胃癌中SEMA3B基因表達與其啟動子區(qū)甲基化的關系*

胃癌中SEMA3B基因表達與其啟動子區(qū)甲基化的關系*

肖坤庭#史冬濤虞竹雯田文妍陳衛(wèi)昌&

蘇州大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(215006)

*基金項目：江蘇省高校自然科學研究面上項目(14KJB320014)

#Email: 20124232017@suda.edu.cn

背景：SEMA3B為一候選腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。目的：初步探討DNA甲基化調(diào)控機制對胃癌中SEMA3B基因表達的影響。方法：以real-time PCR檢測6株人胃癌細胞株(SGC7901、AGS、MGC803、BGC823、MKN45、HGC27)、正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1和41例胃癌組織及其相應癌旁非癌組織中的SEMA3B mRNA表達。以甲基化特異性PCR檢測SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，并分析其與胃癌臨床病理特征的關系。以去甲基化藥物5-Aza-dC(10 μmol/L)處理上述細胞株72 h，觀察SEMA3B基因甲基化狀態(tài)和 mRNA表達變化。結果：6株胃癌細胞和胃癌組織中的SEMA3B mRNA表達分別顯著低于GES-1細胞(P<0.001)和相應癌旁非癌組織(P<0.01)。6株胃癌細胞SEMA3B基因啟動子區(qū)均發(fā)生甲基化，GES-1細胞則未發(fā)生甲基化。胃癌組織SEMA3B基因甲基化率顯著高于相應癌旁非癌組織(67.6%對32.4%，P<0.01)，甲基化狀態(tài)與胃癌分化程度和淋巴結轉移相關(P<0.05)。經(jīng)5-Aza-dC處理后，5株胃癌細胞SEMA3B基因甲基化程度下降，伴mRNA表達上調(diào)。結論：SEMA3B基因啟動子區(qū)高甲基化可能是其在胃癌中表達下調(diào)的原因之一，并參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。SEMA3B有望成為胃癌診斷和預后評估的分子標記物以及表觀遺傳學治療靶點。

關鍵詞胃腫瘤;基因，SEMA3B；基因，腫瘤抑制；DNA甲基化；基因表達調(diào)控

Gene Expression Regulation

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)胃癌病例近100萬例，其中約半數(shù)發(fā)生在東亞(主要是中國)[1]。胃癌的預后主要與其病理分期相關，早期胃癌經(jīng)治療后5年生存率大于90%，而進展期胃癌術后5年生存率僅為30%~40%[2]。然而由于早期胃癌缺乏特異性癥狀和體征，且我國胃鏡普查率不高，84%的胃癌患者確診時已屬進展期[3]。因此，尋找特異性較高的早期診斷標記物可能成為改善胃癌治療效果和預后的有效方法。抑癌基因SEMA3B(semaphorin 3B)定位于染色體3p21.3，研究[4-7]表明該基因在多種惡性腫瘤(成神經(jīng)細胞瘤、非小細胞肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膽管癌)中失活與其啟動子區(qū)高甲基化或等位基因丟失有關。葉春福等[8]的研究發(fā)現(xiàn)SEMA3B mRNA在胃癌組織中的表達顯著低于正常胃黏膜組織，但目前關于胃癌組織中SEMA3B基因表達下調(diào)機制的研究較少。本研究采用real-time PCR、甲基化特異性PCR(MSP)技術以及去甲基化藥物處理，旨在了解胃癌細胞和組織中SEMA3B基因表達與其啟動子區(qū)甲基化的關系，以明確DNA甲基化調(diào)控機制對胃癌中SEMA3B基因表達的影響。

材料與方法

一、細胞株、組織標本和主要試劑

6株人胃癌細胞株SGC7901、AGS、MGC803、BGC823、MKN45、HGC27和正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1均購自中國科學院上海細胞庫。

71例胃癌組織及其相應癌旁非癌組織(距癌灶邊緣5 cm以上)取自2002年-2006年于蘇州大學附屬第一醫(yī)院普外科行手術切除且經(jīng)術后病理確診的胃癌患者，其中男48例，女23例，年齡37~81歲，平均(61.3±9.8)歲。所有患者術前均未接受放、化療以及生物靶向治療，并排除合并其他腫瘤、胃息肉的患者。研究方案經(jīng)蘇州大學倫理委員會批準，入選患者均簽署知情同意書。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine, 5-Aza-dC)(Sigma-Aldrich Co.)，RNAiso Plus試劑、MightyAmp?DNA多聚酶(Takara Bio Company)，M-MLV First Strand Kit(InvitrogenTM，Thermo Fisher Scientific Inc.)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche Diagnostics)，DNA提取試劑盒、EpiTect Bisulfite DNA甲基化修飾和回收試劑盒(QIAGEN)。

二、方法

1. 胃癌細胞株培養(yǎng)：SGC7901、AGS、MGC803、BGC823、MKN45細胞傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，HGC27、GES-1細胞傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

2. 去甲基化處理：實驗組和對照組細胞分別以10 μmol/L 5-Aza-dC或10 μmol/L DMSO處理72 h，收集細胞，提取RNA和DNA，用于后續(xù)實驗。藥物濃度和處理時間根據(jù)前期實驗結果確定。

3. Real-time PCR：以RNAiso Plus試劑提取胃癌細胞、胃癌組織和癌旁非癌組織總RNA，以紫外分光光度法測定RNA濃度和純度，選取合格樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆?。以總RNA為模板逆轉錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。SEMA3B引物：F 5’-GCG TGG AGT GGA ACT TTC CAG-3’，R 5’- CAG CCT GCG CAG CAG TAG TC-3’；內(nèi)參照GAPDH引物：F 5’-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3’，R 5’-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3’。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火延伸30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算SEMA3B mRNA相對表達量。

4. MSP：以DNA提取試劑盒提取胃癌細胞、胃癌組織和癌旁非癌組織DNA，以紫外分光光度法測定DNA濃度和純度，選取合格樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?00 ng提取得到的DNA，以DNA甲基化修飾試劑盒修飾并純化，-20 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e取經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA 1 μL，以SEMA3B甲基化引物和非甲基化引物行PCR擴增。SEMA3B甲基化引物：F 5’-TGG TTA GGC GGG GTA TTT TC-3’，R 5’-TCA ACA ATA AAA ACG AAA ACG-3’，擴增片段長度133 bp；非甲基化引物：F 5’-GTG GTT AGG TGG GGT ATT TTT-3’，R 5’-ATC AAC AAT AAA AAC AAA AAC A-3’，擴增片段長度135 bp。反應條件：98 ℃預變性10 min；98 ℃變性30 s，甲基化引物58 ℃/非甲基化引物54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳(以ddH2O為陰性對照)，溴化乙錠染色，凝膠成像分析儀觀察并拍照。

三、統(tǒng)計學分析

結果

一、胃癌細胞和胃癌組織SEMA3B mRNA表達

Real-time PCR檢測結果顯示，正常胃黏膜上皮細胞株GES-1中的SEMA3B mRNA相對表達量顯著高于6株胃癌細胞，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖1)。在隨機選取的41例胃癌組織及其相應癌旁非癌組織中，70.7%(29/41)的胃癌組織SEMA3B mRNA相對表達量低于相應癌旁非癌組織，兩組SEMA3B mRNA相對表達量分別為0.009 0±0.000 9和0.013 5±0.001 2，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2)。

二、胃癌細胞和胃癌組織SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)

MSP檢測結果顯示，SGC7901細胞同時擴增出甲基化條帶和非甲基化條帶，其余5株胃癌細胞均只擴增出甲基化條帶，而正常胃黏膜上皮細胞株GES-1只擴增出非甲基化條帶(圖3)，表明6株胃癌細胞SEMA3B基因啟動子區(qū)均發(fā)生甲基化， 而GES-1細胞 SEMA3B基因未發(fā)生甲基化。71例胃癌組織中48例SEMA3B基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化，而71例癌旁非癌組織中僅23例發(fā)生甲基化(圖4)，胃癌組織甲基化率顯著高于相應癌旁非癌組織(67.6%對32.4%, χ2=17.61，P<0.01)。

***與GES-1細胞比較，P<0.001

圖1胃癌細胞株與正常胃黏膜上皮細胞株SEMA3B mRNA表達比較

**與癌旁非癌組織比較，P<0.01

圖2胃癌組織(T)與癌旁非癌組織(N)SEMA3B mRNA表達比較

三、胃癌組織SEMA3B基因甲基化狀態(tài)與腫瘤臨床病理特征的關系

M：甲基化；U：非甲基化

圖3胃癌細胞株與正常胃黏膜上皮細胞株SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)(MSP電泳圖)

分析顯示，胃癌組織SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與腫瘤分化程度和淋巴結轉移相關，低分化和有淋巴結轉移的胃癌組織SEMA3B基因甲基化率分別顯著高于高-中分化和無淋巴結轉移的胃癌組織(P<0.05)；SEMA3B基因甲基化狀態(tài)與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、TNM分期均無相關性(P>0.05)(表1)。

M：甲基化；U：非甲基化

表1胃癌組織SEMA3B基因甲基化狀態(tài)與腫瘤臨床病理特征的關系n(%)

臨床病理特征例數(shù)甲基化非甲基化χ2P值性別 男4833(68.8)15(31.2)0.09>0.05 女2315(65.2)8(34.8)年齡 <60歲2720(74.1)7(25.9)0.83>0.05 ≥60歲4428(63.6)16(36.4)腫瘤大小 <5cm1813(72.2)5(27.8)0.23>0.05 ≥5cm5335(66.0)18(34.0)分化程度 高-中分化4023(57.5)17(42.5)4.27<0.05 低分化3125(80.6)6(19.4)浸潤深度 T1/T24431(70.5)13(29.5)0.40>0.05 T3/T42717(63.0)10(37.0)淋巴結轉移 無2915(51.7)14(48.3)5.65<0.05 有4233(78.6)9(21.4)TNM分期 Ⅰ/Ⅱ4534(75.6)11(24.4)3.55>0.05 Ⅲ/Ⅳ2614(53.8)12(46.2)

四、去甲基化處理對SEMA3B基因甲基化狀態(tài)和mRNA表達的影響

7株細胞經(jīng)10 μmol/L 5-Aza-dC處理72 h后，MGC803細胞只擴增出甲基化條帶，其余5株胃癌細胞均同時擴增出甲基化和非甲基化條帶，而正常胃黏膜上皮細胞株GES-1只擴增出非甲基化條帶(圖5)；經(jīng)10 μmol/L DMSO處理的所有細胞株甲基化狀態(tài)均未發(fā)生改變。與經(jīng)DMSO處理的對照組相比，經(jīng)5-Aza-dC處理的實驗組GES-1、MGC803細胞SEMA3B mRNA表達無明顯變化，其余5株胃癌細胞SEMA3B mRNA表達均顯著上調(diào)(P<0.05)(圖6)。

M：甲基化；U：非甲基化

圖55-Aza-dC去甲基化處理對各細胞株SEMA3B基因甲基化狀態(tài)的影響(MSP電泳圖)

與相應對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖65-Aza-dC去甲基化處理對各細胞株SEMA3B mRNA表達的影響

討論

SEMA3B為一候選腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。SEMA3B mRNA長約3.4 kb，編碼由749個氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)。SEMA3s蛋白為信號素(semaphorins)家族成員，氨基端含有高度保守的SEMA結構域，可與多種細胞表面受體如神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilins)、叢狀蛋白(plexins)結合，參與神經(jīng)元軸突導向的負向調(diào)控，并對 腫瘤生長和血管形成發(fā)揮抑制作用(主要是SEMA3B、SEMA3F)[9-10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)SEMA3B與腫瘤細胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子165(VEGF165)存在共同的受體neuropilin-1，可通過與VEGF165競爭性結合neuropilin-1而拮抗其促腫瘤血管生成作用，從而抑制腫瘤生長；而VEGF165亦能拮抗SEMA3B誘導腫瘤細胞凋亡的作用。上調(diào)胰島素樣生長因子結合蛋白-6(IGFBP-6)表達亦為SEMA3B發(fā)揮腫瘤抑制 活性的機制之一，研究[12]顯示以siRNA沉默IGFBP-6可阻斷SEMA3B的腫瘤細胞生長抑制效應。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的SEMA3B mRNA表達顯著低于相應癌旁非癌組織，與葉春福等[8]的研究結果一致，并得到細胞學實驗結果支持，提示SEMA3B可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。MSP檢測結果顯示胃癌組織中的SEMA3B基因啟動子區(qū)甲基化率顯著高于相應癌旁非癌組織，相關性分析表明SEMA3B基因甲基化狀態(tài)與胃癌分化程度和淋巴結轉移相關，細胞學實驗結果亦顯示所檢測的6株胃癌細胞SEMA3B基因啟動子區(qū)均發(fā)生甲基化，其中5株為未分化-低分化腺癌細胞株，部分有淋巴結轉移特征，提示SEMA3B基因甲基化與胃癌分化程度和淋巴結轉移有關，有望成為胃癌診斷和預后評估的分子標記物。此外，本研究發(fā)現(xiàn)正常胃黏膜上皮細胞株GES-1的SEMA3B基因未發(fā)生甲基化，且SEMA3B mRNA表達顯著高于6株胃癌細胞，提示胃癌細胞和組織中的SEMA3B基因甲基化可能與SEMA3B mRNA表達下調(diào)有關。以去甲基化藥物5-Aza-dC處理各細胞株72 h，5株胃癌細胞擴增出SEMA3B非甲基化條帶并伴SEMA3B mRNA表達恢復，GES-1、MGC803細胞的SEMA3B基因甲基化狀態(tài)和mRNA表達則均未發(fā)生明顯變化，證實胃癌細胞中SEMA3B基因啟動子區(qū)CpG島甲基化是導致其mRNA表達下調(diào)的原因之一，SEMA3B是一個潛在的胃癌表觀遺傳學治療靶點。

綜上所述，SEMA3B基因啟動子區(qū)高甲基化可能是其在胃癌中表達下調(diào)的原因之一，并參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，但其在胃癌中的具體作用及其機制尚需深入研究加以闡明。SEMA3B在胃癌診斷和預后評估中的價值仍需更多大樣本臨床試驗驗證。

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(2015-01-20收稿；2015-03-02修回)

Relationship between SEMA3B Gene Expression and its Promoter Methylation in Gastric CancerXIAOKunting,SHIDongtao,YUZhuwen,TIANWenyan,CHENWeichang.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006)

Correspondence to: CHEN Weichang, Email: weichangchen@126.com

Background: SEMA3B is a candidate tumor suppressor gene, which plays an essential role in tumorigenesis and progression of a wide variety of cancer. Aims: To explore preliminarily the influence of DNA methylation on regulation of SEMA3B gene expression in gastric cancer. Methods: Real-time PCR was used to determine the expression of SEMA3B mRNA in six human gastric cancer cell lines (SGC7901, AGS, MGC803, BGC823, MKN45, and HGC27), one gastric epithelial cell line (GES-1), and 41 gastric cancer tissue and paired adjacent noncancerous tissue specimens. Methylation specific PCR was used to detect the promoter methylation of SEMA3B gene, and correlation between methylation of SEMA3B gene and clinicopathological characteristics of gastric cancer was analyzed. After treated with a demethylation agent, 5-Aza-dC (10 μmol/L), for 72 hours, the methylation and mRNA expression of SEMA3B gene were re-examined in above-mentioned cell lines. Results: SEMA3B mRNA expression was significantly lower in six gastric cancer cell lines and gastric cancer tissues than that in GES-1 cells (P<0.001) and paired adjacent noncancerous tissues (P<0.01). Promoter methylation of SEMA3B gene could be detected in all six gastric cancer cell lines but not GES-1 cells. Frequency of SEMA3B gene methylation was significantly higher in gastric cancer tissues than in paired adjacent noncancerous tissues (67.6%vs. 32.4%,P<0.01), and the frequency was correlated with differentiation and lymph node metastasis of gastric cancer (P<0.05). After treated with 5-Aza-dC, hypermethylation of SEMA3B gene in 5 gastric cancer cell lines was decreased, accompanied by up-regulation of SEMA3B mRNA expression. Conclusions: Hypermethylation in promoter of SEMA3B gene might be one of the mechanisms accounting for the reduced expression of SEMA3B, and being involved in tumorigenesis and progression of gastric cancer. SEMA3B might be a potential biomarker for diagnosis and prognostic assessment for gastric cancer and a promising epigenetic therapeutic target.

Key wordsStomach Neoplasms;Genes, SEMA3B;Genes, Tumor Suppressor;DNA Methylation;

通信作者&本文，Email: weichangchen@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.05.003