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    升麻素在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究

    2015-02-26 06:55:28王曉鈺江小燕劉海亮
    中國藥理學通報 2015年10期
    關(guān)鍵詞:藥代動力學方法學

    王曉鈺,江小燕,于 曦,劉海亮,王 燕,陶 羽,洪 敏

    (南京中醫(yī)藥大學藥學院,科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,江蘇南京 210023)

    升麻素在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究

    王曉鈺,江小燕,于 曦,劉海亮,王 燕,陶 羽,洪 敏

    (南京中醫(yī)藥大學藥學院,科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,江蘇南京 210023)

    中國圖書分類號:R-332;R282.71;R284.1;R969.1

    摘要:目的 建立升麻素(cimifugin)血藥濃度的高效液相色譜(HPLC)測定方法,研究其在大鼠體內(nèi)的藥代動力學特點。方法 大鼠灌胃給予升麻素,取各時間點大鼠血漿,采用乙腈蛋白沉淀法,運用內(nèi)標法進行HPLC檢測,并用DAS2.1軟件計算藥代動力學參數(shù)。結(jié)果 升麻素血藥濃度的回歸方程為Y=0.187X-0.0236,R2=0.9982,其中升麻素在1~70 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,藥時曲線符合二室開放模型,主要藥代動力學參數(shù)Tmax、Cmax、T1/2α、T1/2z、Vd、AUC(0-t)、AUC(0-∞)分別為80 min、10.359 mg·L-1、47.597 min、93.131 min、2.179 L·kg-1、1946.085 mg·L-1·min、2138.57 mg·L-1·min。結(jié)論建立了升麻素血藥濃度方法,該方法專屬性強,靈敏度高,可用于該藥的體內(nèi)定量分析。升麻素在大鼠體內(nèi)被快速吸收達最大濃度,并發(fā)揮作用。

    關(guān)鍵詞:升麻素;HPLC;大鼠;藥代動力學;方法學;過敏性皮炎

    網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015-9-14 14:53 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150914.1453.046.html

    升麻素(cimifugin)是防風色原酮類成分,具有抗炎解表、祛風益氣之功效。由防風、黃芪、白術(shù)三味藥組成的復(fù)方玉屏風散,通常用于表虛自汗,反復(fù)呼吸道感染及過敏性哮喘、鼻炎、皮炎等過敏性疾?。?]。本實驗室前期研究表明玉屏風散可明顯抑制小鼠過敏性炎癥[2],對玉屏風散含藥血清進行了HPLC-MS分析,推斷出10個成分中,其中4個來源于防風,升麻素即是被檢測的色原酮成分之一,且在血清中含量較高[3],提示升麻素是其主要入血成分之一。藥代動力學的研究對闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、揭示其科學內(nèi)涵,新藥創(chuàng)制、劑型改進以及方劑組分配伍機制的研究均有著非常重要的作用[4],因此為了進一步了解升麻素在體內(nèi)的吸收代謝規(guī)律,本實驗建立了升麻素血藥濃度的HPLC檢測方法。考察了升麻素在大鼠體內(nèi)的藥代動力學特點,為升麻素的藥物研發(fā)及藥理作用和機制研究提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1儀器 LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng),SPD-M20A二極管陣列檢測器,SIL-20A全自動進樣器,日本島津;MTN-2000W氮氣濃縮儀,天津奧特賽恩斯儀器有限公司;MS3渦旋震蕩混勻儀,德國IKA;Microfuge16離心機,美國BECKMAN。

    1.2主要試劑 升麻素,購于上海永恒生物科技有限公司,批號:20120511;對照品升麻素(批號:111710-200501)、葛根素(批號:110752-200912,96%)購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇為色譜純(江蘇漢邦科技有限公司);水為純水;乙腈為色譜純(山東禹王實業(yè)有限公司);其他試劑均為分析純。

    1.3實驗動物 SD大鼠72只,♀♂各半。購于南京醫(yī)科大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(蘇)2013-0005。

    1.4標準品溶液的制備 取1 mg升麻素對照品,精密稱定,加甲醇定容至1 mL,用于配制標準曲線。取1 g·L-1升麻素對照品,配成1~70 mg·L-1濃度范圍內(nèi)的標準品。

    1.5色譜條件 色譜柱:Dikma platisil ODS 5U C18柱(25 cm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇(A),純水(B),梯度洗脫:0-10 min,20∶80(V/V)-40∶60(V/V),10-30 min,55∶45(V/V);檢測波長:286 nm;流速:1 ml·min-1;進樣量:10 μL。

    1.6動物處理 將72只SD大鼠隨機分為12組,每組6只,除空白組外,其余按小鼠50 mg·kg-1給藥劑量換算成大鼠為34 mg·kg-1,給藥體積10 ml ·kg-1。灌胃前禁食12 h,自由飲水,各組灌胃升麻素后分別在12、20、40 min、1、2、3、4.5、6、8、12、24 h時間點眼眶靜脈叢取血0.5 mL,置于1.5 mL離心管中(加肝素抗凝),以3 500 r·min-1,離心10 min,取上層血漿備用。

    1.7血漿樣品處理 在100 μL血漿中加入300 μL乙腈,100 μL甲醇和30 μL內(nèi)標溶液(葛根素50 mg·L-1),渦旋3 min,離心(10 400 r·min-1)5 min,取上清,37℃氮氣吹干,100 μL甲醇復(fù)溶,離心3 min,進樣10 μL,進行HPLC檢測。

    1.8標準曲線制備 取70、42、29.4、21、10、6、3、1 mg·L-1甲醇溶解的對照品溶液100 μL。加入到100 μL空白血漿中,再加入300 μL乙腈,30 μL內(nèi)標溶液,渦旋3 min,離心(10 400 r·min-1)5 min,取上清,37℃氮氣吹干,100 μL甲醇復(fù)溶,離心3 min,進樣10 μL。以對照品峰面積A1/內(nèi)標峰面積A2為縱坐標,濃度C(mg·L-1)為橫坐標,繪制標準曲線。

    2 結(jié)果

    2.1專屬性 分別取空白血漿、含升麻素與葛根素(內(nèi)標)的空白血漿、受試大鼠含藥血漿,按“1.7”項下方法處理,液相色譜中進樣,獲得相應(yīng)色譜圖,專屬性實驗結(jié)果顯示葛根素的保留時間是13.595 min,升麻素的保留時間是22.145 min,色譜分離良好,不受內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾,見Fig 1。

    Fig 1 HPLC chromatograms of cimifugin in plasma

    2.2穩(wěn)定性 按“1.7”項下方法處理制備70 mg·

    L-1(高)、29.4 mg·L-1(中)、3 mg·L-1(低)3個濃度的升麻素樣品,分別于-40℃與常溫下反復(fù)凍融3次,每次各30 min,每個濃度平行操作3份。結(jié)果顯示RSD值均小于0.5%,樣品反復(fù)凍融3次仍穩(wěn)定,見Tab 1。

    Tab 1 Stability result of cimifugin in plasma of rats(n=3)

    2.3精密度 按“1.7”項下方法處理,制備70 mg ·L-1(高)、29.4 mg·L-1(中)、3 mg·L-1(低)3個濃度的升麻素樣品,每個濃度平行操作5份,根據(jù)標準曲線計算日內(nèi)和日間精密度,結(jié)果顯示RSD均符合要求,見Tab 2。

    Tab 2 Intra-and inter-precision result of cimifugin in plasma of rats(n=5)

    2.4回收率 按“1.7”項下方法處理,制備70 mg ·L-1(高)、29.4 mg·L-1(中)、3 mg·L-1(低)3個濃度的升麻素樣品,每個濃度平行操作5份,記錄升麻素處理前后峰面積,根據(jù)標準曲線方程,得出血漿中升麻素的濃度,計算回收率,回收率/%=處理后/處理前×100%。結(jié)果顯示回收率、RSD均符合要求,見Tab 3。

    Tab 3 Recovery rate of cimifugin in plasma of rats(n=5)

    2.5標準曲線 按“1.8”項下方法分析結(jié)果,計算出相應(yīng)的回歸方程:A1/A2=0.187C-0.0236,R2=0.9982,其中升麻素在1~70 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,見Fig 2。

    2.6藥代動力學參數(shù) 大鼠灌胃給予34 mg· kg-1升麻素后,各時間點測得平均血藥濃度見Fig 3。用DAS 2.1軟件擬合,升麻素藥代動力學符合二室開放模型,大鼠體內(nèi)的相關(guān)藥動學參數(shù)見Tab 4。

    Fig 2 Calibration curve of cimifugin

    Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of cimifugin(n=6)

    Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of cimifugin(n=6)

    3 討論

    過敏性疾?。╝llergic dieases)是由機體對抗原所產(chǎn)生的異常免疫反應(yīng)引發(fā)的疾病,在過去幾十年中發(fā)病率明顯上升,嚴重影響人們的生活質(zhì)量。目前對該類疾病的治療方案多以西藥為主,但不良反應(yīng)較多。本課題組研究的玉屏風散可用于防治過敏性疾病,防風作為其單味藥,發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為升麻素苷、升麻素等色原酮成分,而升麻素苷在體內(nèi)極易轉(zhuǎn)化為其苷元升麻素[5]。升麻素在大鼠體內(nèi)的藥代動力學過程尚不明確。

    本實驗建立了升麻素血藥濃度測定方法[6],該方法專屬性強,靈敏度高,研究結(jié)果顯示,升麻素單次給藥在80 min左右即達到了最大濃度,其最大濃度為10.359 mg·L-1,半衰期為47.597 min,12 h左右已檢測不到血清含量。這些數(shù)據(jù)表明,升麻素可以吸收入血,其入血后的量可以檢測到,升麻素單次給藥后被迅速吸收達最大濃度,并發(fā)揮作用。前期研究表明,升麻素對Th2型ACD小鼠模型有抑制作用[7-8],本實驗對其藥代動力學的研究為后期升麻素在過敏性疾病致敏和激發(fā)不同階段發(fā)揮作用的研究提供基礎(chǔ),也為新藥研發(fā)提供了理論支持。

    (致謝:本實驗在南京中醫(yī)藥大學藥學院,科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室完成。在此感謝實驗室為我提供的優(yōu)越實驗條件與平臺,同時感謝導(dǎo)師和同學對我的指導(dǎo)和幫助以及中國藥理學通報編輯老師對本文提出的寶貴意見。)

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    Pharmacokinetic study on cimifugin in rats

    WANG Xiao-yu,JIANG Xiao-yan,YU Xi,LIU Hai-liang,WANG Yan,TAO Yu,HONG Min
    (School of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,National Standard Laboratory of Pharmacology for Chinese Materia Medica,Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica,Nanjing 210023,China)

    Abstract:Aim To establish a HPLC method for de-termining cimifugin in rat plasma and investigate the pharmacokinetic characteristics of cimifugin in rats.Methods The plasma concentration of cimifugin was detected by HPLC in acetonitrile protein precipitation method after intragastric administration of cimifugin.The pharmacokinetic parameters were calculated by the procedure of DAS 2.1.Results The regression equa-tion of cimifugin in rats plasma was Y=0.187X-0.0236(R2=0.998 2),which shows a good linear re-lation at 1-70 mg·L-1.The concentration-time curves conformed to two-compartment model.The main pharmacokinetic parameters of Tmax,Cmax,T1/2α,T1/2z,Vd,AUC(0-t)and AUC(0-∞)were 80 min,10.359 mg ·L-1,93.131 min,2.179 L·kg-1,1946.085 mg ·L-1·min,2138.57 mg·L-1·min,respectively.Conclusions We established a HPLC method to de-termine the concentration of cimifugin in plasma.The method is so highly specified and sensitive that it can be used in quantitative analysis in vivo on cimifugin.Cimifugin can be rapidly absorbed,reach the highest concentration and produce effect.

    Key words:cimifugin;HPLC;rat;pharmacokinet-ics;methodology;allergic dermatitis

    作者簡介:王曉鈺(1990-),女,碩士生,研究方向:免疫藥理學,E-mail:wangxiaoyu0504@126.com;洪 敏(1972-),女,博士,教授,研究員,博士生導(dǎo)師,研究方向:中藥免疫藥理學,通訊作者,E-mail:hongmin72@126.com

    基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81473395,81373549,81073121);江蘇省自然科學基金資助項目(No BK20141466);江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點實驗室資助項目(JKLPRD201405);江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目;江蘇省‘青藍工程’資助

    收稿日期:2015-05-20,修回日期:2015-07-23

    文獻標志碼:A

    文章編號:1001-1978(2015)10-1443-04

    doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.10.023

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