±s，n＝7）

Tab 1 Data analysis of brain tissue autofluorescence for normal control group and draw focal cerebral ischemia reperfusion group（±s，n＝7）

P＜0.01 vs normal control group．

Group　Fluorescence intensity（p／sec／cm2／st μW／cm2）Normal　1．62E＋08±4．01E＋07 Damage model　5．73E＋08±4．57E＋07

Fig 3 TTC staining of rat brain tissue with spontaneous fluorescence detection

Fig 4 Autofluorescence of brain tissue for normal and draw focal cerebral ischemia reperfusion injury of SD rats brain tissue

Fig 5 Quantitative analysis of organization spontaneous fluorescence

3　討論

局灶性腦缺血／再灌注模型的造模方法很多，比如線栓法、電凝法、光化學法和血栓法等［1］，技術(shù)也非常成熟。但對于腦梗死的評價方法還有待完善和創(chuàng)新。本研究首次提出用組織自發(fā)熒光來評價局灶性腦缺血／再灌注損傷的腦組織。

我們通過研究發(fā)現(xiàn)，通過活體成像系統(tǒng)能非常好地檢測到腦組織自發(fā)熒光；其次，局灶性腦缺血／再灌注損傷部位的腦組織自發(fā)熒光強度與正常腦組織相比明顯增強，且實驗結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學意義；第三，不用將大腦組織切片，也不用經(jīng)過TTC染色以及繁瑣的梗死面積和體積的計算，可以直接通過活體成像系統(tǒng)軟件精確而又快速地計算出梗死部位或任意部位或整個腦組織的自發(fā)熒光的強度進行定量分析。

從Fig 3D和Fig 5D圖片中可以看出，將腦組織從熒光強度最強的部位橫向切開成片再進行自發(fā)熒光檢測，右側(cè)大腦不同梗死部位熒光強度也有所不同。綜合分析Fig 3C和D，結(jié)果表明：右側(cè)大腦的尾狀殼核、胼胝體和蒼白球等部位熒光強度明顯強于大腦皮質(zhì)層。這說明即便是在均未被TTC染色的梗死區(qū)，不同部位自發(fā)熒光強度也具有較大差異。損傷程度較低的左側(cè)大腦自發(fā)熒光強度也明顯低于右側(cè)大腦，而正常腦組織左右側(cè)大腦的自發(fā)熒光強度并沒有明顯的區(qū)別。大鼠的腦組織在腦缺血／再灌注損傷時，損傷部位的受體活化效應可引發(fā)大量的Ca2＋內(nèi)流，同時激活細胞內(nèi)Ca2＋庫的釋放，并導致細胞內(nèi)游離Ca2＋超載［6］。因此，我們推測損傷腦組織自發(fā)熒光明顯增強可能與細胞內(nèi)游離Ca2＋超載有關(guān)。在今后的研究中，我們將進一步具體分析梗死區(qū)域不同部位以及正常腦組織不同部位的自發(fā)熒光強度的差異及其產(chǎn)生這種差異的原因。

參考文獻：

［1］ Zhou G X，Gao C，Xu P，et al．Replication methodology of animal models for human disease［M］．Shanghai：Shanghai scientific and technological literature press，2008：249－51．

［2］ Walberer M，Stolz E，Muller C，et al．Experimentalstroke：ischaemic lesion volume and oedema formation differ among rat strains（acom-parison between Wistar and Sprague-Dawley rat susing MRI）［J］．LabAnim，2006，40（1）：1－8．

［3］ Sakurama T，Kitamura R，Kaneko M．Tissue-type plasminogen acti-ator improves neurological functions in a rat model of thromboem-bolic stroke［J］．Stroke，1994，25（2）：451－6．

◇研究簡報◇

［4］ Toshima Y，Sstoh S，Ikegaki I，Asano T．A new model of cerebral microthrombosis in rat and the neuropotective effect of a Rho-Ki-nase inhibitor［J］．Stroke，2000，31（9）：2245－50．

［5］ Lin C L，Calisaneller T，Ukita N，et al．A murine model of sub-arachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm［J］．Neurosci Meth，2003，1（123）：89－97．

［6］ Jensen A，Garnier Y，Middelanis J．Perinatal brain damage-patho-physiology to prevention［J］．Europ J Obstet Gynecol Reproduct Bi-ol，2003，110（suppl）：70－9．

Application of tissue spontaneous fluorescence in draw focal cerebral ischemia reperfusion injury of rats

TIAN Shu-hong，WANG Ri-chao，XING Gui-lan，F(xiàn)U Jian
（Hainan Research Center for Drug Safety Evaluation，Hainan Medical University，Haikou 571199，China）

Abstract：Aim To discuss the application of tissue spontane-ous fluorescence for draw focal cerebral ischemia reperfusion in-jury in rats based on specific fluorescence detection technology．Methods The change of spontaneous fluorescence WAS COM-PARED between the brains of normal rats and those of rats with draw focal cerebral ischemia-reperfusion injury and an quantita-tive analysis was then made．Result The results showed that spontaneous fluorescence of brain tissue for focal cerebral ische-mia reperfusion injury changed significantly．Spontaneous fluo-rescence signal of injury considerably enhanced．The fluores- cence signal which was quantified by IVIS had significant statisti-cal significance compared with normal brain tissue，P＜0．05．Conclusion Our research shows that spontaneous fluorescence of brain tissue enhances obviously after focal cerebral ischemia-reperfusion injury．Our research provides a method for the re-search and evaluation of focal cerebral ischemia-reperfusion inju-ry model in rats．

Key words：rat；brain tissue；autofluorescence；focal cerebral is-chemia reperfusion；in vivo imaging system

作者簡介：田樹紅（1980－），男，碩士，助理研究員，研究方向：藥理學與毒理學、抗腫瘤藥效學，E-mail：18089862900＠163．com；符 ?。?960－），男，博士，教授，研究方向：藥理毒理學，通訊作者，Tel：0898-66982118，E-mail：Fujian．hnmc＠163．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81160408）

收稿日期：2015－06－12，修回日期：2015－07－27

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1473－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．029