Survivin拮抗肽對人膠質(zhì)瘤U251細胞裸鼠移植瘤生長的影響

趙向東　竇長武△ 　王曉娟　蔣　寧

1)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科　呼和浩特　010050　2)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)免疫教研室　呼和浩特　010050　3)內(nèi)蒙古包頭市包鋼醫(yī)院神經(jīng)外科　包頭　014010

Survivin拮抗肽對人膠質(zhì)瘤U251細胞裸鼠移植瘤生長的影響

趙向東1)竇長武1)△王曉娟2)蔣寧3)

1)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科呼和浩特0100502)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)免疫教研室呼和浩特0100503)內(nèi)蒙古包頭市包鋼醫(yī)院神經(jīng)外科包頭014010

【摘要】目的研究Survivin拮抗肽對裸鼠腦膠質(zhì)瘤的抑制效應(yīng)。方法將體外培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤U251細胞經(jīng)立體定向技術(shù)注入裸鼠腦尾狀核區(qū)域，構(gòu)建荷U251膠質(zhì)瘤裸鼠原位模型。荷瘤11 d后，隨機分成實驗組和對照組，分別經(jīng)腹腔注射Survivin拮抗肽、生理鹽水，30 d后全部處死，制作病理切片和HE染色。應(yīng)用Olimpus CX41顯微鏡圖像分析系統(tǒng)，計算在腫瘤組織的最大切面上，腫瘤壞死面積與腫瘤面積的比值。結(jié)果Survivin拮抗肽實驗組裸鼠的腫瘤壞死面積與腫瘤面積的比值大于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 )。 結(jié)論Survivin拮抗肽對人膠質(zhì)瘤U251細胞裸鼠移植瘤的生長具有抑制效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】膠質(zhì)瘤；U251細胞；Survivin拮抗肽；裸鼠；抑制

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，手術(shù)治療及常規(guī)放化療效果均不佳。研究發(fā)現(xiàn)[1]，Survivin 與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，是腦膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點。前期體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，Survivin拮抗肽對U251細胞增殖具有抑制作用和促進凋亡效應(yīng)[2]。本文旨在通過動物實驗，研究Survivin拮抗肽對人膠質(zhì)瘤U251細胞裸鼠移植瘤的生長是否具有抑制效應(yīng)，為抗膠質(zhì)瘤肽類藥物的研制提供新的依據(jù)。

1材料和方法

1.1細胞制備人膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供)置于37 ℃、5% CO2混合氣體的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng), 收集對數(shù)生長期細胞, 獲得1×107/mL濃度細胞，備用。

1.2裸鼠移植模型建立在超凈工作臺內(nèi)，取4~6周齡的BALB/C裸鼠16只(購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量17.9～23.3 g)，乙醚麻醉成功后，酒精消毒，選冠狀縫后0.4 cm，中線右0.3 cm為穿刺點，接種細胞量2×104個/只。微量加樣器垂直顱骨外板,旋轉(zhuǎn)緩慢進針,落空感后, 繼續(xù)進針2 mm,緩慢注入,待細胞沉積緩慢拔針。

1.3腫瘤生長觀察指標(biāo)將荷瘤11 d的裸鼠，隨機分成A、B 2組，每組8只，A組為實驗組，通過腹腔注射Survivin拮抗肽，濃度為20 mg/100 g，1次/d；B組為對照組，通過腹腔注射等量生理鹽水，1次/d；荷瘤后的30 d，處死全部裸鼠，分離出腦組織做病理切片和HE染色，選取腫瘤組織的最大切面。用Olimpus CX41顯微鏡圖像分析系統(tǒng)(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心實驗室提供)進行圖像分析：計算腫瘤壞死面積與腫瘤面積的比值。

2結(jié)果

2.1荷瘤后出現(xiàn)的癥狀裸鼠荷瘤后20~25 d開始出現(xiàn)較為明顯的臨床癥狀，即活動性明顯降低，對聲、光刺激反應(yīng)遲鈍，雙眼突出，進食量下降，消瘦(圖1、2)。

2.2病理切片分析分離腦組織，可見腦組織表面瘢痕及略向表面隆起的腦組織(圖3、4)。在冠狀切面上可見大腦中線出現(xiàn)偏移，腫瘤組織呈類圓形，與周圍正常腦組織界限不清(圖5、6)。普通高倍顯微鏡下可見腫瘤細胞大小不一且形狀不規(guī)則，與正常細胞差異明顯(圖7)，低倍鏡下可見腫瘤組織的血管及中間的壞死區(qū)(圖8)。通過統(tǒng)計分析得出，Survivin拮抗肽實驗組的腫瘤壞死面積所占總面積比值大于生理鹽水對照組(P<0.05)。見表1。

表1　2組腫瘤壞死面積與腫瘤面積比值

圖1、2　裸鼠荷瘤后出現(xiàn)的癥狀　 　　圖3、4　分離腦組織

圖5、6腫瘤組織圖7高倍鏡下腫瘤細胞圖8低倍鏡下腫瘤組織

3討論

Survivin 是近幾年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族中較強的凋亡抑制因子，在胚胎發(fā)育過程中和腫瘤組織中表達，而在成熟的終末分化組織中表達甚微或缺失[3-4]。Survivin過度表達可引起細胞凋亡不足，其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系[5]，這使得Survivin 的腫瘤靶向治療具有高度的特異性及安全性。抑制Survivin 的表達, 可以促進腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖, 而對正常組織幾乎沒有影響, 這一特點使得Survivin 成為抗腫瘤治療的靶點。腦膠質(zhì)瘤由于其浸潤性生長, 手術(shù)往往不能全切，化療及放療療效差，不良反應(yīng)大。Survivin 在腦膠質(zhì)瘤中的特異性高表達, 為腦膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了可靠基礎(chǔ)[6]。Survivin拮抗肽是以純化的蛋白為釣餌合成的氨基酸序列，這種小分子多肽具有生物結(jié)構(gòu)簡單、易于合成、分子量小、工作濃度高、給藥途徑多樣化等優(yōu)點，且不良反應(yīng)較小，無免疫原性[7]，能夠促進U251細胞凋亡[2]。裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位移植模型能較好地模擬人類膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為,使用立體定向術(shù)接種膠質(zhì)瘤細胞于鼠尾狀核區(qū)域，能獲得較為滿意和穩(wěn)定可靠的動物模型，具備99%~100%的腦內(nèi)成瘤率，同時明顯減少了顱外生長等不穩(wěn)定因素的影響[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]，U251細胞接種10 d后有腫瘤形成，15 d后開始進入指數(shù)生長期，我們實驗中的治療自接種后10 d開始，保證了治療時間的合理性。

總之，Survivin拮抗肽能夠促進人膠質(zhì)瘤U251細胞裸鼠移植瘤的壞死，對其生長具有抑制效應(yīng)。該項研究進一步證實了Survivin拮抗肽有望成為具有抗腦膠質(zhì)瘤作用的理想候選藥物。

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(收稿2014-09-26)

·論著·

The effects of Survivin anti-peptide on the development of tumors transplanted by human glioma U251 cells in nude rats

ZhaoXiangdong,DouChangwu,WangXiaojuan,JiangNing

DepartmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the inhibiting effect of Survivin anti-peptide on nude rats with brain glioma.MethodsThe rat orthotopic model of U251 glioma was established through transplanting human glioma U251 cells cultured in vitro into caudate nucleus of nude rats by stereotactic technique. After 11 days, all nude rats were randomly divided into experimental group and control group, which were separately injected Survivin anti-peptide and normal saline via abdomen injection. After 30 days, we executed all of nude rats and made pathological sections and HE staining. Then the ratio of tumor necrotic area and tumor total area was calculated on the largest slice of tumor tissues by the analysis system of Olimpus CX41 microscope image.ResultsThe ratio of tumor necrotic area and tumor total area in experimental group was greater than that in control group (P<0.05).ConclusionThe Survivin anti-peptide have inhibitory effect on the development of tumors transplanted by human glioma U251 cells in nude rats.

【Key words】Glioma; U251 cells; Survivin anti-peptide; Nude rats; Inhibition

通訊作者：△竇長武，E-mail：douchangwu@sina.com

基金項目：內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(編號200408020902)；內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重大項目(編號200405)

【中圖分類號】R-332

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1573-5110(2015)18-0001-02