DNA-SNP等位基因比率分析快速診斷產(chǎn)前唐氏綜合征

張有成, 張志軍, 潘國(guó)珍, 李　嵐, 馮　燕

(貴州省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 貴州 貴陽(yáng), 550002)

DNA-SNP等位基因比率分析快速診斷產(chǎn)前唐氏綜合征

張有成, 張志軍, 潘國(guó)珍, 李嵐, 馮燕

(貴州省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 貴州 貴陽(yáng), 550002)

摘要:目的探討羊水胎兒上皮細(xì)胞DNA-單核苷酸多態(tài)性(SNP)等位基因比率分析法快速診斷產(chǎn)前唐氏綜合征的效果。方法選取產(chǎn)前診斷為21三體單胎妊娠的凍存羊水標(biāo)本24例及產(chǎn)前診斷為二倍體單胎妊娠的標(biāo)本76例。利用基質(zhì)輔助激光吸收離子化時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF)對(duì)位于21號(hào)染色體上的一個(gè)SNP位點(diǎn)，rs7844進(jìn)行了雜合度的檢測(cè)，對(duì)雜合子樣本進(jìn)行等位基因比率分析。結(jié)果100例羊水標(biāo)本中，檢出rs7844雜合子樣本26例，其中21三體6例，二倍體20例。DNA-SNP等位基因比率分析診斷產(chǎn)前唐氏綜合征只需1～2 d, 但診斷敏感性可達(dá)100%。結(jié)論羊水細(xì)胞DNA-SNP等位基因比率分析可達(dá)到快速診斷產(chǎn)前唐氏綜合征的目的。

關(guān)鍵詞:羊水細(xì)胞; 單核苷酸多態(tài)性; 產(chǎn)前診斷; 唐氏綜合征

唐氏綜合征是最常見(jiàn)的先天性智力低下性疾病[1], 因?yàn)槿狈τ行У闹委煼椒ǎ栽摬〉某錾霸\斷及處理顯得尤為重要。目前，用來(lái)控制唐氏綜合征發(fā)病率的出生前檢測(cè)方法主要有血清學(xué)篩查[2]、超聲篩查[3]、非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)[4]、通過(guò)絨毛活檢或羊膜腔穿刺獲取胎兒細(xì)胞進(jìn)行核型分析[5]或分子生物學(xué)檢測(cè)[6]等。迄今為止，絨毛或羊水細(xì)胞核型分析仍然是產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的金標(biāo)準(zhǔn)[7]，其中應(yīng)用最多的是中孕期羊水細(xì)胞核型分析。該檢測(cè)方法雖然取材方便，結(jié)果可靠，但也有其不足的地方。一是從取材到得到檢查結(jié)果，一般要花費(fèi)3～4周的時(shí)間，使孕婦不得不度過(guò)一段非常焦慮、極其難熬的日子；還有一少部分孕婦因孕周過(guò)大，錯(cuò)過(guò)了體外羊水細(xì)胞培養(yǎng)的最佳取樣時(shí)間，失去了檢查的機(jī)會(huì)。因此有必要發(fā)現(xiàn)一種快速而又不需顧忌羊水細(xì)胞取樣時(shí)間的產(chǎn)前診斷方法。本研究探討一種無(wú)需進(jìn)行羊水細(xì)胞體外培養(yǎng)就能對(duì)唐氏綜合征進(jìn)行快速產(chǎn)前診斷的分子生物學(xué)方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1　羊水標(biāo)本的采集與分類

羊水標(biāo)本來(lái)源于2011年7月—2013年7月在本院實(shí)施產(chǎn)前診斷的孕婦，孕周16～27周，平均孕周21.5周，均為單胎妊娠。每例孕婦在進(jìn)行羊膜腔穿刺時(shí)抽取羊水23 mL, 其中20 mL用來(lái)做細(xì)胞核型分析，另外3 mL標(biāo)記可查詢樣本號(hào)后于-80 ℃冰箱凍存，作為實(shí)驗(yàn)用標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取已有明確細(xì)胞核型分析結(jié)果的凍存羊水標(biāo)本100例，分成2組，其中實(shí)驗(yàn)組包括所有的21三體標(biāo)本，共計(jì)24例；另外，隨機(jī)選取76例二倍體樣本作為對(duì)照組。

1.2　MALDI-TOF檢測(cè)羊水標(biāo)本rs7844雜合度

100份羊水標(biāo)本于室溫解凍后，采用基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)提取羊水細(xì)胞基因組DNA。在GenBank上選取21號(hào)染色體上一個(gè)雜合度較高的SNP，rs7844作為檢測(cè)對(duì)象，應(yīng)用MALDI-TOF檢測(cè)該SNP的基因型分布情況。檢測(cè)步驟包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增樣本DNA，單堿基延伸以及質(zhì)譜檢測(cè)延伸產(chǎn)物。PCR所用引物以及單堿基延伸所用寡核苷酸見(jiàn)表1。

表1　PCR所用引物以及單堿基延伸所用寡核苷酸

注：ACGTTGGATG為10 mol的附加鏈，以防止
質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)誤把剩余的引物當(dāng)做單堿基延伸產(chǎn)物；
延伸產(chǎn)物中黑體字母為被延伸的SNP堿基。

1.2.1PCR擴(kuò)增: 100份羊水細(xì)胞的DNA樣本進(jìn)行384孔反應(yīng)表編制，注明每孔對(duì)應(yīng)的DNA樣本的編號(hào)。每孔反應(yīng)體系5 μL, 包括10×Buffer 0.625 μL, MgCl2(25 mM)0.325 μL, 脫氧核苷酸(dNTP) 1 μL, 上下游引物各0.5 μL, TaqDNA聚合酶(QIAGEN公司) 0.1 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 0.95 μL。反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性15 min; 45個(gè)循環(huán)的94 ℃變性20 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min及72 ℃終末延伸3 min。產(chǎn)物4 ℃保存。

1.2.2單堿基延伸：PCR產(chǎn)物在延伸反應(yīng)前，先進(jìn)行堿基磷酸酶反應(yīng)去除多余的dNTP。然后每孔中加入2 μL的延伸反應(yīng)液，包括: 10×Buffer 0.2 μL, 反應(yīng)終止液0.2 μL, 延伸引物0.804 μL，酶(SEQUENOM公司)0.041 μL, ddH2O 0.755 μL。反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性30 s; 40個(gè)循環(huán)的94 ℃變性5 s、52 ℃退火5 s、80 ℃延伸5 s; 每次變性反應(yīng)后，退火及延伸進(jìn)行5次循環(huán)后再進(jìn)入下一次變性反應(yīng)，以使底物充分反應(yīng)。循環(huán)完成后72 ℃終末延伸3 min。產(chǎn)物4 ℃保存。

1.2.3檢測(cè)：延伸產(chǎn)物在檢測(cè)前，先用樹(shù)脂純化產(chǎn)物，以去除多余的鹽離子。然后將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜檢測(cè)芯片上，即可放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)只需3～5 s, 全自動(dòng)分析，獲得各個(gè)樣本的等位基因型。

1.3　DNA-SNP等位基因比率分析

對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)出的雜合子樣本進(jìn)行等位基因比率分析。雜合子樣本的質(zhì)譜檢測(cè)峰中，用質(zhì)量較小的等位基因的峰面積除以質(zhì)量較大的等位基因的峰面積計(jì)算出等位基因比率。然后對(duì)21三體組和二倍體組的等位基因比率值進(jìn)行比較分析。

2結(jié)果

2.1　100份羊水標(biāo)本的rs7844基因型分布情況

MALDI-TOF檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn), rs7844 SNP純合子在質(zhì)譜檢測(cè)峰圖中只有一個(gè)峰，而雜合子則呈雙峰表現(xiàn)。通過(guò)質(zhì)譜SNP分型檢測(cè)，在所檢測(cè)樣本人群中，只發(fā)現(xiàn)兩種rs7844等位基因型，分別是G/G及C/G。100例樣本中檢出rs7844雜合子樣本26例，其中21三體6例，二倍體20例，雜合度為26%。

2.2　21三體組與二倍體組等位基因比率值比較分析結(jié)果

2組等位基因比率值比較分析結(jié)果可見(jiàn)，21三體組的等位基因比率值都背離于二倍體組的等位基因比率值。二倍體組的參考區(qū)間為1.244-0.710，以這個(gè)區(qū)間的最小值作為二倍體組的下限，則所有的21三體組樣本的比率值都位于這個(gè)下限外，診斷敏感性達(dá)到了100%。

3討論

本實(shí)驗(yàn)借助于時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)的SNP分型及定量檢測(cè)的性能[8-9]，通過(guò)對(duì)羊水細(xì)胞21號(hào)染色體上的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，rs7844的檢測(cè)，進(jìn)行了對(duì)唐氏綜合征進(jìn)行快速產(chǎn)前診斷的研究。通過(guò)質(zhì)譜SNP分型檢測(cè)，100例羊水標(biāo)本中，只發(fā)現(xiàn)兩種rs7844等位基因型，分別是G/G及C/G，雜合度是26%，而沒(méi)有檢測(cè)到C/C的等位基因型，說(shuō)明本地區(qū)rs7844的基因型分布可能有其自己的特征。然后在雜合子樣本可以滿足分析的情況下，進(jìn)行了利用等位基因比率分析對(duì)唐氏綜合征進(jìn)行產(chǎn)前診斷的研究。按照理論分析，一個(gè)二倍體雜合子胎兒，兩個(gè)等位基因的比率應(yīng)該是1C︰1G；而一個(gè)21三體雜合子胎兒，兩個(gè)等位基因的比率應(yīng)該是2C︰1G或1C︰2G。但是實(shí)際檢測(cè)中，根據(jù)質(zhì)譜峰圖的直觀表現(xiàn)以及兩個(gè)等位基因的峰面積值，在21三體雜合子樣本中，只檢測(cè)出1C︰2G的等位基因型，而沒(méi)有檢測(cè)出2C︰1G的等位基因型。這也印證了在本地區(qū)G/G及C/G的基因型分布特征背景下，如果兩種基因型組合產(chǎn)生21三體，那么應(yīng)該以1C∶2G的基因型為多數(shù)。通過(guò)等位基因比率分析，建立起二倍體樣本的參考區(qū)間，設(shè)定上限和下限，然后用每一個(gè)21三體樣本的比率值去和這個(gè)參考區(qū)間進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所有的21三體樣本的比率值都位于這個(gè)參考區(qū)間最小值的下限外，從而使診斷的敏感性達(dá)到了100%。

檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明利用DNA-SNP等位基因比率分析的方法產(chǎn)前檢測(cè)唐氏綜合征具有很高的準(zhǔn)確性和靈敏度。而且該檢測(cè)方法不需羊水細(xì)胞體外培養(yǎng)，因而取樣時(shí)間不受孕周的限制；另外，從DNA提取到結(jié)果分析，在樣本量可以滿足分析的情況下，1～2個(gè)工作日即可完成。這恰恰補(bǔ)充了細(xì)胞核型分析的不足之處。

目前，用來(lái)快速產(chǎn)前檢測(cè)唐氏綜合征的方法有熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QF-PCR)[10]、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)[11],以及基于高通量測(cè)序技術(shù)的非侵入性產(chǎn)前診斷[12]等。非侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)由于其檢測(cè)的樣本混有母血的成分，可靠性有待實(shí)踐的考證[13]，作為一種篩查方案應(yīng)該更為適宜。而QF-PCR受限于特定的檢測(cè)人群。MLPA雖然可以覆蓋到所有人群，但是由于其檢測(cè)的是DNA樣本擴(kuò)增后的總量，所以檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)受到起始模板濃度的影響[14]。而本實(shí)驗(yàn)中，由于檢測(cè)的是兩個(gè)等位基因量的比率值，而并不是DNA擴(kuò)增后的總量，所以即使樣本的起始模板濃度參差不齊，也不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，從而保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由于本實(shí)驗(yàn)的目的是探討利用DNA-SNP等位基因比率分析的方法產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的可行性，所以在實(shí)驗(yàn)中只選取了一個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果證明方案是可行的。當(dāng)然，如果該檢測(cè)方法能夠應(yīng)用到具體實(shí)踐中，僅僅依靠一個(gè)SNP位點(diǎn)是不夠的。在實(shí)驗(yàn)中，利用一個(gè)SNP(rs7844)位點(diǎn)，唐氏綜合征樣本的檢出率達(dá)到了25%(6/24)。為了提高樣本的檢出率，就必須增加SNP雜合子的樣本數(shù)，這可以通過(guò)增加SNP位點(diǎn)來(lái)得到實(shí)現(xiàn)。理論上分析，選取5個(gè)雜合度在26%以上的SNP位點(diǎn)就可以達(dá)到約100%的樣本覆蓋率[1-(1-26%)5≈100%]。而時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)高通量檢測(cè)的特性[15]，能夠一次完成對(duì)多個(gè)SNP的分型檢測(cè)[16]，可滿足對(duì)這一檢測(cè)的要求。當(dāng)然，在實(shí)際檢測(cè)中，應(yīng)該先對(duì)本地區(qū)21號(hào)染色體上的SNP進(jìn)行雜合度的篩查，可以篩選出雜合度高的SNP，選取的數(shù)目應(yīng)該盡量達(dá)到100%的人群覆蓋率，然后建立起每一個(gè)SNP的二倍體參考區(qū)間，這樣才能夠?qū)Υ龣z樣本進(jìn)行唐氏綜合征的產(chǎn)前診斷。

參考文獻(xiàn)

[1]Vundinti B R, Ghosh K. Incidence of Down syndrome: Hypotheses and reality[J]. Indian J Hum Genet, 2011, 17(3): 117.

[2]Dreux S, Nguyen C, Czerkiewicz I, et al. Down syndrome maternal serum marker screening after 18 weeks of gestation: a countrywide study[J]. Am J Obstet Gynecol, 2013, 208(5): 397.

[3]Cuckle H, Maymon R. Role of second-trimester ultrasound in screening for Down syndrome[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2013, 41(3): 241.

[4]Xu L, Shi R. Noninvasive prenatal diagnosis using next-generation sequencing[J]. Gynecol Obstet Invest, 2014, 77(2): 73.

[5]Wapner R J, Martin C L, Levy B, et al. Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis[J]. N Engl J Med, 2012, 367(23): 2175.

[6]Jain S, Paniqrahi I, Gupta R, et al. Multiplex quantitative fluorescent olymerase chain reaction for detection of aneuploidies[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2012, 16(6): 624.

[7]Gekas J, van den Berg D G, Durand A, et al. Rapid testing versus karyotyping in Down′s syndrome screening: cost-effectiveness and detection of clinically significant chromosome abnormalities[J]. Eur J Hum Genet, 2011, 19(1): 3.

[8]Millis M P. Medium-throughput SNP genotyping using mass spectrometry: multiplex SNP genotyping using the iPLEX? Gold assay[J]. Methods Mol Biol, 2011, 700: 61.

[9]Tsui NBY, Akolekar R, Chiu RWK, et al. Synergy of total PLAC4 RNA concentration and measurement of the RNA single-nucleotide polymorphism allelic ratio for the noninvasive prenatal detection of trisomy 21[J]. Clin Chem, 2010, 56(1): 73.

[10]Langlois S, Duncan A. Use of a DNA method, QF-PCR, in the prenatal diagnosis of fetal aneuploidies[J]. J Obstet Gynaecol Can, 2011, 33(5): 955.

[11]Chen C P, Su Y N, Lin S Y, et al. Rapid aneuploidy diagnosis by multiplex ligation-dependent probe amplification and array comparative genomic hybridization in pregnancy with major congenital malformations[J]. Taiwan J Obstet Gynecol, 2011, 50(1): 85.

[12]Chiu R W K, Chan K C A, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(51): 20458.

[13]Capoluongo E, Plebani M. Circulating fetal cell-free DNA and prenatal molecular diagnostics: are we ready for consensus[J]. Clin Chem Lab Med, 2014, 52(5): 609.

[14]Chitty L S, Kistler J, Akolekar R, et al. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA): a reliable alternative for fetal chromosome analysis? [J]. J Matern Fetal Neonatal Med, 2012, 25(8): 1383.

[15]Tost J, Gut I G. Genotyping single nucleotide polymorphisms by MALDI mass spectrometry in clinical applications[J]. Clin Biochem, 2005, 38(4): 335.

[16]Kiesler KM, Vallone PM. Allele frequencies for 40 autosomal SNP loci typed for US population samples using electrospray ionization mass spectrometry[J]. Croat Med J, 2013, 54(3): 225.

DNA-SNP allelic ratio analysis for rapid

diagnosis of prenatal Down syndrome

ZHANG Youcheng, ZHANG Zhijun, PAN Guozhen, LI Lan, FENG Yan

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ThePeople′sHospitalofGuizhouProvince,

Guiyang,Guizhou, 550002)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of amniocyte DNA-SNP allelic ratio on rapid diagnosis of prenatal Down syndrome. Methods A total of 100 frozen amniotic fluid samples of singleton pregnancy were selected, including 24 cases of trisomy 21 and 76 cases of euploid by prenatal diagnosis. The heterozygosity of rs7844, a single-nucleotide polymorphism (SNP) located in chromosome 21, was detected by using matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometer analysis, and the DNA-SNP allelic ratios of those cases with heterozygous SNPs were determined. Results26 cases with heterozygous SNP of rs7844 were found in 100 amniotic fluid samples, including 6 cases of trisomy 21 and 20 cases of euploid. The result of DNA-SNP allelic ratio for prenatal diagnosis of Down syndrome came out in 1 or 2 days, and its diagnostic sensitivity was 100%. ConclusionAmniocyte DNA-SNP allelic ratio analysis can be used for rapid prenatal diagnosis of Down syndrome.

KEYWORDS:amniocyte; single-nucleotide polymorphism; prenatal diagnosis; Down syndrome

基金項(xiàng)目:貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2013]2185號(hào))

收稿日期:2014-12-06

中圖分類號(hào):R 714.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)09-084-03

DOI:10.7619/jcmp.201509024