遺傳病的生物治療

楊京，謝楊麗，陳林

遺傳病的發(fā)病率雖然較腫瘤等常見疾病低，但常導致患者死亡或發(fā)生畸、殘，影響正常生活和工作，給患者及家庭、社會帶來了沉重的經(jīng)濟、心理、醫(yī)療負擔。

絕大多數(shù)遺傳病的臨床治療以對癥處理為主，如針對骨骼畸形的手術(shù)矯形、針對凝血因子缺乏的補充治療等，往往只能暫時緩解機體的部分異常功能。大部分表型不能被糾正，甚至可能會危及患者生命。隨著生命醫(yī)學科學的發(fā)展，更多的遺傳病的致病基因被克隆、鑒定，相關(guān)分子致病機制得到更深入闡明，在此基礎(chǔ)上RNAi、基因組編輯技術(shù)、融合蛋白、多肽等直接靶向致病基因或其相關(guān)信號通路、分子的生物學技術(shù)被應(yīng)用于遺傳病的治療并取得了一定的療效。雖然這些研究大多局限于細胞、動物實驗，但已有少數(shù)生物學治療措施已經(jīng)進入Ⅰ期臨床試驗，這讓我們看到了成功治愈遺傳病的曙光。

1 遺傳病概述

遺傳病是指由于遺傳物質(zhì)發(fā)生改變所導致的一類疾病，主要有以下幾類。

染色體病：由于整條或部分染色體增加、移位或缺失所致。多表現(xiàn)為生長遲緩、智力低下及各種身體異常。大多數(shù)染色體疾病發(fā)生在出生前，幾乎占自然流產(chǎn)的50%。

多基因病：由多個基因交互作用所致，可能某一些基因也起主要作用，但多為微效作用。環(huán)境因素也是多基因病的重要影響因素。如糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、唇裂、一些先天性心臟病等。

單基因?。河蓡蝹€基因突變所致。以常染色體及伴性的X、Y連鎖方式遺傳，有顯性、隱性遺傳之分。多于胚胎發(fā)育期、新生兒和幼兒階段即發(fā)病。這也是本文介紹的主要類型。

線粒體基因?。翰煌谏鲜龊嘶蚪M，是由于線粒體基因組發(fā)生突變所導致的一類疾病，呈母系遺傳。多為神經(jīng)-肌肉系統(tǒng)病變，如 Leber遺傳性視神經(jīng)病、線粒體心肌病等。

2 遺傳病的診斷

準確診斷遺傳病是開展遺傳咨詢和防治工作的基礎(chǔ)，主要分為臨床診斷和分子診斷。前者同普通疾病類似，主要通過分析病史、癥狀、體征和輔助檢查結(jié)果確立診斷，也是目前臨床中主要應(yīng)用的方法。此外，通過分析先證者家庭成員發(fā)病情況的系譜分析法有助于明確遺傳病的遺傳方式，如是常染色體遺傳病或性染色體遺傳??；也可區(qū)分表型相似的，或由于遺傳性而表現(xiàn)為不同遺傳方式的遺傳病。

染色體檢查 (核型分析) 和性染色質(zhì)檢查是確診染色體病的主要方法。分子診斷則是從遺傳分子水平確診單基因遺傳病。隨著分子生物學的進展，對人類基因組的認識不斷加深，以及基因檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，目前可利用特異性寡核苷酸探針雜交、PCR相關(guān)技術(shù)、DNA測序等基因分型技術(shù)檢測DNA結(jié)構(gòu)變化，實時定量PCR法、基因芯片、蛋白芯片檢測基因表達變化。對于已知致病基因者且明確該基因的序列和結(jié)構(gòu)可直接檢測突變。對于未知致病基因或未知突變情況者可通過對先證者及其家系進行連鎖分析。

3 遺傳病常規(guī)治療

胚胎植入前遺傳學診斷 (Preimplantation genetic diagnosis, PGD)、產(chǎn)前診斷等可預(yù)防遺傳病胎兒出生，也可因此讓患兒在出生前得到手術(shù)、藥物等治療來緩解表型。目前對于出生后的遺傳病患者臨床治療措施有限，主要是預(yù)防或處理已經(jīng)出現(xiàn)的異常表型以及對癥治療。

3.1 手術(shù)治療

對于局限于某一器官的病灶可以手術(shù)切除。如家族性結(jié)腸腺瘤樣息肉 (Familial adenomatous polyposis, FAP) 結(jié)合家族史，早期行全結(jié)腸切除術(shù)可提高患者預(yù)后。脾切除可緩解球形紅細胞增多癥的溶血性貧血。

手術(shù)矯形可修復(fù)/改善病變器官畸形、恢復(fù)器官功能、提高患者的生活質(zhì)量。如肢體延長術(shù)用于矯正軟骨發(fā)育不全 (Achondroplasia，Ach) 患者的侏儒表型；顱縫松解術(shù)可增加囟門早閉患者腦腔容積，在一定程度上改善大腦發(fā)育及顱面畸形。

器官移植術(shù)加以抗免疫排斥反應(yīng)治療對于少數(shù)遺傳病有較好的臨床療效，如腎移植治療家族性多囊腎、角膜移植治療遺傳性角膜萎縮癥等。

3.2 藥物治療

3.2.1 去除多余物質(zhì)

利用藥物可通過排泄堆積的代謝產(chǎn)物或抑制其生成治療酶促反應(yīng)異常的遺傳病。如青酶胺螯合銅離子可防止 Wilson病患者銅代謝障礙、銅離子沉積所致的肝硬化、腎功能損害等多種癥狀。

3.2.2 替代、補充療法

對一些遺傳病，主要是酶相關(guān)遺傳病，給予缺乏物質(zhì)可以顯著緩解表型或防止表型發(fā)生。如低磷酸酯酶癥 (Hypophosphatasia)，其多為功能缺失型組織非特異性堿性磷酸酶 (Tissuenonspecific isozyme of alkaline phosphatase,TNAP) 基因突變，血清ALP活性降低，患者骨礦化受損，出現(xiàn)骨軟化或佝僂病。骨靶向性的人重組組織非特異性ALP酶ENB-0040替代治療可明顯緩解患者的上述異常骨表型，并改善胸廓變形所致的呼吸功能障礙[1]。需要注意的是替代、補充治療通常需要終生服藥。

3.2.3 對癥治療

針對遺傳病出現(xiàn)的表型或并發(fā)癥進行藥物治療，通常療效有限。但也有一些對癥治療可以在一定程度上緩解部分遺傳病表型。成骨不全(Osteogenesis imperfecta, OI) 是一組臨床脆性骨折和牙本質(zhì)發(fā)育不全的結(jié)締組織病，是兒童脆性骨折發(fā)生的主要病因。90%存在 COL1A1、COL1A2基因突變所致的Ⅰ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)及功能異常。傳統(tǒng)臨床干預(yù)手段主要是手術(shù)處理骨折，但其療效不佳。近年來，有部分臨床試驗發(fā)現(xiàn)利用雙膦酸鹽 (如帕米膦酸、奈利膦酸等) 糾正其高骨轉(zhuǎn)換 (Bone turnover) 可增加患兒骨密度并降低骨折風險[2]。

3.3 飲食療法

限制特定營養(yǎng)物質(zhì)攝入或吸收以減少代謝產(chǎn)物生成可治療部分代謝性遺傳病。如低苯丙氨酸飲食可防止苯丙酮尿癥患兒出現(xiàn)智力低下等癥狀。

4 遺傳病的生物學治療

4.1 針對致病基因

糾正突變的致病基因是治療遺傳病的根本。目前已有多種靶向致病基因或其相關(guān)信號通路、分子的生物學措施可應(yīng)用于遺傳病的治療。

4.1.1 靶向致病基因DNA

基因組定向編輯技術(shù)是近年來的研究熱點，目前已可在幾乎所有物種中實現(xiàn)精確到核苷酸水平的定向修飾。通過引入正常的等位基因來糾正突變的基因缺失、敲低突變等位基因mRNA，基因組編輯為完全治愈遺傳病帶來了更大的可能性。

鋅指核酸酶 (Zinc-finger nucleases, ZFNs)是最早研發(fā)出來的基因組定向編輯方法。其原理是利用鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok Ⅰ融合，不同的鋅指DNA結(jié)合域集成DNA剪切區(qū)可定向特定DNA鋅指結(jié)構(gòu)域并激活內(nèi)源性DNA修復(fù)。2005年 Urnov等首次在體外人體細胞中利用ZFNs糾正了 X連鎖重度聯(lián)合免疫缺陷病(X-linked severe combined immune deficiency,SCID) 突變的IL2Rγ基因[3]。隨后ZFNs也成功應(yīng)用于動物模型，如有效糾正血友病 B模型小鼠凝血時間延長[4]。轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases,TALENs) 同樣利用核酸內(nèi)切酶 FokⅠ剪切DNA，靶向DNA的 (Repeat variable diresidue,RVD) 重復(fù)序列[5]。CRISPR/Cas9 利用 Cas9靶向 CRISPR RNA (crRNA) 或?qū)?RNA (guide RNA, gRNA)[6]。與 ZFNs相比較，TALENs和CRISPR的靶向位點選擇范圍更廣，效率更高。但TALENTs有一定的細胞毒性，且構(gòu)建復(fù)雜[7]。

上述3種基因組編輯技術(shù)均可激活細胞的兩種 DNA 修復(fù)方式：非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ) 和同源重組 (Homology-directed recombination, HDR)，通過4種方式糾正DNA突變：破壞 (Disruption) 內(nèi)源性序列、移碼 (Frameshift) 恢復(fù)DNA讀碼框、敲入 (Knock-in) 外源性序列和置換(Substitution) 突變序列[7]。目前上述基因組編輯技術(shù)絕大多數(shù)只是在人體細胞或動物實驗中證實有效[8-9]，如何應(yīng)用于臨床還存在較多實際問題，如可能出現(xiàn)脫靶效應(yīng) (Off-target) 誘導腫瘤發(fā)生等。

4.1.2 靶向致病基因RNA

對于功能增強型突變所致遺傳病還可利用RNAi技術(shù)干預(yù)致病基因的RNA轉(zhuǎn)錄、降解。RNAi是雙鏈RNA介導的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。成纖維生長因子 2 (Fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2) 功能增強型點突變是Apert綜合征的主要病因。Shukla等發(fā)現(xiàn)利用 RNAi降低FGFR2表達水平可完全防止Apert小鼠出現(xiàn)囟門早閉表型[10]。

根據(jù)Clinical Trial數(shù)據(jù)庫，目前有23項注冊臨床研究使用RNAi方法治療腫瘤、HIV、肝炎等疾病，尚無應(yīng)用于遺傳病治療的臨床試驗。限制RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床治療的因素主要包括穩(wěn)定性、off-target效應(yīng)、免疫刺激以及導入機體方法。以往多使用膽固醇或脂質(zhì)體使 SiRNA非選擇性導入體內(nèi)，僅對于靶器官是肝臟或空腸者有較好的效果，且需要的藥物劑量較大，存在明顯脫靶效應(yīng)[11]。隨著RNAi導入技術(shù)的改良，首項 RNAiⅠ期臨床試驗采用納米粒釋放系統(tǒng)(Nanoparticle-delivery system) 遞送RNAi來治療實體瘤。近來脂質(zhì)納米體 (Lipid Nanoparticles,LNPs) 實現(xiàn)了RNAi的多種細胞靶向性。以上技術(shù)的發(fā)展為RNAi應(yīng)用于遺傳病臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

4.1.3 靶向致病基因編碼蛋白

這些問題的出現(xiàn)恰恰表明，員工缺乏內(nèi)部控制觀念，缺乏對理念的理解，只停留在內(nèi)部監(jiān)督的層面，而不能深入理解內(nèi)部控制的本質(zhì)和內(nèi)容[1]，導致執(zhí)行力和約束力低。

對于功能增強型突變所致遺傳病，尤其是受體蛋白突變疾病，可利用可溶性蛋白、模擬多肽等阻斷突變蛋白發(fā)揮效應(yīng)。以 FGFRs功能增強突變所致骨骼遺傳疾病為例，可通過阻斷跨膜受體 (FGFRs) 與配體 (FGFs) 結(jié)合來抑制致病蛋白發(fā)揮作用。Ach和致死性侏儒 (Thanatophoric dysplasia, TD) 均主要由FGFR3功能增強型點突變所致[12]。我們利用酵母雜交篩選到結(jié)合FGFR3胞外域的12多肽 (P3)，可緩解致死性侏儒小鼠(TD II) 的異常表型[13]。FGFR3可溶性受體、FGFR2融合蛋白可分別緩解Ach[14]和Apert小鼠表型[15]。

4.1.4 靶向相關(guān)信號通路/分子

根據(jù)遺傳病的發(fā)病機制，利用阻斷劑直接阻斷功能增強型遺傳病中調(diào)高的信號通路有一定療效。MAPK磷酸化增加是FGFR2點突變導致Apert發(fā)生的主要機制，Shukla等發(fā)現(xiàn)注射U0126阻斷MEK磷酸化[10]可部分緩解Apert小鼠顱縫早閉表型。除了直接阻斷相關(guān)信號通路，利用其他分子來間接調(diào)節(jié)疾病發(fā)生相關(guān)信號通路是另外一個策略。Lorget等在軟骨細胞中過表達C型利鈉肽 (CNP) 及給予CNP注射可緩解Ach小鼠表型，其機制是CNP通過抑制MAPK通路促進細胞外基質(zhì)生成。由于 CNP半衰期過短，該團隊開發(fā)了其多肽類似物BMN111以治療Ach，目前已進入Ⅱ期臨床試驗[16]。

另外，還可通過調(diào)節(jié)疾病發(fā)生中非致病基因直接調(diào)控的信號通路治療遺傳病。如Grafe在OI基因工程小鼠模型中發(fā)現(xiàn) TGF-β信號通路過度激活是其發(fā)病的重要原因，利用TGF-β的中和抗體1D11可部分糾正OI小鼠的異常骨骼表型并改善其肺臟病理形態(tài)。該抗體將于 2015年開始進行Ⅰ期臨床試驗[17]。

4.2 針對表型

盡管靶向致病基因的研究給臨床治愈遺傳病帶來了曙光，但也必須認識到基因型并不能始終如一地預(yù)測表型[18]。因此，對于這部分遺傳病最直接的治療策略就是針對患者及其表型進行干預(yù)。如COLI基因突變是 OI患者頻發(fā)骨折的根本原因，但目前尚缺乏直接靶向COLI基因的治療手段，因此可直接通過改善骨質(zhì)量以預(yù)防骨折。以往發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5 (LDL receptor-related protein 5, LRP5) 介導經(jīng)典 Wnt通路促進間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化并增加骨密度[19]。Jacobsen等在OI轉(zhuǎn)基因模型小鼠中過表達LRP5可不依賴于影響COLI mRNA表達或蛋白分泌來增加小鼠骨量和骨強度[20]。此外，給予OI小鼠LRP5的抑制分子——clerostin的單克隆抗體可增加小鼠骨密度及骨力學強度，達到治療目的[20]。

4.3 其他

除了上述基因相關(guān)的生物學治療措施外，干細胞一直是各種疾病治療措施研究的熱點和難點，也已經(jīng)在遺傳病治療方面開始啟動研究。尤其是多能干細胞 (iPS)，從成體分離的具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，可解決異體移植干細胞的倫理和安全性問題。已有研究利用TALENs在iPS中修飾凝血因子Ⅷ基因 (Blood coagulation factor , F8Ⅷ)制備了模擬血友病 A的細胞系，同時再利用TALENs成功地在該細胞系中恢復(fù) F8正常表達[21]。Sasai團隊利用三維培養(yǎng)系統(tǒng)成功地將人ES細胞誘導成大腦皮層組織和包含視網(wǎng)膜和感光細胞的胚胎眼睛[22]。以上研究都為干細胞應(yīng)用于遺傳病的治療提供了可行性。

5 展望

5.1 致病機制的研究是治療遺傳病的基礎(chǔ)

5.2 生物治療的時空靶向性和安全性是保證臨床應(yīng)用的關(guān)鍵

時間靶向性：治療療程需要根據(jù)表型出現(xiàn)的時間進行確定。對機體生理功能存在持續(xù)影響的疾病應(yīng)長期干預(yù)，如低磷酸酯酶癥患者需終生補充缺乏的堿性磷酸酶，長期用藥的安全性尤其重要。胎兒期或兒童期發(fā)病者應(yīng)在個體發(fā)育的相應(yīng)階段進行干預(yù)，如ACH患者主要是骨骼發(fā)育的異常，成年期無更多的表型出現(xiàn)，應(yīng)在骨骼發(fā)育的早期干預(yù)。

空間靶向性：遺傳病發(fā)生病變的組織/器官由致病基因的表達部位決定，靶向特定的病變細胞、糾正其異常功能，而不影響其他正常組織/器官功能可提高生物學治療措施的有效性及安全性。如既往RNAi導入機體主要利用腺病毒或慢病毒載體，缺乏特異性和靶向性。脂質(zhì)納米體解決了RNAi的細胞靶向性，目前已實現(xiàn)多種細胞靶向，如實質(zhì)腫瘤、呼吸道上皮細胞、部分吞噬細胞。靶向成骨細胞的 antagomir-214 (靶向ATF RNAi) 可促進小鼠骨形成[24]。這也為其他生物治療措施如何實現(xiàn)細胞靶向性提供了借鑒。此外，在干預(yù)手段的選擇方面，直接靶向致病基因/蛋白的治療措施，其理論上比通過靶向致病基因相關(guān)信號通路/靶基因來間接調(diào)節(jié)致病基因/蛋白的副作用更小。

安全性：基因組編輯技術(shù)的off-target現(xiàn)象是其最主要的安全問題，其使用的核酸酶可能激活原癌基因或破壞腫瘤抑制基因、最終導致腫瘤發(fā)生。另外，導入蛋白的免疫反應(yīng)也是臨床應(yīng)用生物技術(shù)需要注意的副作用，必要時應(yīng)考慮同時使用免疫抑制劑。

5.3 強調(diào)綜合治療

雖然一些遺傳病的生物學治療措施得到了較大的發(fā)展，但必須清醒地認識到目前這些生物學治療方法仍不能完全治愈遺傳病，對于已經(jīng)發(fā)生的異常表型、并發(fā)癥，仍需要結(jié)合臨床進行相應(yīng)的藥物、手術(shù)或康復(fù)治療。

綜上所述，基因組編輯、RNAi、融合蛋白、可溶性受體、模擬短肽等生物學方法，以靶向遺傳病致病基因DNA、RNA、編碼蛋白及相關(guān)信號通路/分子等為策略，給遺傳病的臨床治療提供了新的選擇。雖然這些治療措施大多數(shù)仍局限于體外或動物實驗，存在時空靶向性、安全性等需要進一步完善的缺陷，但隨著生命醫(yī)學科學的發(fā)展，不久的將來生物學治療措施必將成功應(yīng)用于臨床上，治愈遺傳病成為可以預(yù)想的現(xiàn)實。

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