PI3k/Akt蛋白及mRNA在60例胃癌中的表達(dá)及意義*

程 玉，李建玲，劉海旺，李春輝△

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.病理科；2.麻醉科，河北承德 067000)

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PI3k/Akt蛋白及mRNA在60例胃癌中的表達(dá)及意義*

程 玉1，李建玲2，劉海旺1，李春輝1△

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.病理科；2.麻醉科，河北承德 067000)

目的 探討磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)在胃癌組織及遠(yuǎn)端正常組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化S-P法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測60例胃癌組織和25例正常胃組織(距癌邊緣10 cm以上的胃組織)中PI3K、Akt蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果 PI3K、Akt在胃癌組織中的表達(dá)均明顯高于在遠(yuǎn)端正常胃組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，二者在胃癌組織中的表達(dá)均與胃癌的分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 PI3k/Akt蛋白及mRNA參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移，在胃癌的癌變過程中起著重要作用。

胃腫瘤；1-磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶；免疫組織化學(xué)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已成為腫瘤發(fā)病機(jī)制和靶向治療研究的熱點。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中都扮演著重要角色[1-2]。本研究利用免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)從蛋白和基因水平觀察PI3K、Akt在胃癌和遠(yuǎn)端正常組織中的表達(dá)，分析PI3K/Akt蛋白及mRNA與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，探討其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012年7月至2013年2月手術(shù)切除的胃癌組織60份(胃癌組)及距癌邊緣10 cm以上正常胃組織25份(對照組)，術(shù)前均未行化療、放療，所有病例經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實為胃腺癌，相應(yīng)癌旁組織均未見癌細(xì)胞累及。60例胃癌患者中，男45例、女15例；年齡45～77歲，中位50歲；高中分化者24例、低分化者36例，Ⅰ、Ⅱ期患者28例，Ⅲ、Ⅳ患者32例，癌組織穿透漿膜者48例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例。所有標(biāo)本離體后立即分為兩份，一份在離體后30 min內(nèi)儲存在-80 ℃冰箱里，另一部分離體后立即置于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人PI3K (P85α亞型)、Akt1/2濃縮型多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，工作濃度1∶100。RT-PCR試劑盒及DNA Marker購自寶生物工程有限公司(大連)，PCR引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司設(shè)計合成。P85α上游引物：5′-TGC TAT GCC TGC TCT GTA GTG GT-3′，下游引物：5′-GTG TGA CAT TGA GGG AGT CGT TG-3′，擴(kuò)增片段為175 bp；Akt上游引物：5′-GTG CTG GAG GAC AAT GAC TAC GG-3′，下游引物：5′-AGC AGC CCT GAA AGC AAG GA-3′，擴(kuò)增片段為194 bp；β-actin上游引物：5′-AGC GGG AAA TCG TGC GTG AC-3′，下游引物：5′-ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC-3′，擴(kuò)增片段為453 bp。

1.2.2 免疫組化檢測 采用S-P法，嚴(yán)格按照說明書實驗步驟進(jìn)行操作。最后組織切片用PBS替代PI3K、Akt作為陰性對照，用已知陽性切片做陽性對照。PI3K、Akt陽性染色呈黃色至棕黃色，主要定位于癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)。在染色均勻的區(qū)域，選取5個高倍鏡視野(×200)，(1)按陽性細(xì)胞百分率(A值)評分：1%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分；(2)按染色強(qiáng)度(B值)評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項得分相加小于或等于2分為陰性，>2分為陽性。

1.2.3 RT-PCR檢測 采用Triozol試劑盒分別提取胃癌及遠(yuǎn)端正常胃組織總RNA，分析其完整性、純度和濃度，并作RT-PCR檢測。PI3K的循環(huán)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。Akt的循環(huán)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。β-actin的循環(huán)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定性檢測，相應(yīng)位點出現(xiàn)單一電泳條帶為陽性表達(dá)。以β-actin做內(nèi)參照，電泳結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度測定。

2 結(jié) 果

2.1 兩組PI3K、Akt蛋白表達(dá)情況及二者的相關(guān)性PI3K蛋白在60份胃癌組織中，陽性表達(dá)52份(86.67%)，Akt蛋白在60份胃癌組織中，陽性表達(dá)43份(71.67%)；二者在25份正常組織中無表達(dá)或弱陽性表達(dá)，PI3K、Akt在胃癌組織中的陽性表達(dá)明顯高于在正常胃組織中表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。且二者的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.297，P<0.05)，見表1、2。

表1 PI3K和 Akt蛋白在兩組標(biāo)本組織中的表達(dá)

表2 在胃癌中PI3K和 Akt蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.2PI3K、Akt蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系PI3K、Akt蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別均無相關(guān)(P>0.05)，而與胃癌的分化程度、腫瘤分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均密切相關(guān)(P<0.05)，見表3、圖1。

表3 PI3K和 Akt蛋白表達(dá)與胃癌臨床特征的相關(guān)性

續(xù)表3 PI3K和Akt蛋白表達(dá)與胃癌臨床特征的相關(guān)性

2.3 兩組PI3K、AktmRNA表達(dá)比較 胃癌組織中PI3K與β-actin、Akt與β-actin的灰度值比顯著高于遠(yuǎn)端正常胃組織(圖2)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 兩組PI3K、Akt mRNA表達(dá)比較

2.4PI3K、AktmRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組織中PI3K、AktmRNA的表達(dá)與患者的年齡、性別均無相關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤的分化程度、腫瘤分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均密切相關(guān)(P<0.05)，見表5。

表5 PI3K、Akt mRNA的表達(dá)與胃癌

圖1PI3K及Akt蛋白在兩組標(biāo)本組織中的表達(dá) (×200)

M：標(biāo)記物；1:正常胃黏膜；2:高-中分化胃癌組織；3:低分化胃癌組織。

圖2PI3K、AktmRNA在兩組標(biāo)本中的表達(dá)

3 討 論

PI-3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條酪氨酸激酶級聯(lián)信號通路，其中PI3K是此信號通路的始動因子。Src、Ras、Rac、Abl、v-Crk等具有酪氨酸激酶活性的癌性蛋白可與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合而發(fā)生作用，這些癌性蛋白的異常活化可使PI3K持續(xù)活化,引致細(xì)胞形態(tài)改變、凋亡受阻，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化及過度增殖[3]。PI3K還可以將具有PH結(jié)構(gòu)域的信號分子Akt招募到質(zhì)膜上進(jìn)行活化，活化的Akt進(jìn)一步激活下游信號分子，對細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)控[4]。通過對底物的磷酸化，Akt可阻斷代謝抑制激酶如腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)的活性[5]，上調(diào)細(xì)胞的新陳代謝活性[6]；并且其還可使細(xì)胞周期激酶抑制劑p21、p27失活，從而促進(jìn)細(xì)胞生長、存活及腫瘤生成。本研究結(jié)果顯示，PI3K、Akt在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于在遠(yuǎn)端正常組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且隨著胃癌分化程度高→中→低變化，TNM分期Ⅰ、Ⅱ期→Ⅲ、Ⅳ期改變，PI3K、Akt陽性表達(dá)明顯增高，提示PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與胃癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。本實驗結(jié)果與Horiguchi等[7]的報道中提及的胃癌中Akt激酶活性增高的現(xiàn)象一致。Osaki等[8]發(fā)現(xiàn)，在在胃癌細(xì)胞系MKN-45中，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抵抗Fas調(diào)節(jié)的凋亡中起重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)Akt上游調(diào)節(jié)器肝細(xì)胞生長因子(HGF)及其受體c-Met高表達(dá)于胃癌中，c-Met小分子量抑制劑PHA-665752可減少Akt信號的激活，使胃癌異種移植模型中腫瘤細(xì)胞減少[9]。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可將有絲分裂信號傳遞給p70s6k，使細(xì)胞周期素(cyclin)、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶4(CDK4)等細(xì)胞周期主要蛋白的翻譯上調(diào)，同時抑制CDK4的表達(dá)，促進(jìn)G期進(jìn)展，使細(xì)胞周期加速，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。

本研究還發(fā)現(xiàn)隨著胃癌浸潤程度的增加，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的出現(xiàn)，PI3K、Akt的陽性表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移?；罨腜I3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9mRNA和蛋白的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，突破基底膜，促進(jìn)侵襲浸潤[11]。Akt能磷酸化GSK3β，拮抗β-CAT的降解，增高其濃度，從而下調(diào)E-鈣黏素表達(dá)最終減弱了細(xì)胞的黏附能力[12]?；罨腁kt還可以增加NF-KB的轉(zhuǎn)錄活性，增加腫瘤細(xì)胞的運動功能，有助于癌細(xì)胞侵襲。Akt還能上調(diào)胰腺癌細(xì)胞的胰島素樣生長因子受體(IGF-IR)，IGF-IR在許多惡性腫瘤中過表達(dá)并且與腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)[13-14]。

綜上所述，本實驗從基因和蛋白水平證實了PI3K、Akt在胃癌組織中高表達(dá)，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。進(jìn)一步擴(kuò)大研究對象并采用多種研究方法檢測PI3K、Akt與胃癌的臨床病理意義，可能為胃癌的早期診斷尋找到敏感標(biāo)志物并且為臨床治療提供新的靶點。

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Expression of PI3k/Akt protein and mRNA in 60 cases of gastric carcinoma and its significance*

ChengYu1,LiJianling2,LiuHaiwang1,LiChunhui1△

(1.DepartmentofPathology；2.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofChengdeMediecalCollege,Chengde,Hebei067000,China)

Objective To explore the expression of phosphoinositide 3 kinase (PI3K) and Akt in gastric carcinoma tissues and the distal normal tissues,and to analyze their correlation with the clinical pathologic characteristics of gastric cancer.Methods The S-P immunohistochemistry and RT-PCR were used to detect the expression of PI3K and Akt protein and mRNA in 60 cases of gastric carcinoma tissues and 25 cases of normal gastric mucosal tissues.Results The expression of PI3K and Akt in the gastric carcinoma tissues was significantly higher than that in the distal normal gastric tissues with statistical difference (P<0.05) and their expression in gastric carcinoma tissues was significantly related with the pathologic differentiation degree,TNM stage,invasion depth and lymph node metastasis (P<0.05).Conclusion PI3k/Akt protein and mRNA participate in the occurrence,development,infiltration and metastasis process of gastric cancer,and play an important role in the canceration of gastric carcinoma.

stomach neoplasms;1-phosphatidylinositol 3-kinase;protein-serine-threonine kinase;immunohistochemistry;reverse transcriptase polymerase chain reaction

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.10.020

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(ZL20140103)。 作者簡介：程玉(1988-)，在讀碩士研究生，主要從事胃癌的基礎(chǔ)與臨床研究?！?/p>

,Tel:15633142839;E-mail：chli612@126.com。

R735.2

A

1671-8348(2015)10-1352-03

2014-11-15

2014-12-10)