內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)睪丸扭轉(zhuǎn)后患側(cè)睪丸的影響

曹　樸，薛建新，張王山，賈瑞鵬

(1.東南大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，江蘇　南京　210003；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)泌尿外科，江蘇　南京　210006)

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內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)睪丸扭轉(zhuǎn)后患側(cè)睪丸的影響

曹樸1,2，薛建新1,2，張王山1，賈瑞鵬2

(1.東南大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京210003；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)泌尿外科，江蘇南京210006)

摘要：為了探討內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)移植對(duì)睪丸扭轉(zhuǎn)(TT)復(fù)位后患側(cè)睪丸的影響，獲取大鼠骨髓源性EPCs，進(jìn)行分組：對(duì)照組(sham組，左側(cè)睪丸不扭轉(zhuǎn))、缺血再灌注損傷組(IRI組，左側(cè)TT 720°2 h后復(fù)位。)、EPCs移植組(EPCs組，睪丸復(fù)位后經(jīng)股靜脈注射EPCs懸液)。術(shù)后5 d，左側(cè)睪丸稱重，冰凍切片技術(shù)檢測(cè)EPCs歸巢，HE染色檢測(cè)左側(cè)睪丸組織病理變化，Makler評(píng)分(TMS)評(píng)價(jià)睪丸生精功能。術(shù)后5 d，EPCs歸巢于左側(cè)睪丸。IRI組、EPCs組左側(cè)睪丸重量低于sham組(P<0.05)，EPCs組左側(cè)睪丸重量高于IRI組(P<0.05)。IRI組左側(cè)睪丸病理損傷嚴(yán)重，EPCs組左側(cè)睪丸病理損傷較IRI組減輕。IRI組、EPCs組TMS均低于sham組(P<0.05)，EPCs組TMS高于IRI組(P<0.05)。TT可致患側(cè)睪丸生精功能受損，EPCs移植可改善患側(cè)睪丸生精功能障礙。

關(guān)鍵詞：睪丸扭轉(zhuǎn)；再灌注損傷；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞移植

睪丸扭轉(zhuǎn)(testicular torsion，TT)為一種典型的缺血再灌注損傷(ischaemia-reperfusion injury，IRI)，可導(dǎo)致不同程度的生精功能障礙，是尚需解決的難題[1]216。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一種具有定向歸巢、增殖、分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞特性的多能干細(xì)胞，EPCs移植可改善腦、睪丸等組織IRI[2]，[3]2 137，[4]。目前，尚少見EPCs移植對(duì)TT復(fù)位后患側(cè)睪丸影響的報(bào)道。因此，本研究通過建立TT模型，進(jìn)行EPCs移植，觀察EPCs移植對(duì)TT復(fù)位后患側(cè)睪丸的影響。

1材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性SD大鼠購于南京軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重170~220 g，飼養(yǎng)于25 ℃室溫，自由進(jìn)食水。所用大鼠均由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)授權(quán)使用。EGM-2培養(yǎng)液購自美國Lonza公司。纖維連接蛋白購自美國Sigma公司。培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司。0.25%胰蛋白酶/EDTA購自美國Gibco公司?？笴D31抗體、抗CD34抗體購自武漢博士德有限公司。抗Ⅷ因子抗體購自英國Abcam公司。凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。氯胺酮注射液購自福建古田藥業(yè)有限公司。OCT冰凍切片包埋劑購自美國SAKURA公司。熒光顯微鏡購自日本 Olympus公司。冷電荷耦合設(shè)備(CCD)相機(jī)購自日本Olympus公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1) EPCs分離、培養(yǎng)、鑒定。SD大鼠處死后，獲取四肢長骨骨髓細(xì)胞，密度梯度離心法收集單個(gè)核細(xì)胞，使用EGM-2培養(yǎng)液培養(yǎng)。將培養(yǎng)10 d后的貼壁細(xì)胞，進(jìn)行CD31、CD34、Ⅷ因子免疫細(xì)胞化學(xué)染色[3]2 136。

2) TT模型的建立，分組。按Turner法進(jìn)行操作，在室溫25 ℃條件下，氯胺酮50 mg/kg腹腔麻醉大鼠，切開左側(cè)陰囊，游離出睪丸、附睪，切斷睪丸引帶，左側(cè)睪丸沿其長軸，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)720°，用無菌絲線將左側(cè)睪丸固定于陰囊內(nèi)2h，然后復(fù)位，縫合切口。Sham組(假手術(shù)組)：6只，左側(cè)睪丸不扭轉(zhuǎn)并固定陰囊內(nèi)2 h；IRI組(缺血再灌注組)：6只，左側(cè)睪丸順時(shí)針旋轉(zhuǎn)720°，2h后復(fù)位，立即經(jīng)大鼠股靜脈注射1 mL生理鹽水；EPCs組(細(xì)胞移植組)：6只，左側(cè)睪丸順時(shí)針旋轉(zhuǎn)720°，2h后復(fù)位。立即經(jīng)大鼠股靜脈注射加入1 mL EPCs懸液[5]62。

3) EPCs移植及示蹤。將培養(yǎng)10 d的貼壁EPCs濃度調(diào)整為1.0×106個(gè)/mL。TT復(fù)位后，經(jīng)股靜脈注入1 mL EPCs懸液。移植細(xì)胞示蹤：將Ad-eGFP轉(zhuǎn)染的 EPCs(Ad-eGFP EPCs)濃度調(diào)整為1.0×106個(gè)/mL， TT復(fù)位后經(jīng)股靜脈注入1 mL Ad-eGFP EPCs。5 d后處死大鼠，制作左側(cè)睪丸組織冰凍切片。在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)出綠色熒光者為Ad-eGFP EPCs。

4) 睪丸稱重。細(xì)胞移植術(shù)后5d，處死大鼠，留取左側(cè)睪丸組織。剝離睪丸周圍筋膜，生理鹽水沖洗，無菌紗布拭凈水分，微量天平稱重。睪丸重量可間接反映睪丸生精功能。

5) 睪丸組織病理學(xué)檢測(cè)。左側(cè)睪丸標(biāo)本固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備厚度為5 μm的薄片，行常規(guī)HE染色。

6) 睪丸組織Makler評(píng)分(testicular makler score， TMS)。每例標(biāo)本切片鏡下觀察10個(gè)曲細(xì)精管斷面，分別測(cè)定曲細(xì)精管內(nèi)徑D、管周膜厚度M、管壁生精細(xì)胞層數(shù)P、生殖細(xì)胞成熟程度S，每個(gè)項(xiàng)目按0~5分評(píng)分，滿分20分，然后計(jì)算平均得分，即為Makler評(píng)分。

2結(jié)果

2.1　EPCs歸巢

Ad-eGFP EPCs移植5d后，在熒光顯微鏡下可觀察到左側(cè)睪丸組織中出現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞(見圖1)，說明移植的EPCs可定向歸巢于左側(cè)睪丸組織[3]2 138。

2.2　左側(cè)睪丸重量比較

術(shù)后5 d，IRI組、EPCs組左側(cè)睪丸重量均低于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EPCs組左側(cè)睪丸重量高于IRI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)，表明TT復(fù)位可導(dǎo)致左側(cè)睪丸功能嚴(yán)重受損，EPCs移植可改善左側(cè)睪丸功能。

表1　術(shù)后5 d各組左側(cè)睪丸重量

注：*：與sham比較，P<0.05；#：與IRI組比較，P<0.05

2.3　左側(cè)睪丸組織病理學(xué)變化

sham組：生精小管結(jié)構(gòu)正常，生精上皮厚度正常，排列整齊，大量各級(jí)生精細(xì)胞形態(tài)正常(見圖2a)；IRI組：生精小管結(jié)構(gòu)紊亂，生精上皮層數(shù)少，各級(jí)生精細(xì)胞大量丟失，排列紊亂，生精細(xì)胞成熟障礙，可見炎性細(xì)胞浸潤(見圖2b)；EPCs組：睪丸組織生精上皮層較IRI組增厚，生精細(xì)胞增多(見圖2c)。

2.4　左側(cè)睪丸TMS

術(shù)后5 d，IRI組、EPCs組TMS 均低于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明IRI組、EPCs組左側(cè)睪丸均存在不同程度生精功能障礙。EPCs組TMS高于IRI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)，說明EPCs移植可減輕左側(cè)睪丸組織生精功能障礙。

表2　術(shù)后5 d左側(cè)睪丸各組 TMS 情況

注：*：與sham比較，P<0.05；#：與IRI組比較，P<0.05

3討論

3.1　EPCs特征及移植

1997年有學(xué)者[6]首次從人外周血中分離出EPCs，并證實(shí)其可促進(jìn)血管新生，成為血管新生研究的熱點(diǎn)。EPCs在機(jī)體刺激因子的作用下，動(dòng)員、歸巢、分化為內(nèi)皮細(xì)胞，通過自分泌/旁分泌機(jī)制，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括VEGF、bFGF、IGF等，可進(jìn)一步動(dòng)員EPCs歸巢至受損組織，共同調(diào)節(jié)微環(huán)境變化，改善機(jī)體缺血性病變[5]64，[7]。機(jī)體在病理狀態(tài)下，EPCs數(shù)量及質(zhì)量發(fā)生改變，難以滿足機(jī)體需要，進(jìn)行EPCs移植成為一種治療選擇。目前，EPCs移植治療缺血性心臟病、肢體缺血、腎臟IRI等疾病，已顯示良好的治療效果和應(yīng)用前景。

3.2　睪丸TT概述

TT是一種嚴(yán)重的外科急癥，多發(fā)生于青少年及新生兒[8]314。一旦確診，即使外科干預(yù)，睪丸功能仍可受損[9]427。TT為一種典型的IRI，其損傷程度取決于TT的時(shí)間和程度，可導(dǎo)致不同程度的生精功能障礙，包括生精細(xì)胞凋亡壞死、睪丸萎縮、精子質(zhì)量下降，甚至不育[1]216，[3]2 137，[8]316。

3.3　TT對(duì)患側(cè)睪丸的影響

犬TT 450°~540°可徹底阻斷睪丸動(dòng)脈血供。大鼠TT 720°維持1h，即可導(dǎo)致患側(cè)睪丸功能嚴(yán)重受損，并產(chǎn)生大量活性氧基團(tuán)(reactive oxygen species，ROS)，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[10-11]。TT 6h內(nèi)復(fù)位，為睪丸存活的臨界時(shí)間，否則睪丸存活機(jī)會(huì)顯著降低。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者將左側(cè)TT 720°維持2 h，左側(cè)睪丸出現(xiàn)嚴(yán)重病理損傷，包括：生精小管結(jié)構(gòu)紊亂、上皮厚度明顯變薄、各級(jí)生精細(xì)胞大量丟失、炎性細(xì)胞浸潤等。結(jié)果表明：通過TT 720°維持2h的方式建立TT復(fù)位模型可行，達(dá)到預(yù)期效果，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的結(jié)果類似。睪丸重量可間接反映睪丸生精功能，睪丸重量下降意味著生精功能受損。在本實(shí)驗(yàn)中，IRI組睪丸重量明顯低于sham組，表明單側(cè)TT復(fù)位可導(dǎo)致患側(cè)睪丸功能嚴(yán)重受損，可能與曲細(xì)精管內(nèi)徑縮小、生精細(xì)胞凋亡、生精細(xì)胞成熟障礙、睪丸纖維化萎縮等有關(guān)。EPCs組睪丸重量小于sham組(P<0.05)，高于IRI組(P<0.05)，說明EPCs移植可降低睪丸IRI，改善患側(cè)睪丸生精功能。

3.4　EPCs移植對(duì)患側(cè)睪丸功能的影響

學(xué)者對(duì)TT治療進(jìn)行了積極的探索，包括藥物、低溫、高壓氧等，顯示出一定的療效，但仍有許多問題尚未解決[13]。關(guān)于EPCs對(duì)睪丸IRI影響的報(bào)道較少。在前期研究中，筆者采用EPCs移植治療大鼠TT復(fù)位后生精功能障礙，通過TUNEL法檢測(cè)生精細(xì)胞凋亡，以此評(píng)價(jià)睪丸生精功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EPCs移植可顯著降低生精細(xì)胞凋亡，改善睪丸IRI，對(duì)患側(cè)睪丸生精功能產(chǎn)生保護(hù)作用[3]2 138。

TMS通過測(cè)量曲細(xì)精管內(nèi)徑、管周膜厚度、管壁生精細(xì)胞層數(shù)、生殖細(xì)胞成熟程度，可較直觀反映睪丸生精功能[14]。TMS越高，睪丸生精功能越好。在本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后5d，IRI組左側(cè)睪丸TMS顯著低于sham組，表現(xiàn)為睪丸曲細(xì)精管內(nèi)徑縮小，管壁生殖細(xì)胞層數(shù)減少，生殖細(xì)胞成熟障礙，說明TT復(fù)位可導(dǎo)致患側(cè)睪丸IRI。EPCs組TMS顯著高于IRI組(P<0.05)，表明EPCs移植可減輕患側(cè)睪丸組織病理損傷，改善生精功能障礙。通過TMS進(jìn)一步證實(shí)了筆者前期的研究結(jié)果[3]2 138。但EPCs對(duì)TT復(fù)位后生精功能的保護(hù)機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

單側(cè)TT 720°2 h后復(fù)位，可導(dǎo)致患側(cè)睪丸嚴(yán)重IRI。EPCs移植可改善患側(cè)睪丸生精功能障礙，并對(duì)生精功能產(chǎn)生保護(hù)作用。

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(責(zé)任編輯：何學(xué)華)

Effect of EPCs on Function of Ipsilateral Testes after Testicular Torsion

Cao Pu1,2,Xue Jian-xin1,2,Zhang Wang-shan1，Jia Rui-peng2

(1.Department of Urology, Second Affiliated Hospital of Southeast University, Nanjing Jiangsu 210003, China; 2.Department of Urology, Nanjing Medical University Affiliated Hospital of Nanjing(Nanjing First Hospital), Nanjing Jiangsu 210006, China)

Abstract:In order to investigate the effect of endothelial progenitor cells (EPCs) transplantation on function of ipsilateral testes after testicular torsion, bone-marrow-derived EPCs were obtained from rats. The rats were divided into 3 groups: control group (sham group, the left testes were not twisted), ischemia reperfusion injury group(IRI group, they were in detorsion after the left testes were twisted 720° for 2 h), endothelial progenitor cells transplantation group(EPCs group, EPCs suspension was injected into rats through the femoral vein after testicular detorsion). On the 5th day after operation, the rats' left testes were weighed, EPCs homing was detected by using the technique of frozen section. The pathological changes in the left testes were examined by HE staining technique. Spermatogenesis was evaluated by testicular Makler score(TMS). On the 5th day after operation, transplanted EPCs homed into the left testes. The left testicular weight in rats of the IRI group and EPCs group was significantly lower than that in the sham group(P<0.05). The left testicular weight in the EPCs group was higher than that in the IRI group, the difference was significant (P<0.05). The left testis underwent serious pathological changes in IRI group. Compared with IRI group, the impaired changes in the left testes from the EPCs group mitigated. TMS in the IRI group and EPCs group was significantly lower than that in the sham group(P<0.05). TMS in rats of EPCs group was higher than that in the IRI group(P<0.05). TT can impair spermatogenesis in twisted testis. EPCs transplantation is effective for improving the spermatogenic disfunction in twisted testes.

Key words:testicular torison; reperfusion injury; endothelial progenitor cells; cell transplantation

作者簡介：曹樸(1979-)，男，安徽長豐人，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：泌尿外科及男科學(xué)的基礎(chǔ)與臨床研究。

收稿日期：2014-06-04

中圖分類號(hào)：R691.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-1098(2015)04-0045-04