競(jìng)爭(zhēng)性ELISA、HPLC測(cè)定清燥救肺湯中甘草酸的含量

吳振起，王思源，平 靜，于 艷，南春紅

（1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，沈陽(yáng)110032；2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110032）

競(jìng)爭(zhēng)性ELISA、HPLC測(cè)定清燥救肺湯中甘草酸的含量

吳振起1，王思源1，平 靜1，于 艷2，南春紅1

（1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，沈陽(yáng)110032；2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110032）

目的 建立清燥救肺湯中甘草酸（GA）快速靈敏的免疫分析檢測(cè)方法。方法 以制備出的甘草酸特異性單克隆抗體為基礎(chǔ)，選擇單抗最佳工作濃度，建立GA間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法（ELISA），并應(yīng)用此方法檢測(cè)清燥救肺湯中的GA含量。同時(shí)結(jié)合高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行比較確證。結(jié)果 ELISA測(cè)定清燥救肺湯中成分GA在0.312 5～10 μg／mL（r＝0.996 9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率不低于92.5%；3批樣品中GA含量均值為10.125 mg／g，與HPLC測(cè)定結(jié)果相近，RSD＜1%。結(jié)論 ELISA對(duì)中藥成分測(cè)定準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，是HPLC測(cè)定有益的技術(shù)補(bǔ)充。

清燥救肺湯；甘草酸；ELISA；HPLC；含量測(cè)定

清燥救肺湯是治療燥熱傷肺的經(jīng)典名方，首見(jiàn)于《醫(yī)門(mén)法律》，為清代醫(yī)家喻嘉言創(chuàng)制，由桑葉、石膏、甘草等中藥組成。清燥救肺湯在臨床上廣泛應(yīng)用，然而目前尚缺乏質(zhì)量控制的方法。現(xiàn)代研究［1－2］表明，甘草酸（GA）具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫功能等作用，是清燥救肺湯中主要的活性成分之一，可作為其質(zhì)量控制、作用機(jī)制等研究的對(duì)象。目前，對(duì)于甘草酸的含量測(cè)定主要采用HPLC［3－4］、毛細(xì)管電泳法［5］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［6］等，尤以HPLC最為常用。中藥復(fù)方活性成分復(fù)雜，應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定活性成分存在前處理繁瑣、耗時(shí)等困難。隨著酶聯(lián)免疫分析法（Enzyme－Linked Immunosorbent Assay，ELISA）的發(fā)展，應(yīng)用ELISA可快速處理樣品、靈敏度高、對(duì)大量樣品可同時(shí)檢測(cè)［7］，在科學(xué)研究、生物制品生產(chǎn)中開(kāi)始被應(yīng)用［8］。因此本實(shí)驗(yàn)擬建立快速檢測(cè)甘草酸的ELISA方法，并進(jìn)行HPLC、ELISA同時(shí)測(cè)定清燥救肺湯中甘草酸含量的比較研究，進(jìn)一步對(duì)免疫分析技術(shù)在活性成分測(cè)定的可行和可信性進(jìn)行確證。

1 材料

清燥救肺湯中各飲片，購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；甘草酸對(duì)照品（批號(hào)110731－200614），由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；抗GA單克隆抗體（GAMAb）、GA－人工抗原（GA－HSA），由日本長(zhǎng)崎國(guó)際大學(xué)藥學(xué)院正山征洋教授惠贈(zèng)；標(biāo)記用羊抗鼠酶標(biāo)抗體（Pierce，美國(guó)）；ABTS顯色劑（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社）。磷酸鹽、甲醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純，96孔酶標(biāo)板（Corning，美國(guó)）。電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），酶標(biāo)儀（bio－rad，美國(guó)）。

2 方法

2.1 供試品的制備 清燥救肺湯（桑葉、枇杷葉、杏仁、麥冬、人參、甘草、胡麻仁等7味中藥飲片）經(jīng)70%乙醇提取，回收溶劑，減壓濃縮，阿膠烊化，石膏水提另煎，并與乙醇濃縮液合并，進(jìn)一步干燥得清燥救肺湯干粉。取本品粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲處理，每次15 min。以4 000 r／min離心10 min，取上清液；甲醇重復(fù)提取5次，合并所得溶液，氮?dú)獯蹈?。? mL甲醇溶解殘余物，測(cè)定前經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2.2 GA－MAb最佳工作濃度的確定 GA－MAb以TPBS分別稀釋為1∶1 000，1∶3 000，1∶6 000之后，于已預(yù)先包被并封閉好的酶標(biāo)板中，每孔加入100 μL。采用常規(guī)間接ELISA法測(cè)定。

2.3 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法的建立 采用碳酸緩沖液（50 mol／L）稀釋GA－HSA（1∶1 000），加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，37℃恒溫1 h，PBS清洗5次。封閉∶每孔加入300 μL封閉液，37℃孵育1 h，PBS清洗5次。加樣∶以10%甲醇分別將待測(cè)樣品與GA－MAb混合（1∶1），加入酶標(biāo)板的測(cè)定孔中；陽(yáng)性對(duì)照孔加入GA－MAb與10%甲醇的混合液（1∶1）；空白孔為100 μL 10%甲醇?；旌险袷? min，37℃培養(yǎng)箱中孵育l h。加酶標(biāo)二抗∶加入TPBS稀釋的二抗羊抗小鼠IgG（1∶1 000），每孔100 μL，溫育30 min，PBS清洗5次；顯色∶ABTS顯色20 min，450 nm處測(cè)定吸光度A值。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性試驗(yàn) 取不同質(zhì)量濃度（0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 μg／mL）的GA溶液，按照“2.3”項(xiàng)下測(cè)定。以GA質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的吸光度（A／A0）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1）。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取3個(gè)不同質(zhì)量濃度的GA對(duì)照品溶液（1、4、8 μg／mL），按照“2.3”項(xiàng)下測(cè)定，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。本實(shí)驗(yàn)連續(xù)測(cè)定3 d，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)定日內(nèi)精密度和日間精密度。

2.4.3 回收率試驗(yàn) 精密吸取甘草酸溶液（4 μg／mL）3分，分別加入等體積甘草酸對(duì)照品溶液（1、4、8 μg／mL），按照“2.3”項(xiàng)下測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次。

2.5 含量測(cè)定 ELISA分析方法∶將清燥救肺湯供試品稀釋成100、200、400、800、1 600倍。參照2.2方法，選定清燥救肺湯的最佳稀釋濃度為1∶800。將3批稀釋度為1∶800的供試品，參照“2.3”方法測(cè)定，計(jì)算GA平均值。

HPLC分析方法，色譜柱：PhenomsilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.1%磷酸水溶液（32∶68），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫∶30℃；進(jìn)樣量∶20 μL。

2.6 GA－Mab特異性的測(cè)定 將類似物（脫氧膽酸、甘草次酸3－O－β－D－葡萄糖醛酸、熊果酸、齊墩果酸），等比稀釋液替代甘草酸稀釋液，其他條件相同，測(cè)定其與GA－MAb之間的交叉反應(yīng)。以50%抑制的甘草酸濃度與50%抑制的類似物濃度的百分比為其交叉反應(yīng)率［8］，反應(yīng)抗單克隆抗體的特異性。交叉反應(yīng)率（%）＝（GA標(biāo)準(zhǔn)品的IC50／類似物IC50）×100%

3 結(jié)果

3.1 GA－MAb最佳工作濃度的確定 結(jié)果測(cè)得由3個(gè)Anti－GC MAb的A450值分別為1.358、0.887、0.443。有報(bào)道［9］，酶標(biāo)儀測(cè)定A值的敏感范圍在1.00左右，為保證測(cè)定結(jié)果靈敏可靠，抗體稀釋比可選擇1∶3 000。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 線性關(guān)系 實(shí)驗(yàn)顯示，采用對(duì)照品擬合出的GA ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），回歸方程為Y＝1.436 5－0.566 ln（X），r＝0.996 9。表明GA在0.312 5～10 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定不同濃度梯度的GA標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度（n ＝3）

3.2.2 精密度、回收率 對(duì)3次平行測(cè)定顯示，日內(nèi)精密度RSD為0.56%～1.25%，日間精密度RSD為0.78%～3.47%，見(jiàn)表1。GA的回收率結(jié)果表明低、中、高單個(gè)劑量的GA的加樣回收率不低于92.5%。以上驗(yàn)證結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)科學(xué)有效。

3.3 含量測(cè)定 清燥救肺湯進(jìn)行800倍稀釋后，競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸收值為0.493，計(jì)算甘草酸含量為6.315 μg／mL，則未稀釋原樣品中甘草酸含量為5.052 mg／mL，折合成生藥中含量為10.125 mg／g。HPLC條件，甘草酸與雜質(zhì)峰可完全分離，空白樣品無(wú)干擾（見(jiàn)圖2～圖3）。GA出峰時(shí)間約在24 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝700.589C＋0.756，r＝0.999 7。測(cè)定的平均含量為10.897 mg／g。2種方法比較，相對(duì)誤差為0.55%，結(jié)果差異小，可以互為比照、參考。含量見(jiàn)表2。

圖1 GA測(cè)定用的ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 清燥救肺湯中GA標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖（1∶GA）

圖3 清燥救肺湯樣品HPLC色譜圖（1∶GA）

表2 GA提取物的ELISA和HPLC檢測(cè)結(jié)果（n＝3）mg／g

3.4 GA－Mab特異性的測(cè)定 結(jié)果見(jiàn)表3。GA－MAb與甘草次酸有一定的交叉反應(yīng)，而與其他幾種化合物的交叉反應(yīng)極小，推測(cè)GA是由甘草次酸和兩分子的葡萄糖醛酸構(gòu)成的，屬于苷與苷元的關(guān)系，結(jié)構(gòu)比較相近。

表3 GA－MAb與GA 結(jié)構(gòu)類似化合物的交差反應(yīng)性

4 小結(jié)

目前對(duì)中藥的檢測(cè)大部分是通過(guò)色譜來(lái)分析，而免疫分析方法在中藥活性成分分析比較少見(jiàn)。免疫分析方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，已應(yīng)用到中藥活性成分的快速分析上［10］。

一般來(lái)說(shuō)，抗原與抗體間反應(yīng)具有高度特異，但某些競(jìng)爭(zhēng)物于抗原結(jié)構(gòu)相同或類似時(shí)，可能存在一定的交叉反應(yīng)，因此測(cè)定化合物抗體特異性具有一定意義。本研究顯示，GA單克隆抗體除了與GC存在一定的特異性反應(yīng)外，與其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)較小。這表明抗GA的單克隆抗體具有很強(qiáng)的特異性，避免了ELISA中假陽(yáng)性的存在。

除了抗體的因素外，免疫分析方法的建立還受抗體工作濃度等因素影響。本研究確定了GA－MAb稀釋比為1∶3 000，并對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法進(jìn)行考察。結(jié)果表明，該方法的日內(nèi)精密度差異0.56%～1.25%、日間精密度差異0.78%～3.47%、平均回收率不低于92.5%，均符合分析方法的要求。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)3批次清燥救肺湯中GA含量的ELISA和HPLC測(cè)定結(jié)果表明，樣品的檢測(cè)結(jié)果接近，說(shuō)明用ELISA測(cè)定GA的方法可行。與HPLC法相比，ELISA樣品前處理簡(jiǎn)單，不需大型儀器設(shè)備，檢測(cè)時(shí)間快。

綜上，清燥救肺湯中甘草酸的免疫分析方法的建立，為中藥中GA的質(zhì)量控制提供檢測(cè)依據(jù)，同時(shí)也可對(duì)其他中藥活性成分的分析提供思路。

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Competitive ELISA and HPLC in determination of glycyrrhizic acid in Qingzaojiufei decoction

WU Zhenqi1，WANG Siyuan1，PING Jing1，YU Yan2，Nan Chunhong1
（1．Department of Pediatrics，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2．Laboratory of Chinese Medicine，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）

Objective To establish an immunoassay method for the determination of glycyrrhizic acid（GA）in Qingzaojiufei Tang．Methods Indirect competitive ELISA was developed by using anti－GA monoclonal antibody（anti－GA MAb），and then it was applied to GA measurement in the traditional Chinese medicine Qingzaojiufei Tang．Simultaneously，using analysis method of HPLC confirm．Results GA had good linearity in the ranges of 0．312 5～10 μg／mL（r＝0．996 9），the average recoveries not less than 92．5%，respectively．The average content of GA in three sample was 10．125 mg／g by using ELISA．The RSD of GA determinations between ELISA and HPLC less than 1%，showed a high similarity．Conclusion The developed ELISA method is accurate with high repeatability，which is helpful to provides useful technical supplement for the determination of HPLC．

Qingzaojiufei decoction；glycyrrhizic acid；ELISA；HPLC；content determination

R284.2

A

2095－6258（2015）03－0478－04

??輯：張海洋

2014－11－17）

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．03．014

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81373687）；遼寧省教育廳優(yōu)秀人才基金（LJQ2011102）；沈陽(yáng)市科技基金（F11－264－1－62）。

吳振起（1974－），男，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥防治感染性疾病研究。