廣西肝癌高發(fā)區(qū)乙型肝炎病毒基本核心啟動(dòng)子區(qū)A1762T/G1764A雙突變對(duì)肝癌家族聚集的影響

石仁芳，吳繼周，萬(wàn)裴琦，吳健林，寧秋悅，龐 裕

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廣西肝癌高發(fā)區(qū)乙型肝炎病毒基本核心啟動(dòng)子區(qū)A1762T/G1764A雙突變對(duì)肝癌家族聚集的影響

石仁芳，吳繼周，萬(wàn)裴琦，吳健林，寧秋悅，龐 裕

目的 探討廣西肝癌高發(fā)區(qū)乙型肝炎病毒(HBV)基因組基本核心啟動(dòng)子(BCP)區(qū)A1762T/G1764A雙突變對(duì)肝癌家族聚集的影響。方法 收集2007年7月—2012年7月廣西肝癌高發(fā)區(qū)39個(gè)肝癌高發(fā)家族中103例成員作為試驗(yàn)組，在相同地區(qū)59個(gè)無(wú)癌家族中選擇與試驗(yàn)組年齡、性別、生活環(huán)境匹配的103例成員作為對(duì)照組，將試驗(yàn)組按家族患肝癌例數(shù)分為2～3例亞組(45例)和≥4例亞組(58例)；按親屬分級(jí)分為一級(jí)親屬組(48例)，二級(jí)親屬組(32例)，三級(jí)及以上親屬組(23例)。提取所有研究對(duì)象HBV DNA，PCR擴(kuò)增并測(cè)序檢測(cè)BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變情況。結(jié)果 試驗(yàn)組A1762T/G1764A雙突變率高于對(duì)照組 〔χ2=12.518，P<0.001；OR=2.788，95%CI(1.569，4.955)〕。試驗(yàn)組男性A1762T/G1764A雙突變率高于對(duì)照組 〔χ2=11.377，P=0.001；OR=3.450，95%CI(1.659，7.176)〕；兩組女性A1762T/G1764A雙突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔χ2=1.983，P=0.159；OR=1.950，95%CI(0.766,4.965)〕。試驗(yàn)組≥30歲年齡段A1762T/G1764A雙突變率高于對(duì)照組 〔χ2=10.743，P=0.001；OR=3.444，95%CI(1.622，7.314)〕；兩組<30歲年齡段A1762T/G1764A雙突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔χ2=2.489，P=0.115；OR=2.053，95%CI(0.836,5.041)〕。試驗(yàn)組患肝癌2～3例亞組與≥4例亞組A1762T/G1764A雙突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(χ2=6.639，P=0.01；OR=3.122,95%CI(1.290,7.555)〕。3組A1762T/G1764A雙突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。一級(jí)親屬亞組雙突變率高于二級(jí)親屬亞組(P<0.05)。試驗(yàn)組HBeAg陰性者突變率高于HBeAg陽(yáng)性者(χ2=6.361，P=0.012)。試驗(yàn)組A1762T/G1764A雙突變者HBV DNA水平低于無(wú)雙突變者(Z=-3.957，P<0.01)。結(jié)論 廣西肝癌高發(fā)區(qū)HBV BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變與肝癌家族聚集密切相關(guān)，A1762T/G1764A雙突變可能對(duì)肝癌的發(fā)生具有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值。

突變，基本核心啟動(dòng)子；肝腫瘤；乙型肝炎病毒；家族聚集

石仁芳，吳繼周，萬(wàn)裴琦，等.廣西肝癌高發(fā)區(qū)乙型肝炎病毒基本核心啟動(dòng)子區(qū)A1762T/G1764A雙突變對(duì)肝癌家族聚集的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(5)：530-534.[www.chinagp.net]

Shi RF,Wu JZ,Wan PQ,et al.Effect of double mutation of basal core promoter A1762T/G1764A of hepatitis B virus on familial aggregation of primary liver cancer in area of Guangxi with high primary liver cancer incidence[J].Chinese General Practice，2015，18(5)：530-534.

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)，其病死率在惡性腫瘤中居第2位，術(shù)后5 年復(fù)發(fā)率高達(dá)54.1%～61.5%[1]。而廣西是全國(guó)肝癌高發(fā)區(qū)，發(fā)生2例肝癌的家庭由33.9%增加至63.6%，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是肝癌發(fā)生的主要因素[2]。人體受HBV感染后臨床結(jié)局各異，是否發(fā)展為肝癌受病毒載量、宿主免疫及基因變異等因素影響。分子流行病學(xué)表明，HBV基因突變與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[3]。而基本核心啟動(dòng)子(basal core promoter,BCP)區(qū)中的A1762T/G1764A 雙突變是基因突變中最重要的熱點(diǎn)研究位點(diǎn)，其與家族性肝癌聚集的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。為此，本研究通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)及直接測(cè)序法重點(diǎn)對(duì)HBV BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變進(jìn)行檢測(cè)，探討該突變對(duì)廣西肝癌聚集發(fā)病的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2007年7月—2012年7月廣西肝癌高發(fā)區(qū)39個(gè)肝癌高發(fā)家族中103例成員作為試驗(yàn)組，其中男65例，女38例；平均年齡(32.7±12.1)歲；在相同地區(qū)59個(gè)無(wú)癌家族中選擇與試驗(yàn)組年齡、性別、生活環(huán)境匹配的103例成員作為對(duì)照組，其中男65例，女38例；平均年齡(32.8±12.7)歲。研究對(duì)象均為乙肝表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性并排除甲、丙、戊肝抗體陽(yáng)性。家族中曾發(fā)生過≥2例肝癌患者的視為肝癌高發(fā)家族，最早確診為肝癌者為先證者，診斷標(biāo)準(zhǔn)為《原發(fā)性肝癌臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[4]；家族中未曾發(fā)生惡性腫瘤的視為無(wú)癌對(duì)照家族。在高發(fā)家族中，個(gè)體成員與先證者遺傳物質(zhì)間經(jīng)歷一次減數(shù)分裂定義為一級(jí)親屬(如父母、同胞、子女)，個(gè)體與先證者遺傳物質(zhì)間經(jīng)歷二次減數(shù)分裂定義為二級(jí)親屬(如舅、姨、伯、叔等)；依次類推定義為三級(jí)及以上親屬[5]。將試驗(yàn)組按家族患肝癌例數(shù)分為2～3例亞組(45例)和≥4例亞組(58例)；按親屬分級(jí)分為一級(jí)親屬亞組(48例)，二級(jí)親屬亞組(32例)，三級(jí)及以上親屬亞組(23例)。所有研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 Thermo MDF-V4086S 超低溫冰箱；Thermo多用臺(tái)式離心機(jī)；HH-42數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱及IW-A微量振蕩器；ABI Veriti TM 多重控溫PCR儀；PJ23L-SC1微波爐及JA1003電子天平；DYY-6C電泳儀及DYCP-31DN電泳槽；血清病毒QIAamp MinElute Virus Spin DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)；PCR Premix Taq緩沖液、1 000 bp DNA Marker(對(duì)照)、RNase-Free水；瓊脂糖。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集、保存與處理 采集研究對(duì)象空腹靜脈血10 ml，靜置2 h后，以4 500 r/min離心10 min，離心半徑為6 cm，其中2 ml分離血清分裝保存于-80 ℃冰箱備用，其余血清送廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心檢測(cè)甲、丙、戊肝抗體及乙肝兩對(duì)半[HBsAg、乙肝表面抗體(HBsAb)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(HBeAb)、乙肝核心抗體(HBcAb)]和HBV DNA(檢測(cè)下限為500 copies/ml)、肝功能(膽紅素、血清蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)等。

1.3.2 DNA的提取 DNA的提取采用血清病毒QIAamp MinElute Virus Spin DNA提取試劑盒，按說明書嚴(yán)格操作，具體步驟如下：(1)吸取25 μl QIAGEN Protease至1.5 ml離心管中，加入200 μl血清樣品。(2)加入200 μl Buffer AL，震蕩15 s混勻，使樣品充分裂解。(3)56 ℃孵育15 min。(4)加入250 μl 96%乙醇，震蕩15 s混勻，室溫靜置5 min。(5)將裂解液轉(zhuǎn)移至2 ml收集管的柱膜上，8 000 r/min離心1 min，離心半徑為6 cm，棄濾液。(6)依次加入500 μl Buffer AW1、500 μl Buffer AW2、500 μl 96%乙醇，每次加入后均以8 000 r/min離心1 min，離心半徑為6 cm，棄濾液。(7)14 000 r/min離心3 min，離心半徑為6 cm，將濾膜風(fēng)干。(8)將柱子移至一新的1.5 ml離心管中，小心開蓋，加20～50 μl RNase-Free 水至濾膜中心。蓋上蓋室溫靜置5 min，14 000 r/min離心1 min，離心半徑為6 cm，所得洗脫液即為提取的HBV DNA，立即采用Nanodrop2000檢測(cè)DNA的純度。將提取的DNA置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 引物的制備 下載NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中HBV各基因型標(biāo)準(zhǔn)株序列，據(jù)BCP兩端保守區(qū)采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物：上游引物 5′-GACCTTGAGGCATACTTC- 3′，下游引物 5′-CAGAGCAGAGGCGGTGT- 3′，目的片段長(zhǎng)度為320 bp，由上海生工生物有限公司合成。

1.3.4 PCR反應(yīng)體系及條件 PCR反應(yīng)總體系為50 μl，包括：Premix Taq 25 μl、DN模板A 2 μl、上、下游引物各1 μl、RNase-Free水21 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃反應(yīng)35 s、55 ℃反應(yīng)45 s、72 ℃反應(yīng)60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃反應(yīng)7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，純化、測(cè)序(上海立菲生物技術(shù)有限公司)。

1.3.5 HBV DNA BCP區(qū)A1762T/G1764A 雙突變測(cè)定 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載25條基因型全序列(KC836881、JF436921、JF899335、KF495606、HQ638218、JQ040175、JQ732168、JN792903、HQ833471、FN594756、KF767452、KF356417、KF917517、JN406371、JX978431、JQ040126、JX560519、JF436923、JF899336、JN418567、KC875342、JX982167、HM214751、JX274019、JF290200)并參照廣西14條HBV標(biāo)準(zhǔn)株(KF373033～ KF373041、KF425553～KF425557)作為參考序列，采用DNAStar 、SeqMan及Chromas軟件與所測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)〔M(QR)〕表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；關(guān)聯(lián)強(qiáng)度分析采用OR值及95%CI表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR電泳及測(cè)序結(jié)果 研究對(duì)象均成功擴(kuò)增HBV BCP區(qū)基因，M泳道為Marker，1、2、3、4、5泳道為試驗(yàn)組PCR陽(yáng)性結(jié)果，6泳道為對(duì)照組PCR結(jié)果(見圖1)，A1762T/G1764A雙突變測(cè)序結(jié)果見圖2。

圖1 試驗(yàn)組與對(duì)照組PCR產(chǎn)物電泳圖

注：從左到右箭頭所示為nt1762 A→T和nt1764 G→A

圖2 A1762T/G1764A雙突變測(cè)序結(jié)果

Figure 2 Sequencing result of A1762T/G1764A double mutations

2.2 不同性別及年齡試驗(yàn)組與對(duì)照組中HBV BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變的比較 試驗(yàn)組A1762T/G1764A雙突變率高于對(duì)照組 〔70.9%(73/103)與46.6%(48/103)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔χ2=12.518，P<0.001；OR=2.788，95%CI(1.569，4.955)〕。試驗(yàn)組男性A1762T/G1764A雙突變率高于對(duì)照組〔72.3%(47/65)與43.1%(28/65)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔χ2=11.377，P=0.001；OR=3.450，95%CI(1.659，7.176)〕；兩組女性A1762T/G1764A雙突變率比較〔68.4%(26/38)與52.6%(20/38)〕，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔χ2=1.983，P=0.159；OR=1.950，95%CI(0.766,4.965)〕。試驗(yàn)組≥30歲年齡段A1762T/G1764A雙突變率高于對(duì)照組〔(74.6%，47/63)與(46.0%，29/63)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔χ2=10.743，P=0.001；OR=3.444，95%CI(1.622，7.314)〕；兩組<30歲年齡段A1762T/G1764A雙突變率比較〔65.0%(26/40)與47.5%(19/40)〕，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔χ2=2.489，P=0.115；OR=2.053，95%CI(0.836,5.041)〕。

2.3 試驗(yàn)組患肝癌不同例數(shù)亞組A1762T/G1764A雙突變率的比較 試驗(yàn)組家族患肝癌2～3例亞組與≥4例亞組A1762T/G1764A雙突變率比較〔57.8%(26/45)與81.0%(47/58)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔χ2=6.639，P=0.01；OR=3.122,95%CI(1.290,7.555)〕。

2.4 試驗(yàn)組各級(jí)親屬間A1762T/G1764A雙突變率比較 3組A1762T/G1764A雙突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.090,P<0.05)。一級(jí)親屬亞組雙突變率高于二級(jí)親屬亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 試驗(yàn)組各級(jí)親屬間A1762T/G1764A雙突變率比較〔n(%)〕

Table 1 Comparison of incidence rate of A1762T/G1764A double mutations among all level relatives in the experimental group

組別例數(shù)雙突變無(wú)雙突變一級(jí)親屬亞組4838(792)10(208)二級(jí)親屬亞組3217(531)?15(469)三級(jí)及以上親屬亞組2318(783)5(217)

注：與一級(jí)親屬亞組比較，*P<0.05

2.5 試驗(yàn)組A1762T/G1764A雙突變率與HBeAg狀態(tài)及HBV DNA 水平的關(guān)系 試驗(yàn)組HBeAg陰性者突變率(79.7%，51/64)高于HBeAg陽(yáng)性者(56.4%，22/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.361，P=0.012)。試驗(yàn)組A1762T/G1764A雙突變者HBV DNA水平為3.301(2.231)，低于無(wú)雙突變者6.011(3.577)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.957，P<0.01)。

3 討論

HBV屬嗜肝DNA病毒科，其基因組共有4個(gè)開放讀碼框(open reading frame，ORF)，分別為S、C、P和X區(qū)。其復(fù)制是以RNA為中間體進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的獨(dú)特過程，DNA聚合酶缺乏校正功能是其變異的分子基礎(chǔ)，HBV基因組每天約有107堿基對(duì)發(fā)生錯(cuò)配[6]。

HBV BCP區(qū)位于nt1742-1849，部分與X基因3′末端及前C區(qū)基因5′起始端重疊。BCP區(qū)上存在大量轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其對(duì)于前核心/核心mRNA(preC/C mRNA)和前基因組RNA(pgRNA)的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮重要作用。BCP區(qū)有多位點(diǎn)、多形式的變異，其中nt1762 A→T和nt1764 G→A最為常見，稱為A1762T/G1764A雙突變。A1762T/G1764A雙突變與肝癌的相關(guān)確切機(jī)制不明，推測(cè)可能與下列因素相關(guān)：(1)雙突變影響HBeAg的表達(dá)、病毒復(fù)制、抗原表位改變及免疫逃逸等；(2)雙突變使X基因編碼的第130位氨基酸由亮氨酸變?yōu)榈鞍彼?，?31位氨基酸由纈氨酸變?yōu)榱涟彼?，這種密碼子的改變可增強(qiáng)病毒DNA與肝細(xì)胞DNA的整合，激活原癌基因(c-myc和N-ras)，抑制抑癌基因(P16)發(fā)生克隆性增殖而癌變[7]。Qu等[8]通過募集2 387例男性HBV攜帶者進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)10年的隨訪研究，針對(duì)其中22例患者由攜帶者演變?yōu)楦伟┑目v向研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)A1762T/G1764A雙突變是肝癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Qin等[9]也發(fā)現(xiàn)，A1762T/G1764A有雙突變的肝癌患者死亡年齡較無(wú)突變者早。本研究顯示，A1762T/G1764A雙突變?cè)诟伟└甙l(fā)家族組的發(fā)生率高于對(duì)照家族，其發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)癌家族成員的2.788倍；進(jìn)一步顯示，肝癌高發(fā)家族中隨患肝癌例數(shù)的增加突變率也相應(yīng)地增加，≥4例亞組A1762T/G1764A雙突變率高于2～3例亞組，提示A1762T/G1764A雙突變與廣西肝癌家族聚集密切相關(guān)，檢測(cè)A1762T/G1764A雙突變有可能作為早期診斷及判斷預(yù)后的指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，肝癌高發(fā)家族中男性及30歲以上者A1762T/G1764A雙突變率也高于相應(yīng)的無(wú)癌家族成員，其OR值分別為3.450和3.444，表明A1762T/G1764A雙突變與性別及年齡分層有關(guān)，提示廣西肝癌高發(fā)區(qū)的肝癌家族聚集的高危人群主要集中在男性及30歲以上人群。肝癌好發(fā)于中年男性在流行病學(xué)上已得到公認(rèn)[10]。Park等[11]報(bào)道A1762T/G1764A雙突變主要集中在>40歲的人群。而鐘大妮等[12]通過對(duì)原籍為廣西地區(qū)人口的研究發(fā)現(xiàn)，HBV為C基因型的相關(guān)性肝病主要集中在25歲以后，而C基因型與肝癌的進(jìn)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示雙突變集中在30歲以上考慮可能與地域及本研究對(duì)象的HBV基因型以C基因型為主有關(guān)，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本及明確其基因型進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究還發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組中一級(jí)親屬A1762T/G1764A雙突變率高于二級(jí)親屬，提示血緣關(guān)系越近突變率越高，推測(cè)雙突變與肝癌高發(fā)的相關(guān)性可能與遺傳因素有關(guān)，其機(jī)制不明，目前國(guó)內(nèi)外尚未見類似報(bào)道，而二、三級(jí)親屬突變例數(shù)較少，有待更大樣本證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組中HBeAg陰性者A1762T/G1764A雙突變率高于HBeAg陽(yáng)性者，表明A1762T/G1764A雙突變與HBeAg的減少和消失有關(guān)。其機(jī)制可能為雙突變使BCP區(qū)上的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，即肝細(xì)胞核因子1(HNF-1)，HNF-1可選擇性抑制preC/C mRNA的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)HBeAg水平，使血清HBeAg減少或消失[13]。而雙突變影響HBeAg表達(dá)后是否繼而影響病毒復(fù)制水平，不同學(xué)者觀點(diǎn)不一。Ochwoto等[14]認(rèn)為突變可增加HBV的轉(zhuǎn)錄和包裝，提高HBV DNA水平。另有觀點(diǎn)認(rèn)為，HBV復(fù)制時(shí)HBeAg為非必需結(jié)構(gòu)蛋白，突變不影響HBV DNA水平[15]。而本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組中A1762T/G1764A雙突變者的HBV DNA水平低于無(wú)雙突變者，提示廣西肝癌高發(fā)區(qū)A1762T/G1764A雙突變可能不是通過影響HBV DNA復(fù)制水平升高的機(jī)制而導(dǎo)致肝癌家族聚集。在慢性HBV感染發(fā)展為肝癌的過程中，肝細(xì)胞基因和病毒基因整合導(dǎo)致病毒復(fù)制水平下降，使外周血HBV DNA水平降低[16]。

總之，檢測(cè)HBV BCP區(qū)A1762T/G1764A雙突變對(duì)廣西肝癌家族聚集的預(yù)測(cè)有重要臨床價(jià)值，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚，且本研究為回顧性研究，樣本量較少，有一定的局限性，因此其作用機(jī)制及與宿主的動(dòng)態(tài)相互作用還需擴(kuò)大樣本進(jìn)行前瞻性研究。

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(本文編輯：李婷婷)

Effect of Double Mutation of Basal Core Promoter A1762T/G1764A of Hepatitis B Virus on Familial Aggregation of Primary Liver Cancer in Area of Guangxi with High Primary Liver Cancer Incidence

SHIRen-fang,WUJi-zhou,WANPei-qi,etal.

DepartmentofInfectiousDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

Objective To investigate the effect of double mutation of basal core promoter(BCP) A1762T/G1764A of hepatitis B virus(HBV)genome on familial aggregation of primary liver cancer(PLC) in area of Guangxi with high PLC incidence.Methods 103 cases from 39 families with high PLC incidence in area of Guangxi with high PLC incidence were selected as experiment group from July 2007 to July 2012,and another 103 cases with matched age,sex and living environment from families without PLC history in the same area were selected as control group.Based on the number of PLC cases in the family,the experiment group was further divided into 2-3 cases subgroup(n=45) and ≥4 cases subgroup(n=58);based on the classification of relatives,the experiment group was divided into first-level relatives group(n=48),second-level relatives group(n=32) and third-level and ≥ relatives group(n=23).The HBV DNA of all the subjects was extracted,and polymerase chain reaction(PCR) was used to amplify and sequence as well as to detect the double mutation of BCP A1762T/G1764A.Results The experiment group had a significantly higher double mutation rate of A1762T/G1764A 〔χ2=12.518,P<0.001;OR=2.788,95%CI(1.569,4.955)〕.Compared with the males in the control group,the males in the experiment group had a significantly higher double mutation rate of A1762T/G1764A 〔χ2=11.377,P=0.001;OR=3.450,95%CI(1.659,7.176)〕,while the double mutation rate of females in the two groups showed no statistically significant differences 〔χ2=1.983,P=0.159;OR=1.950,95%CI(0.766,4.965)〕.Compared with the control group,the cases ≥30 years old had a significantly higher double mutation rate of A1762T/G1764A 〔χ2=10.743,P=0.001;OR=3.444,95%CI(1.622,7.314)〕,while the double mutation rate of the cases <30 years old in the two groups showed no statistically significant differences 〔χ2=2.489,P=0.115;OR=2.053,95%CI(0.836,5.041)〕.The 2-3 cases subgroup and ≥4 cases subgroup in the experiment group showed statistically significant differences in the double mutation rate of A1762T/G1764A 〔χ2=6.639,P=0.01;OR=3.122,95%CI(1.290,7.555)〕.The first-level relatives group,second-level relatives group and third-level and above relatives group also showed statistically significant differences in the double mutation rate of A1762T/G1764A(P<0.05),with the first-level relatives subgroup having significantly higher rate than the second-level relatives subgroup(P<0.05).The double mutation rate of the cases with negative HBeAg in the experiment group was significantly higher than that of the cases with positive HBeAg(χ2=6.361,P=0.012).The cases with double mutation of A1762T/G1764A had a significantly lower level of HBV DNA compared with the cases without double mutation(Z=-3.957,P<0.01).Conclusion The double mutation of BCP A1762T/G1764A of HBV in high PLC incidence area of Guangxi is significantly correlated with familial aggregation,and the double mutation of A1762T/G1764A may be of great significance for predicting the development of PLC.

Mutation，basal core promoter；Liver neoplasms；Hepatitis B virus；Familial aggregation

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30960170)；廣西教育廳重點(diǎn)課題基金(桂教201202ZD021)

530021 廣西南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科

吳繼周，530021 廣西南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科；E-mail：wjz925@163.com

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.05.011

2014-09-21；

2014-12-21)