KDM1A對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

徐麗偉+丁杰

[摘要] 目的 在組織和細(xì)胞水平探討KDM1A的表達(dá)水平，并分析其對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。 方法 通過(guò)Western Blot技術(shù)檢測(cè)胃癌組織及胃癌細(xì)胞中KDM1A蛋白的表達(dá)；通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的侵襲性；利用RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞BGC823中KDM1A的表達(dá)。 結(jié)果 在胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中KDM1A蛋白質(zhì)表達(dá)升高；胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力與KDM1A 蛋白表達(dá)量之間均存在正相關(guān)關(guān)系；siRNA-KDM1A可在體外干擾胃癌細(xì)胞BGC823中KDM1A蛋白表達(dá)，并影響B(tài)GC823的侵襲轉(zhuǎn)移能力。 結(jié)論 KDM1A在胃癌組織及細(xì)胞中表達(dá)上升，在體外實(shí)驗(yàn)中抑制KDM1A表達(dá)，可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 胃腫瘤；KDM1A基因；侵襲轉(zhuǎn)移

[中圖分類(lèi)號(hào)] R273.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）23-0001-04

The impact of KDM1A on the invasion and metastasis of gastric cancer

XU Liwei1 DING Jie2

1.Department of Thoracicta Tumor Surgery， Tumor Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310022， China； 2.Department of Gastrointestinal Surgery， Guizhou People's Hospital， Guiyang 550002， China

[Abstract] Objective To explore the expression level of KDM1A in tissues and cell lines， and to analyze its impact on the invasion and metastasis of gastric cancer. Methods Used western blot to detect KDM1A protein expression in gastric cancer tissue and gastric cancer cell lines. Used transwell invasion assey to detect gastric cancer cell lines in vitro. Used RNA interference technique to silence KDM1A in gastric cancer cell line BGC823. Results There was higher KDM1A protein expression in gastric cancer tissues and cell lines. There was positive correlation between protein KDM1A expression and invasive and metastatic ability of gastric cancer cell lines. siRNA-KDM1A interfered BGC823 KDM1A protein expression in gastric cancer cells in vitro， and affected BGC823 ability of invasion and metastasis. Conclusion There is higher KDM1A expression in gastric cancer tissues and cell lines， and the decrease of KDM1A expression inhibits the invasion and metastasis in vitro.

[Key words] Gastric cancer； KDM1A genes； Invasion and metastasis

長(zhǎng)期以來(lái)，世界范圍內(nèi)，胃癌在腫瘤疾病中發(fā)病率居高不下，發(fā)病年齡主要集中于40～60歲，男女比例約為2∶1。胃癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是影響胃癌患者預(yù)后的主要因素之一，因胃癌早期自覺(jué)癥狀不易引起重視，而我國(guó)胃癌全民普查機(jī)制尚未完善，故此初診時(shí)部分患者病情已至進(jìn)展期。進(jìn)展期胃癌患者術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)可能性高，預(yù)后及生活質(zhì)量均不理想。因此眾多研究者將目光投向胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究，以期為胃癌的治療提供新思路、新方法，提高腫瘤患者的生存期。賴(lài)氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（KDM1A）位于人類(lèi)1號(hào)染色體短臂3區(qū)6帶12亞帶。KDM1A是第一個(gè)被定義的組蛋白特異性去甲基化酶，能夠特異性的去除組蛋白H3第4位及第9位賴(lài)氨酸的一甲基及二甲基化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[1]KDM1A在多種腫瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)升高，如前列腺癌[2-4]、乳腺癌[5-7]、膀胱癌[8，9]、結(jié)直腸癌[10]、肺癌[11]及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[12]。KDM1A可能參與多條信號(hào)通路，影響了腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)[4，13-15]。本實(shí)驗(yàn)將在組織及細(xì)胞水平探討KDM1A在的表達(dá)，并通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制KDM1A的表達(dá)，分析其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2012年6月～2013年1月于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院行手術(shù)切除的胃癌及癌旁標(biāo)本40對(duì)，液氮保存。通過(guò)電子病歷系統(tǒng)查詢(xún)患者性別、年齡、分期等情況。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行病理分期，患者術(shù)前未實(shí)施輔助化療，均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

胃癌細(xì)胞株AGS、SGC7901、BGC823及人胚胃上皮細(xì)胞GES1，均購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞研究中心。KDM1A單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcom公司，GAPDH單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)SANTACRUZ公司，總蛋白抽提試劑盒購(gòu)于美國(guó)ProMab公司，Western Blot試劑盒購(gòu)于東陽(yáng)紡生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) GES-1：培養(yǎng)條件：DMEM培養(yǎng)基，90%；胎牛血清，10%。氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃。AGS：培養(yǎng)條件： F-12培養(yǎng)基，90%；胎牛血清，10%。氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃。SGC-7901：培養(yǎng)條件：RPMI-1640培養(yǎng)基，90%；胎牛血清，10%。氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃。BGC-823：培養(yǎng)條件：RPMI-1640培養(yǎng)基，90%；胎牛血清，10%。氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃。

1.3.2 Western Blot實(shí)驗(yàn) 利用總蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA（bicinchonininc acid）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取40 μg蛋白上樣，200 V恒壓電泳，SDS-PAGE分離，300 mA恒流、4℃轉(zhuǎn)膜， 約70 min，5%PBS 37℃封閉2 h，分別加入兔抗人KDM1A單克隆抗體（1∶1 000）及鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（1∶800），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜5 min×3次，分別加入羊抗兔及羊抗鼠HRP單克隆抗體（1∶80 000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜5 min×3次，加底物，做化學(xué)發(fā)光，得到膠片。對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，每實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行樣本，計(jì)算均值及方差。

1.3.3 體外Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞侵襲性 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞包括三種胃癌細(xì)胞株（AGS、SGC7901、BGC823）及人胚胃上皮細(xì)胞株GES1。細(xì)胞懸液制備：以胰蛋白酶消化各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，以PBS漂洗3次，以各株細(xì)胞對(duì)應(yīng)的無(wú)血清培基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，約1×104個(gè)細(xì)胞/mL。細(xì)胞接種：Transwell上室接種制備好的細(xì)胞懸液約2 mL，Transwell下室加入以各株細(xì)胞對(duì)應(yīng)的含血清培基，以各株細(xì)胞對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)約24 h。細(xì)胞計(jì)數(shù)：除去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，酒精固定，蘇木素染色，倒置顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)組于倒置顯微鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野，計(jì)算均值及方差。

1.3.4 siRNA-KDM1A構(gòu)建 在GenBank中檢索人源KDM1A序列，KDM1A的基因信息為：NM_001009999.2，Homo sapiens lysine （K）-specific demethylase 1A （KDM1A），transcript variant 1， mRNA，并設(shè)計(jì)KDM1A mRNA 的siRNA：

正義鏈5-CCGGAUGACUUCUCAAGAATT-3，反義鏈5-UUCUUGAGAAGUCAUCCGGTT-3。

以上目標(biāo)序列由上海吉瑪制藥技術(shù)公司合成。同時(shí)合成陰性對(duì)照序列KDM1A negative control：正義鏈 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反義鏈5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。

1.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染（LipofectamineTM 2000） 細(xì)胞預(yù)處理： 將約1×105個(gè)細(xì)胞接種于0.5 mL去雙抗培養(yǎng)基，按培養(yǎng)條件，培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞密度，約為50%。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：分別用250 μL Opti-MEM稀釋siRNA-KDM1A、siRNA-NC及轉(zhuǎn)染試劑，而陰性對(duì)照組只以250 μL Opti-MEM稀釋轉(zhuǎn)染試劑，加入混合后室溫孵育約25 min，取混合物加入實(shí)驗(yàn)孔中，每孔100 μL。觀察計(jì)數(shù)：混勻后按培養(yǎng)條件，培養(yǎng)6 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用STATA/MP13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用t檢驗(yàn)對(duì)連續(xù)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間均數(shù)比較，F(xiàn)檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，Bonferroni方法進(jìn)行多組間兩兩比較，Spearman秩相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床病理特征

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本為40對(duì)胃癌及癌旁組織，來(lái)自隨機(jī)自愿參加實(shí)驗(yàn)的40例患者。40例患者包括男24例，女16例。年齡最大者為71歲，年齡最小者為37歲，平均（51.3±7.8）歲。根據(jù)UICC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（2010年第7版），Ⅰ期患者4例，Ⅱ期患者13例，Ⅲ期患者21例，Ⅳ期患者2例。

2.2 KDM1A 蛋白在胃癌及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量

以Western Blot方法檢測(cè)胃癌及癌旁組織中KDM1A的相對(duì)表達(dá)，經(jīng)t檢驗(yàn)，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=16.15，P<0.05），胃癌組織中KDM1A蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.67±0.18）高于癌旁組織（0.19±0.05）。見(jiàn)封三圖1A。

2.3 KDM1A蛋白在胃癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

以Western Blot方法檢測(cè)人胚胃上皮細(xì)胞株GES1及三種胃癌細(xì)胞株（AGS、SGC7901、BGC823）中KDM1A的相對(duì)表達(dá)。KDM1A 蛋白相對(duì)表達(dá)量在四種細(xì)胞中分別為：GES1：0.26±0.08；AGS：0.43±0.09；SGC7901：0.57±0.25；BGC823：0.86±0.12。經(jīng)F檢驗(yàn)，四組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.06，P<0.05）。見(jiàn)封三圖1B～C。

2.4 胃癌細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

以Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人胚胃上皮細(xì)胞株GES1及三種胃癌細(xì)胞株（AGS、SGC7901、BGC823）的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在每個(gè)隨機(jī)視野中，四株細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為GES1：26.0±2.0；AGS：43.2±2.5；SGC7901：81.4±5.6；BGC823：112.1±3.5。經(jīng)F檢驗(yàn)，四組穿膜細(xì)胞數(shù)不完全相等（F=331.91，P<0.05）。見(jiàn)封三圖1D。

2.5 KDM1A的表達(dá)與細(xì)胞侵襲性的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，在四株細(xì)胞中，穿膜細(xì)胞數(shù)與KDM1A蛋白表達(dá)量之間呈正相關(guān)（r=0.89，P<0.05）。

2.6 siRNA-KDM1A對(duì)胃癌細(xì)胞BGC823中KDM1A表達(dá)的影響

以Western Blot法檢測(cè)siRNA-KDM1A組、siRNA-NC組及陰性對(duì)照組中KDM1A蛋白質(zhì)表達(dá)。在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，KDM1A相對(duì)表達(dá)量分別為陰性對(duì)照組：0.71±0.17；siRNA-NC組：0.78±0.09；siRNA-KDM1A組：0.10±0.05。經(jīng)F檢驗(yàn)，三組之間KDM1A表達(dá)量不完全相等（F=31.88，P<0.05）。siRNA-KDM1A組表達(dá)量低于siRNA-NC組（t=-0.68，P<0.05）、陰性對(duì)照組（t=-0.60，P<0.05），而siRNA-NC組與陰性對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.07，P>0.05）。見(jiàn)封三圖1E。

2.7 siRNA-KDM1A對(duì)胃癌細(xì)胞BGC823侵襲性的影響

siRNA-KDM1A轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823后，使用Transwell方法檢測(cè)siRNA-KDM1A組、siRNA-NC組及陰性對(duì)照組中細(xì)胞的侵襲能力。在每個(gè)隨機(jī)視野中，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為陰性對(duì)照組118.6±4.0；siRNA-NC組：122.3±8.3；siRNA-KDM1：59.6±3.7。經(jīng)F檢驗(yàn)，三組之間穿膜細(xì)胞數(shù)目不完全相等（F=111.32，P<0.05）。siRNA-KDM1A組穿膜細(xì)胞數(shù)低于siRNA-NC組（t=-62.67，P<0.05）、陰性對(duì)照組（t=-59，P<0.05）；siRNA-NC組與陰性對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.67，P>0.05）。見(jiàn)封三圖1F。

3 討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，KDM1A蛋白相對(duì)表達(dá)量在胃癌組織中高于癌旁組織，體外實(shí)驗(yàn)也證明，胃癌細(xì)胞中KDM1A蛋白相對(duì)表達(dá)量也高于正常胃上皮細(xì)胞。同時(shí)，體外侵襲實(shí)驗(yàn)證明在胃癌細(xì)胞中KDM1A高表達(dá)預(yù)示著更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而利用RNA干擾技術(shù)抑制KDM1A表達(dá)后，胃癌細(xì)胞侵襲能力減弱。

既往的研究已證實(shí)，KDM1A在多種上皮來(lái)源腫瘤中高表達(dá)，這種表達(dá)增高預(yù)示著更差的預(yù)后生存期[21]。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是KDM1A參與多條信號(hào)通路，影響了腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)[4，13-15]。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特性之一，也是臨床腫瘤患者的主要死因。KDM1A表達(dá)增高使腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，具體作用機(jī)制是多樣的，主要通過(guò)與其他因子構(gòu)成復(fù)合體結(jié)合于基因啟動(dòng)子區(qū)，改變基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)而改變基因表達(dá)[7，13，16-19]。

KDM1A可與多種因子結(jié)合而調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，如Snai1[17]、Slug[18]、JARID1B/NuRD[16]等。Snai1指蛋白轉(zhuǎn)移因子家族在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中充當(dāng)了調(diào)節(jié)介質(zhì)的作用，Snai1能夠抑制上皮型蛋白表達(dá)（如E-鈣粘蛋白），從而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。Snai1可招募KDM1A于上皮表型基因啟動(dòng)子區(qū)。在侵襲性腫瘤細(xì)胞中KDM1A對(duì)Snai1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制及維持Snai1靶基因沉默狀態(tài)十分重要。若KDM1A表達(dá)沉默則Snai1無(wú)法抑制E-鈣粘蛋白表達(dá)。在E-鈣粘蛋白表達(dá)沉默的腫瘤細(xì)胞中，若KDM1A耗盡E-鈣粘蛋白啟動(dòng)子區(qū)H3K4me2水平上升，而且部分上皮型基因表達(dá)上升。這些可能表明KDM1A在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的腫瘤侵襲中發(fā)揮重要作用[17]。Slug亦可招募KDM1A于BRCA1基因啟動(dòng)子區(qū)E-boxes，而抑制BRCA1表達(dá)[18]。KDM1A可與JARID1B/NuRD形成復(fù)合體起到轉(zhuǎn)錄抑制的作用，全基因組轉(zhuǎn)錄分析證實(shí)上皮趨化因子CCL14[13]及TGFbeta1[16]信號(hào)通路均受到此復(fù)合體的調(diào)控。CCL14表達(dá)受到抑制后造成乳腺癌細(xì)胞血管生成及侵襲能力減弱，而TGFbeta1則與乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

此外，KDM1A可通過(guò)特異性去除p53第370位賴(lài)氨酸甲基抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]。同時(shí)可促進(jìn)BCL2及c-myc表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞分裂[20，21]。

因KDM1A中包含一個(gè)胺氧化酶（amine oxidase like，AOL）結(jié)構(gòu)域，故一些已合成的或已應(yīng)用于臨床的單胺氧化酶抑制劑可抑制KDM1A的催化活性，如丙炔甲基芐胺[9]、苯乙肼[22]、反苯環(huán)丙胺等[23]。而KDM1A被抑制后，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力降低，因此，有研究者認(rèn)為KDM1A擁有成為治療靶點(diǎn)的潛能。

本研究的局限在于僅選取了同一所臨床醫(yī)院、同一時(shí)期內(nèi)的40對(duì)臨床標(biāo)本，取樣范圍、時(shí)間較局限，總樣本量較少，可進(jìn)一步延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)跨度、擴(kuò)大樣本，明確KDM1A與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系。在體外實(shí)驗(yàn)中，僅對(duì)KDM1A表達(dá)量較高、侵襲性較強(qiáng)的胃癌細(xì)胞株BGC823進(jìn)行了RNA干擾實(shí)驗(yàn)，而針對(duì)其他多種胃癌細(xì)胞株的干擾實(shí)驗(yàn)可更全面地了解KDM1A對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

綜上所述，KDM1A在胃癌組織及細(xì)胞中表達(dá)上升，在體外實(shí)驗(yàn)中抑制KDM1A表達(dá)，可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。KDM1A有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2015-04-08）