遵義人群維生素D受體基因第八內(nèi)含子多態(tài)性

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基礎(chǔ)醫(yī)學研究

遵義人群維生素D受體基因第八內(nèi)含子多態(tài)性

余曉1，呂純莉2，吳莉莉3，韋若勛3

(1.遵義醫(yī)學院 生物化學教研室，貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 檢驗科，貴州 遵義563099；3.遵義師范學院 生命科學學院，貴州 遵義563002)

[摘要]目的 探討在遵義人群中維生素D受體(vitaminDrecepter，VDR)基因第八內(nèi)含子多態(tài)分布情況。方法 收集119例遵義人群靜脈血標本，用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)法檢測VDR基因第八內(nèi)含子多態(tài)性，分析該位點在遵義人群中的基因型頻率和基因頻率分布規(guī)律。結(jié)果 遵義人群VDR基因的基因型頻率分別為69.75%(TT)、26.89%(Tt)和3.36%(tt)，基因頻率分別為83.2%(T)和16.8%(t)。結(jié)論VDR基因第八內(nèi)含子多態(tài)性在遵義人群中分布具有多態(tài)性。

[關(guān)鍵詞]維生素D；受體基因；第八內(nèi)含子；遵義人群；基因頻率

我國是一個地域遼闊的多民族國家，分析不同地區(qū)和不同民族人群各基因位點的多態(tài)性有著非常重要的遺傳學和醫(yī)學價值[1]。有關(guān)遵義地區(qū)漢族人群維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)基因分布情況少見報道[2]。

VDR是介導(dǎo)1,25-(OH)2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子之一，是類固醇激素/甲狀腺激素受體超基因家族成員之一；在體內(nèi)具有調(diào)節(jié)骨代謝和穩(wěn)定骨量的作用；VDR基因全長75 kb，定位于人12號染色體(12q13)，共11個外顯子[3-5]。已證實VDR基因第八內(nèi)含子(3′末端)存在一個單核苷酸多態(tài)性，即Tru9酶切長度多態(tài)性(TGA→TAA)，沒有改變VDR的氨基酸序列，但是可以影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA3′末端區(qū)域的穩(wěn)定性，從而影響增強子對靶部位的親和力或影響與維生素D的親和力，改變翻譯效率從而改變VDR表達。已有研究表明該酶切長度多態(tài)性與I型糖尿病、群體骨密度、腰椎間盤退變有關(guān)聯(lián)[6-8]。

因此，作者對遵義人群的VDR基因第八內(nèi)含子多態(tài)性進行分析，檢測其基因型和基因在人群中分布頻率，為下一步基因多態(tài)與復(fù)雜基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1對象與方法

1.1研究對象樣本來源于2008年8月至2010年7月遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科體檢樣本，全部為遵義人群，共計119例，樣本間無血緣關(guān)系，男103例，女16例，平均年齡(23.28±6.47)歲；所有研究對象采集靜脈血2 mL，-20 ℃低溫保存；均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取用天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒完成。

1.2.2VDR基因第八內(nèi)含子擴增聚合酶鏈式反應(yīng)擴增用上游引物：5′-GGC AAC CTG AAG GGA GAC GTA-3′(21 bp)；下游引物：5′-CTC TTT GGA CCT CAT CAC CGA C-3′(22 bp)[7]。30 μL反應(yīng)體系中包括基因組DNA 1.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Mix 15 μL。循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36個循環(huán)；72 ℃ 8 min。通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果。

Tru9酶切：10 μL反應(yīng)體系中包括10×buffer F 1 μL，BSA 0.1 μL，Tru9內(nèi)切酶0.3 μL(3U)，PCR產(chǎn)物6 μL。反應(yīng)條件：65 ℃，8 h?；厥蘸?，2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

通過測序驗證酶切結(jié)果，選擇擴增良好的部分PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。

2結(jié)果

2.1PCR擴增結(jié)果擴增產(chǎn)物長461 bp，位于人VDR基因第八內(nèi)含子內(nèi)，電泳檢測為擴增良好的一條帶(見圖1)。

1：DL1000 DNA 分子量標記，2：陰性對照，3～11：PCR產(chǎn)物。圖1　VDR基因i8 PCR擴增電泳圖

2.2VDR基因的Tru9酶切結(jié)果酶切后，TT基因型純合子個體缺乏Tru9酶切位點，表現(xiàn)為461 bp一個片段；tt基因型純合子個體存在該酶切位點，表現(xiàn)為361 bp和100 bp兩個片段；Tt基因型雜合子有461 bp、361 bp和100 bp三個片段。因為2%瓊脂糖凝膠檢測時100 bp條帶不可見，所以TT基因型純合子檢測到461 bp一條帶，Tt基因型雜合子為461 bp和361 bp兩條帶，tt基因型純合子為361 bp一條帶(見圖2)。

1：DL1000 DNA 分子量標記；2、3：TT純合子；4、5：Tt雜合子；6：tt純合子?！　D2　VDR基因第八內(nèi)含子Tru9酶切電泳圖

2.3VDR基因的測序結(jié)果選擇部分擴增良好的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。VDR基因的第八內(nèi)含子Tru9酶切位點為TGA→TAA點突變：反向測序結(jié)果顯示Tt基因型為TCA/TTA(見圖3A)；TT基因型為TCA(見圖3B)；tt基因型反向測序結(jié)果為TTA(見圖3C)。

A：Q24反向測序結(jié)果示雜合子(Tt)； B：Q39反向測序結(jié)果示顯性純合子(TT)；C： 3-66反向測序結(jié)果示隱性純合子(tt)?！　D3　VDR基因第八內(nèi)含子測序圖

2.4VDR基因型頻率和基因頻率分析對遵義人群VDR基因的基因型頻率和基因頻率分布進行分析可見，TT、Tt和tt基因型的頻率分別為69.75%、26.89%和3.36%，T和t的基因頻率分別為0.832和0.168(見表1)。

表1遵義人群VDR基因多態(tài)性情況

基因型頻率分布基因頻率分布TTTtttTt83(69.75%)32(26.89%)4(3.36%)0.8320.168

3討論

迄今為止關(guān)于遵義地區(qū)人群各基因位點多態(tài)性研究鮮有報道。本文選擇遵義地區(qū)人群作為研究對象，探討人群中VDR基因的多態(tài)性，為下一步尋找疾病易感基因奠定基礎(chǔ)。

VDR基因的編碼產(chǎn)物是維生素D受體(VDR)，是類固醇激素/甲狀腺激素受體超基因家族的成員；在人體內(nèi)介導(dǎo)1,25-(OH)2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的生物大分子，位于細胞核內(nèi)，可以調(diào)節(jié)骨代謝，并穩(wěn)定骨量；VDR基因全長75 kb，定位于12號染色體(12q13)，包含11個外顯子。Tru9酶切位點由Ye等發(fā)現(xiàn)，位于VDR基因第八內(nèi)含子中，在白種人群中基因型頻率為TT 80.1%、Tt 18.3%、tt 1.6%，基因頻率為T 0.894，t 0.106[6]；陳為堅等[7]對廣東漢族人群研究發(fā)現(xiàn)該位點基因頻率為T 0.792、t 0.208，表明漢族人t基因頻率比白種人高；張麗婭等[8]研究發(fā)現(xiàn)北京漢族男性該位點基因頻率為T 0.822、t 0.178；鄭敏等[9]研究發(fā)現(xiàn)廣西地區(qū)兒童中該位點基因頻率為T 0.797、t 0.203。本文的研究結(jié)果顯示該位點在遵義人群中的分布是TT 69.75%、Tt 26.89%、tt 3.36%，基因頻率為T 0.832，t 0.168，與陳偉堅、張麗婭、鄭敏研究結(jié)果相近但稍偏低，表明在不同地區(qū)人群基因頻率有一定差異，可能與環(huán)境因素和遵義地區(qū)人群的民族起源、各民族雜居等有關(guān)，有待進一步研究。

另外，VDR基因多態(tài)可能會影響機體內(nèi)免疫反應(yīng)。已經(jīng)證實VDR基因與多種疾病有關(guān)，如維生素D性佝僂病[10]、多發(fā)性硬化[11]等。其中Tru9酶切位點雖然位于VDR基因的第八內(nèi)含子中，G→A堿基變異沒有改變VDR基因蛋白序列，但該位點恰好位于轉(zhuǎn)錄的mRNA3′末端區(qū)域，其多態(tài)影響mRNA的表達和穩(wěn)定性，影響增強子對靶部位的親和力，改變翻譯效率進而改變VDR表達[5]，如張立等[12]研究表明Tt基因型可能是中國漢族女性患侵襲性牙周炎的危險因素。因此，在本文的研究基礎(chǔ)上，課題組擬定展開下一步該位點與骨代謝相關(guān)疾病的研究。

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[收稿2015-10-10;修回2015-11-12]

(編輯：王靜)

The eighth intron of Vitamin D receptor gene polymorphism in Zunyi population

YuXiao1,LvChunli2,WuLili3,WeiRuoxun3

(1.Department of Biochemistry, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China;2. Clinical Laboratory,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China; 3. College of Life Science, Zunyi Normal College, Zunyi Guizhou 563002, China)

[Abstract]Objective To investigate the polymorphism distribution in the eighth intron of Vitamin D Receptor (VDR) gene in Zunyi.Methods Collecting 119 blood samples in Zunyi area, the eighth intron polymorphism ofVDRgene was tested by Restriction Fragment Length Polymorphism analysis, and the distribution of the genotypes and allele frequencies were analyzed.Results The frequencies of genotypes were 69.75%(TT),26.89%(Tt) and 3.36%(tt). The frequencies of theVDRgene were 83.2%(T) and 16.8%(t).Conclusion The eighth intron ofVDRgene in Zunyi population has polymorphisms.

[Key words]vitamin D;receptor gene；the eighth intron；Zunyi population;the fregnencies of gent

[中圖法分類號]R681.5

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2015)06-0604-03

[通信作者]韋若勛，男，博士，副教授，研究方向：分子進化，E-mail:weiruoxun@126.com。

[基金項目]遵義師范學院基礎(chǔ)教育研究項目(NO：13ZYJ063)。