離體心肌細(xì)胞損傷模型研究進(jìn)展

趙 帥，李慶玲，韓 旭，劉小龍，王楚盈，李玉梅，張大方

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長(zhǎng)春130117)

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，心腦血管疾病已成為威脅人類生命健康的重要因素之一，其發(fā)病率仍在逐年攀升，病死率一直位居榜首。隨著科技的進(jìn)步，大量中外學(xué)者對(duì)心腦血管疾病的研究不斷細(xì)化、深入，由于體內(nèi)神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，在體模型很難準(zhǔn)確地反映出致病因素對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響。而體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)具有條件可控、樣本均一、費(fèi)用經(jīng)濟(jì)、便于觀察與記錄等優(yōu)勢(shì)［1］，近些年來常被用于藥物或因子對(duì)心肌細(xì)胞損傷的研究中，填補(bǔ)了在體模型的不足。因此，找到適用于實(shí)驗(yàn)的離體心肌細(xì)胞損傷模型至關(guān)重要?，F(xiàn)就離體心肌細(xì)胞損傷模型簡(jiǎn)要論述如下。

1 缺氧復(fù)氧損傷模型

心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型是目前離體心肌細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域應(yīng)用頻率最高的心肌細(xì)胞損傷模型之一。此模型適用于體外模擬臨床治療缺血性心肌病所導(dǎo)致的缺血再灌注的病理損傷。該模型的優(yōu)勢(shì)在于排除體內(nèi)其他因素干擾，可直觀的觀察條件或藥物對(duì)受損心肌細(xì)胞的形態(tài)、功能、代謝等的影響，更確切的推斷出藥物的作用機(jī)制，是篩選臨床抗心肌缺血再灌注損傷藥物的最佳模型。但值得注意的是，單純的缺氧損傷并不等同于臨床上心肌缺血再灌注損傷，還要配合缺糖模型，以模擬心肌缺血的狀態(tài)。目前制作缺氧復(fù)氧損傷模型分物理、化學(xué)兩類方法。

1.1 物理缺氧法 最常見的建立缺氧復(fù)氧模型的方法是由WEBESTER K W等［2］改進(jìn)而來的混合氣體培養(yǎng)法。這種方法用D-Hank's液取代培養(yǎng)液，并將細(xì)胞放于密閉容器內(nèi)通入含95%N2和5%CO2的混合氣體培養(yǎng)來建立缺氧環(huán)境，而后用含小牛血清的DMEM替換D-Hank's液，放回含5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)氧。李麗靜等［3］使用無菌自制密閉容器，用Earle's液替換培養(yǎng)液，通入95%N2與5%CO2混合氣體，經(jīng)2 h缺氧培養(yǎng)后復(fù)氧，并對(duì)細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率及Beclin-1蛋白表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，從而證明了參附湯血中移行成分對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。劉哲等［4］使用5%CO2加95%N2混合氣體與無血清低糖DMEM培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中模擬缺氧環(huán)境2 h，再于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液、5%CO2環(huán)境中復(fù)氧，用于研究西洋參皂苷對(duì)缺血再灌注損傷的影響。魏璨等［5］將高純度N2直接通入低糖DMEM培養(yǎng)液中達(dá)到飽和，再放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，復(fù)氧時(shí)直接將缺氧的培養(yǎng)液換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h即可。

另有研究者沿襲KOYAMA等［6］方法配制缺氧(缺血)液和復(fù)氧(再灌)液以建立缺氧復(fù)氧損傷模型［7］。薛 江 波［8］用 NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、Mg-SO4、HEPES、NaCl、KCl、乳酸鈉配制缺氧溶液以置換正常培養(yǎng)液，并于使用前通入N2飽和，從而模擬出缺氧環(huán)境。再用 NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgSO4、葡萄糖、HEPES制成復(fù)氧溶液，并預(yù)先用氧氣飽和，置換出缺氧溶液模擬出復(fù)氧環(huán)境。

液體石蠟覆蓋避氧法也是常見的建立細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的物理方法之一。其原理是利用液體石蠟強(qiáng)親脂性隔離細(xì)胞與氧氣，達(dá)到缺氧效果。吸出石蠟換上正常培養(yǎng)液培養(yǎng)即是復(fù)氧。該方法操作簡(jiǎn)單安全，但由于液體石蠟不易清洗，標(biāo)本顯微鏡下觀察易受到石蠟滴的影響［9］。

1.2 化學(xué)缺氧法 Na2S2O4、CoCl2及NaN3是常用化學(xué)制缺氧方法的試劑。其中Na2S2O4是一種耗氧劑，可以在不損傷細(xì)胞的情況下迅速清除培養(yǎng)基中的O2造成缺氧效果，若想復(fù)氧，移除現(xiàn)有培養(yǎng)基重新注入正常培養(yǎng)基即可。缺點(diǎn)在于不便于細(xì)胞指標(biāo)的檢測(cè)。CoCl2與NaN3則均通過影響與呼吸相關(guān)的酶來間接達(dá)到細(xì)胞缺氧的目的。由于CoCl2所致缺氧原理與臨床心肌缺血存在差異，因此僅應(yīng)用于研究心肌細(xì)胞缺氧狀態(tài)下細(xì)胞凋亡與保護(hù)的調(diào)控機(jī)制。NaN3可抑制細(xì)胞色素C氧化酶，阻礙呼吸鏈反應(yīng)，但很難恢復(fù)受損的細(xì)胞活性，適于研究缺氧刺激對(duì)心肌細(xì)胞的影響，但NaN3的較大毒性使其應(yīng)用受限［10］。

物理、化學(xué)兩類方法各有缺點(diǎn)，物理缺氧法雖較化學(xué)缺氧法省時(shí)，但難于控制實(shí)驗(yàn)條件、保持缺氧狀態(tài)的平衡與維持。化學(xué)缺氧法所用化學(xué)試劑的劑量及時(shí)間難以統(tǒng)一，還易受化學(xué)藥物不穩(wěn)定及濃度等因素影響。因此要根據(jù)具體情況選擇適合的造模方法。

2 H2O2損傷模型

H2O2心肌細(xì)胞損傷模型與心肌的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。H2O2是一種可以對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷的活性氧(ROS)自由基?；钚匝跏且活愒诩?xì)胞呼吸及代謝過程中產(chǎn)生的氧的單電子還原產(chǎn)物，一方面具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)等生理功能，另一方面過量的產(chǎn)生與堆積會(huì)引起生物大分子的過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的破壞，造成細(xì)胞壞死或凋亡等不可逆性細(xì)胞損傷。臨床上，心肌缺血過程中會(huì)發(fā)生復(fù)雜的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化是造成心肌損傷的啟動(dòng)因素［11］。因此，H2O2心肌細(xì)胞損傷模型常被用于模擬臨床心肌缺血再灌注損傷，或用于研究藥物的抗氧化作用。由此，也有研究者將此模型歸類為缺氧復(fù)氧損傷模型的化學(xué)方法。

H2O2心肌細(xì)胞損傷模型的優(yōu)勢(shì)在于誘導(dǎo)劑經(jīng)濟(jì)易得，操作簡(jiǎn)單;但H2O2化學(xué)性質(zhì)活潑，遇堿、遇強(qiáng)光易分解，不易保持模型的穩(wěn)定。楊翠等［12］用終濃度為100 μmol/L的H2O2建立大鼠乳鼠心肌細(xì)胞損傷模型，推斷出人參皂苷Rb1對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制可能與ERK信號(hào)通路的激活相關(guān)。楊萍等［13］以200 μmol/L 的 H2O2作用乳鼠心肌細(xì)胞 2 h造模，證實(shí)丹參酮ⅡA可通過增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶活力，抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

3 阿霉素?fù)p傷模型

阿霉素，又名多柔比星，是一種廣譜高效的抗腫瘤藥物。由于阿霉素對(duì)心肌的親和力遠(yuǎn)高于其他組織，因此用藥時(shí)會(huì)附帶如心律失常、心力衰竭等明顯的心臟毒副作用。對(duì)于阿霉素的致毒機(jī)制目前尚沒有形成統(tǒng)一的說法，而廣泛被人們所接受的是自由基理論。其對(duì)心肌細(xì)胞的損傷與臨床藥源性心肌壞死吻合，有別于正常心力衰竭等病癥所造成的損傷，因此建立阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型多適于研究探索既能不降低阿霉素抗腫瘤活性又能對(duì)臨床藥源性心肌細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用的藥物。代淵等［14］采用乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)法，通過MTT法對(duì)心肌細(xì)胞存活率、Western blot法對(duì)NF-κB p65和JNK磷酸化水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，知母寧具有抗阿霉素心肌毒性作用，并由此推斷其保護(hù)心肌細(xì)胞作用與抑制NF-κB和JNK通路的磷酸化水平具有一定的關(guān)聯(lián)性。陳莉莉等［15］用濃度為10 μmol/L阿霉素作用24 h建立心肌細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)人參皂苷 Rg3可降低 Fas及Bax/Bcl-2mRNA的表達(dá)，有利于拮抗化療藥物阿霉素所致大鼠乳鼠心肌細(xì)胞損傷。

4 烏頭堿損傷模型

烏頭堿是比較常見的建立心肌細(xì)胞心律失常損傷模型的誘導(dǎo)藥物，具有強(qiáng)心作用的同時(shí)也可導(dǎo)致心律失常，且有效劑量與中毒劑量相近。所以在使用烏頭堿治療疾病時(shí)常配伍其他藥物來減輕其毒性，由此可知，此模型更適用于篩選保護(hù)心肌的藥物與抗心律失常藥物。王茁伉等［16］研究發(fā)現(xiàn)，濃度為1 μmol/L與2 μmol/L的烏頭堿能明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Na+含量增加，1.5 μmol/L烏頭堿能明顯抑制細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活力，有降低細(xì)胞Ca2+-ATP酶活力的趨勢(shì)，從而驗(yàn)證了該模型與心律失常發(fā)生機(jī)制基本一致。王衍堂等［17］通過實(shí)驗(yàn)得出烏頭堿濃度＞1 μg/mL時(shí)心肌細(xì)胞的存活率顯著且隨濃度升高而降低，MDA含量隨劑量的增加而升高。董晞等［18］通過濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mmol/L 的梯度設(shè)計(jì)，篩選烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞作用最佳造模濃度，并驗(yàn)證出，甘草苷改善了烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞鉀、鈣離子通道編碼基因的異常表達(dá)，從而減輕烏頭堿的毒性作用。

5 AngⅡ損傷模型

AngⅡ具有生長(zhǎng)因子樣的作用，是RAAS系統(tǒng)中主要的生物活性物質(zhì)之一，被認(rèn)為是導(dǎo)致心肌重構(gòu)的關(guān)鍵因素。在生物體內(nèi)，腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)(RAAS)可通過AngⅡ與受體結(jié)合，多途徑促進(jìn)血管壁增厚、血管收縮、醛固酮分泌增加、水鈉潴留，誘導(dǎo)胚胎基因表達(dá)、心肌細(xì)胞肥大及心肌纖維化、成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致心臟重構(gòu)。目前AngⅡ與AT1受體結(jié)合模型已接近成熟，并被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)建立體外乳鼠心及細(xì)胞肥大模型。但AngⅡ價(jià)格略顯昂貴。楊雷［19］、毛秉豫［20］等通過光鏡下對(duì)細(xì)胞直徑的觀察，確立了濃度為10－6g/L的AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大模型的成立，并檢測(cè)了心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量與PKD1 mRNA的表達(dá)，得出結(jié)論，中藥提取物可通過下調(diào)PKD1 mRNA的表達(dá)而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。陳建康等［21］用濃度為10－6mol/L的AngⅡ造模，證明吡哆胺和替米沙坦均可改善氧化應(yīng)激，協(xié)同下調(diào)大鼠心肌細(xì)胞RAGE mRNA的表達(dá)，且吡哆胺較替米沙坦作用更強(qiáng)。

6 異丙腎上腺素?fù)p傷模型

近年研究表明，心臟局部的生物活性物質(zhì)如AngⅡ、兒茶酚胺類、胰島素樣生長(zhǎng)因子、一氧化氮等在心肌肥大的產(chǎn)生中扮演著重要的角色。異丙腎上腺素屬于人工合成的兒茶酚胺類藥物，可以促使心肌細(xì)胞鈣超載，心率收縮力增強(qiáng)，氧自由基損傷，導(dǎo)致心肌缺血。此模型表現(xiàn)與臨床擴(kuò)張型心肌病、缺血性心臟病相似，常被應(yīng)用于體內(nèi)或體外建立心肌細(xì)胞肥厚模型。

楊娟等［22］以10 μmol/L濃度的異丙腎上腺素建立出生乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型，通過RT-PCR法與Western blotting法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的抑制可能與TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。高杉等［23］通過實(shí)驗(yàn)證明，濃度為10－5mol/L的異丙腎上腺素能明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，并證明低聚葡萄籽原花青素可劑量依賴性地抑制該模型下的細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成，降低MDA含量，提高SOD活性，從而達(dá)到抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。

7 結(jié)語

離體心肌細(xì)胞培養(yǎng)能最大限度的克服實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異，并保留細(xì)胞完善的生理功能及電生理特性，排除了機(jī)體通過神經(jīng)體液及激素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，使細(xì)胞代謝相較于在體實(shí)驗(yàn)更加穩(wěn)定，但也造成其不能真實(shí)代表細(xì)胞來源的組織，是離體細(xì)胞培養(yǎng)的弊端所在。另外，離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)相較于在體實(shí)驗(yàn)成本低、周期短、操作簡(jiǎn)單，在藥物篩選、研發(fā)和機(jī)制研究中可以廣泛應(yīng)用。但任何一種模型都無法完全模擬出臨床上心血管疾病復(fù)雜的病理變化，因此研究者需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇致病機(jī)制相近的模型，并結(jié)合在體實(shí)驗(yàn)綜合分析才能得到更完善、真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

［1］司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.西安:世界圖書出版公司西安分公司，1996:1-2.

［2］WEBESTER K W，DISCHER D J，BISHOPRIC N H.Cardioproctection in invotro modei of hypoxic preconditioning［J］.Journal of Molecular and Cellular Cardiology，1995，27(1):453-457.

［3］李麗靜，劉佳，李玉梅，等.參附湯血中移行成分對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡和自噬的影響［J］.按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué):上旬刊，2012，3(8):29-31.

［4］劉哲，張峰，李麗陽，等.西洋參皂苷對(duì)缺血-再灌注誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡及鈣濃度的影響［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2014，27(5):661-663，670.

［5］魏璨，高君，陳愛東，等.多巴胺受體(DR2)激活對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29(4):289-293.

［6］KOYAMA T，TEMMA K，AKERA T，et al.Reperfusion-induced contracture develops with a decreasing［Ca2+］:in single heart cells［J］.The American Journal of Physiology，1991，261(4Pt2):1115-1122.

［7］關(guān)欣，李應(yīng)東.細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型建立方法的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(18):2737-2739.

［8］薛江波.氫氣對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響［D］.鄭州:鄭州大學(xué)，2009:8-9.

［9］阿邁·塔勒比，張永杰，陳西敬.心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型研究與應(yīng)用進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2011，12(3):120-122.

［10］何玲，孫桂波，陳榮昌，等.心肌細(xì)胞損傷模型的研究進(jìn)展［J］.中藥藥理與臨床，2010，26(6):81-84.

［11］潘蕓蕓.三七皂苷R1及Pim-2在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制研究［D］.廣州:南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

［12］楊翠，任建勛，吳紅金，等.人參皂苷Rb1經(jīng)ERK1/2對(duì)H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014，12(2):207-209.

［13］楊萍，李杰，周鳳華，等.丹參酮ⅡA對(duì)過氧化氫損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(1):3-5.

［14］代淵，胡勇，巨少華，等.知母寧對(duì)阿霉素致乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2014，20(2):180-182.

［15］陳莉莉，張晗，姜小慶，等.人參皂苷Rg3拮抗阿霉素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷作用機(jī)制研究［J］.南開大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，46(5):106-111.

［16］王茁伉，彭成，徐菲飛.烏頭堿致SD乳鼠心肌細(xì)胞心律失常模型的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25(3):751-753.

［17］王衍堂，李宏霞，張建軍，等.烏頭堿對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞的毒性作用［J］.華西藥學(xué)雜志，2007，22(1):4-6.

［18］董晞，趙世萍，劉巖，等.甘草苷對(duì)烏頭堿致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24(2):163-166.

［19］楊雷，毛秉豫，徐國(guó)昌，等.黃芪提取物對(duì)血管緊張素Ⅱ致培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24(4):769-771.

［20］毛秉豫，楊雷，徐國(guó)昌，等.丹參提取物對(duì)血管緊張素Ⅱ致培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(2):263-266.

［21］陳建康，朱鵬立，楊津，等.吡哆胺和替米沙坦對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，41(7):622-624，629.

［22］楊娟，王洪新，張英杰，等.黃芪甲苷對(duì)異丙腎上腺素致乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響及其機(jī)制［J］.中草藥，2013，44(21):3018-3023.

［23］高杉，黃春霞，黃玲玲，等.低聚葡萄籽原花青素對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17(5):497-501.