龍血竭總黃酮對(duì)新西蘭兔心肌缺血/再灌注損傷作用的研究

程初勇　潘小妮　劉文靜　黃照河

[摘要]目的研究龍血竭總黃酮對(duì)新西蘭兔心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。方法將30只新西蘭兔隨機(jī)分為三組，每組10只。采用結(jié)扎新西蘭兔左冠狀動(dòng)脈前降支法，建立心肌缺血/再灌注損傷模型。觀察心肌組織HE染色的結(jié)構(gòu)變化，測(cè)量左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax），檢測(cè)心肌肌酸激酶同工酶（CK-MB）。結(jié)果龍血竭處理組心肌組織結(jié)構(gòu)明顯好于缺血/再灌注組；缺血/再灌注組和龍血竭處理組+dp/dtmax均明顯低于假手術(shù)組（P<0.01），龍血竭處理組+dp/dtmax高于缺血/再灌注組（P<0.01）；缺血/再灌注組CK-MB水平明顯高于假手術(shù)組（P<0.01），龍血竭處理組CK-MB水平高于假手術(shù)組（P<0.05），并低于缺血/再灌注組（P<0.01）。結(jié)論龍血竭總黃酮能夠改善心肌缺血/再灌注損傷，保護(hù)心肌組織結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少心肌CK-MB漏出，提高缺血/再灌注損傷模型心肌的收縮功能。

[關(guān)鍵詞]缺血/再灌注損傷；龍血竭總黃酮；左心室內(nèi)壓最大上升速率；肌酸激酶同工酶

中圖分類號(hào)：R542.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-816X（2017）03-0203-03

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2017.03.15

據(jù)研究我國急性心肌梗死發(fā)生率2008年與2002年比較呈上升趨勢(shì)，冠心病死亡粗率城市地區(qū)上升2.40倍，農(nóng)村地區(qū)上升2.84倍，2008年冠心病死亡粗率城市居民為91.41/10萬，農(nóng)村居民為51.89/10萬。急性心肌梗死病死率升高的諸多因素中心功能不全是第一位危險(xiǎn)因素。即使冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建技術(shù)日益完善，而血管再通后的死亡總?cè)藬?shù)逐年升高，有必要找到新的治療方法，降低血管再通后的死亡率。中藥是我國長(zhǎng)期治病防病實(shí)踐過程中積累的寶貴財(cái)富，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。龍血竭是廣西傳統(tǒng)名貴壯藥，從百合科植物劍葉龍血樹的含脂木材提取得到的樹脂，其性溫、平，味甘，無毒。具有抗菌、抗痙攣、消炎及鎮(zhèn)痛等效果，還存在有抗糖尿病及抗腫瘤的活性，同時(shí)也具有增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)皮膚修復(fù)、止血及增強(qiáng)血液循環(huán)等功效。此次實(shí)驗(yàn)是通過新西蘭兔心肌缺血/再灌注模型，研究龍血竭總黃酮對(duì)新西蘭兔心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，為治療心肌缺血/再灌注損傷找到新的治療措施，降低心肌梗死的死亡率。

1材料和方法

1.1動(dòng)物：新西蘭兔，體重為2.0～3.0kg，雌雄不限。右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2012-0003。

1.2分組、造模：將30只新西蘭兔隨機(jī)分成三組：假手術(shù)組、缺血/再灌注組、龍血竭處理組，雌雄不限，每組10只。假手術(shù)組與缺血/再灌注組每天0.9%氯化鈉注射液5ml灌胃，龍血竭處理組用龍血竭總黃酮180mg/kg·d溶于5ml 0.9%氯化鈉注射液灌胃。手術(shù)前灌胃給藥，連續(xù)給予10天。手術(shù)前禁食12小時(shí)，按照1.0g/kg應(yīng)用20%氨基甲酸乙酯耳緣靜脈注射麻醉新西蘭兔，仰臥位固定手術(shù)臺(tái)上，四肢皮下連接ECG-6511型心電圖機(jī)（上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司），監(jiān)測(cè)動(dòng)物心電圖，剪去頸部毛發(fā)，切開皮膚，暴露氣管，行氣管插管，連接V-100型小型動(dòng)物呼吸機(jī)（上海玉研科學(xué)儀器有限公司X呼吸頻率：45～50次/分鐘，潮氣量16～20ml，呼吸比1：1）。參照Cheng文獻(xiàn)方法造模。造模過程中，Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背抬高，心肌組織變?yōu)榘导t色為造模成功。龍血竭總黃酮由桂林三金藥業(yè)藥品研究所提供，紅褐色粉末狀，應(yīng)用0.9%氯化鈉注射液作為溶劑。20%氨基甲酸乙酯（成都市科龍化工試劑廠），肌酸激酶同工酶（CK-MB）測(cè)定試劑盒（德賽診斷系統(tǒng)上海有限公司）。

1.3檢測(cè)指標(biāo)：測(cè)量新西蘭兔左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dP/dtmax），采取血液和心肌組織標(biāo)本所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在心肌再灌注2小時(shí)時(shí)，用15G注射針頭連接醫(yī)用動(dòng)脈測(cè)壓管，動(dòng)脈測(cè)壓管再連接到BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技公司），將注射針頭直接從心尖部插入左心室，測(cè)量左室內(nèi)壓，得到+do/dtmax。直接從右心房取5ml血液，離心得到血清，保存-20℃冰箱備用。將心臟分離出體外，選用顏色較深的左心室前壁心肌組織10%中性福爾馬林固定，以備HE常規(guī)染色。實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，利用日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清CK-MB。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，再兩兩比較用LSD方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1缺血/再灌注對(duì)新西蘭兔心肌組織的影響：假手術(shù)組：心肌組織HE染色濃淡均勻一致，細(xì)胞核清晰可見，心肌纖維結(jié)構(gòu)清楚，排列整齊有序（圖1A）；缺血/再灌注組：心肌組織HE染色程度濃淡不一，細(xì)胞核清晰度欠佳，心肌纖維排列紊亂，可見纖維斷裂現(xiàn)象，組織間紅細(xì)胞滲出（圖1B）；龍血竭處理組：心肌組織HE染色胞漿輕微濃染，心肌纖維較為清晰，結(jié)構(gòu)比較規(guī)則，細(xì)胞核染色均勻，組織間可見少量紅細(xì)胞滲出（圖1C）。

2.2龍血竭總黃酮對(duì)+dp/dtmax、心肌CK-MB水平的影響：與假手術(shù)組比較，缺血/再灌注組+dp/dtmax明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；龍血竭處理組+dp/&max比假手術(shù)組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；龍血竭處理組與缺血/再灌注組比較，龍血竭處理組+dp/dtmax明顯好于缺血/再灌注組（P<0.01）。假手術(shù)組檢測(cè)出心肌酶CK-MB，缺血/再灌注組與假手術(shù)組比較心肌酶CK-MB水平明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；龍血竭處理組比假手術(shù)組心肌酶CK-MB水平明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；龍血竭處理組與缺血/再灌注組比較，心肌酶CK-MB水平明顯比缺血/再灌注組降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3討論

心肌缺血/再灌注損傷作用機(jī)制復(fù)雜，涉及到很多生理病理過程：氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、心肌細(xì)胞凋亡、鈣超載、自噬、細(xì)胞浸潤(rùn)及血管內(nèi)皮功能障礙等。在Li等的研究中證實(shí)心肌缺血/再灌注后，心肌Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）和細(xì)胞核因子кB（nuclear factorкB，NF-кB）的表達(dá)均顯著增加，降低B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma2，Bcl-2）蛋白表達(dá)水平，并增加Bcl-2相關(guān)蛋白x（Bc1-2-associatedx，Bax）表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；而Yi掣的研究中證實(shí)，龍血竭增加Bcl-2表達(dá)，降低Bax蛋白表達(dá)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞，這種保護(hù)作用是通過抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/NF-кB/聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1/Bax[extracellular signalregulated kinase/NF-kB/poly（ADP-ri-bose）polymerase-1/Bax，ERK/NF-kB/PARP-1/Bax]信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，隨后抑制血管細(xì)胞黏附分子-1（vascularcell adhesion molecule 1，VCAM-1）的活化而實(shí)現(xiàn)的。龍血竭保護(hù)心肌的作用機(jī)制可能涉及多個(gè)方面，本實(shí)驗(yàn)從心肌組織HE染色可以看出，缺血/再灌注組心肌組織結(jié)構(gòu)損傷明顯，而應(yīng)用龍血竭總黃酮干預(yù)后，心肌組織結(jié)構(gòu)明顯好于缺血/再灌注組，由此證實(shí)在組織解剖層面上龍血竭總黃酮可以保護(hù)缺血/再灌注后的心肌組織。

糖尿病會(huì)損傷全身血管，并發(fā)心腦血管疾病，是冠心病的一個(gè)高危因素。糖尿病血管損害的病理機(jī)理與心肌缺血/再灌注損傷的病理機(jī)理有著許多共同的發(fā)病機(jī)制：氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞浸潤(rùn)及血管內(nèi)皮功能障礙等。其中糖尿病侵害皮膚血管，并發(fā)皮膚潰瘍，而龍血竭能夠促進(jìn)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合優(yōu)于胰島素對(duì)照組；還有研究證實(shí)，龍血竭含有的酚類化合物和生物堿類是傷口愈合時(shí)間縮短的主要成分。龍血竭總黃酮對(duì)大鼠、犬急性心肌缺血有較好的保護(hù)作用，對(duì)乳鼠心肌缺血/再灌注損傷也有顯著的保護(hù)作用。龍血通絡(luò)膠囊含有龍血竭成分，龍血通絡(luò)膠囊可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠的紅細(xì)胞可變形性、紅細(xì)胞滲透脆性，降低紅細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，從而改善高膽固醇血癥的微循環(huán)。既然龍血竭能夠治療糖尿病皮膚并發(fā)癥，對(duì)犬、大鼠、乳鼠的心肌缺血有著較好的保護(hù)作用，預(yù)示著龍血竭同樣可以治療心肌缺血/再灌注損傷時(shí)遭受損害的心肌收縮功能。+dp/dtmax是反映左心收縮功能比較穩(wěn)定的一個(gè)指標(biāo)，較少受到心臟前后負(fù)荷的影響。前述研究證實(shí)龍血竭可以抑制缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌組織結(jié)構(gòu)完整，降低血管通透性，減輕組織水腫，本實(shí)驗(yàn)龍血竭處理組+dp/dtmax明顯好于缺血/再灌注組，證實(shí)龍血竭總黃酮在心肌缺血/再灌注時(shí)具有保護(hù)左心室收縮功能的作用。

心肌CK-MB水平是診斷心肌梗死的酶學(xué)指標(biāo)之一，具有較強(qiáng)的特異性。此次實(shí)驗(yàn)，假手術(shù)組心肌CK-MB水平也有檢出，可能因?yàn)楣趋兰?chuàng)傷所致。實(shí)驗(yàn)中，缺血/再灌注組CK-MB水平升高最為明顯，而龍血竭處理組較假手術(shù)組CK-MB水平有顯著性升高，但比缺血/再灌注組低，由此得出龍血竭總黃酮可以降低新西蘭兔缺血/再灌注模型心肌CK-MB水平。

本研究表明，龍血竭總黃酮能夠改善心肌缺血/再灌注損傷，保護(hù)心肌組織結(jié)構(gòu)，保持細(xì)胞膜穩(wěn)定，減少心肌酶CK-MB漏出，提高耐受能力，從而保護(hù)心肌的收縮功能。本研究為治療心肌缺血/再灌注損傷提供了一個(gè)新的線索，但需進(jìn)一步深入研究其作用的分子機(jī)制。