以生物合成為基礎(chǔ)的紅霉素A的產(chǎn)量提高和結(jié)構(gòu)改造

陳單丹，吳杰群，劉文

紅霉素是一類廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有良好的抗革蘭氏陽性菌活性和較低的腸胃道毒副作用[1]。自 1952年首次從紅色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea (最初命名為紅霉素鏈霉菌 Streptomyces erythreus)[2]中分離獲得后，紅霉素的使用率一直位于全球抗生素類藥物的前列。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，紅霉素由紅霉內(nèi)酯 (Erythronolid)、L-碳霉糖 (L-mycarose) 和D-脫氧糖胺 (D-desosamine) 3部分以O(shè)-糖苷鍵連接而成。紅霉素A作為活性最好的天然組分，區(qū)別于紅霉素B、C、D的特征在于大環(huán)骨架的羥化和糖基單元的甲基化程度不同[3](圖1)。以紅霉素A為代表的第一代紅霉素在酸性條件下容易脫水縮合形成螺縮酮，繼而喪失生物活性[4]。此外，隨著紅霉素在臨床上的大量使用，越來越多的耐藥性問題也引起了人們的關(guān)注[5]。通過紅霉素A的結(jié)構(gòu)修飾，不僅能夠提高化合物對(duì)酸的穩(wěn)定性，克服細(xì)菌耐藥性的問題，甚至對(duì)抗菌譜也有較大的擴(kuò)展[6]。以阿齊霉素(Azithromycin)[7]、克拉霉素 (Clarithromycin)[8]、羅紅霉素 (Roxithromycin)[9]為代表的第二代紅霉素，和以泰利霉素 (Telithromycin)[10]、賽紅霉素 (Cethromycin)[11]為代表的第三代紅霉素都是在紅霉素A的基礎(chǔ)上通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾開發(fā)得到的[12](圖1)，同時(shí)也都是當(dāng)今主流的醫(yī)用抗生素。由此可見，針對(duì)紅霉素A的產(chǎn)量提高研究具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造更具有巨大的新藥開發(fā)潛力。由于紅霉素 A的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，采用化學(xué)方法進(jìn)行合成和修飾的能力比較有限[13]。在掌握生物合成機(jī)制的前提下，人們可以特異性地從遺傳水平上操縱紅霉素產(chǎn)生菌種的代謝途徑，構(gòu)建基因重組菌株用于大量發(fā)酵最為有效的組分紅霉素 A；或者利用組合生物合成 (Combinatorial biosynthesis)技術(shù)對(duì)紅霉素A的生物合成途徑進(jìn)行改造，獲得結(jié)構(gòu)復(fù)雜的紅霉素類似物庫用于篩選和發(fā)展具有應(yīng)用前景的藥物[14]。

圖1 紅霉素類抗生素的代表性藥物[3,7-11]Fig. 1 Representative erythromycins[3,7-11].

近年來，人們對(duì)于紅霉素A的生物合成機(jī)制已經(jīng)有了全面的研究和深刻的認(rèn)識(shí)。除了紅色糖多孢菌以外，紅霉素的產(chǎn)生菌種主要是土壤微生物，包括紅霉素氣微菌 Aeromicrobium erythreum[15]和巴西諾卡菌 Nocardia brasiliensis[16]?；诋a(chǎn)生菌種的基因組測序[17]，紅霉素生物合成基因簇的信息不斷獲得豐富[18]，包括關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)功能鑒定、催化機(jī)制推導(dǎo)[19-22]以及生物合成途徑的闡明[23]等。值得一提的是，近期在中性嗜鹽的紅色放線多孢菌 Actinopolyspora erythraea 中也報(bào)道了紅霉素和新型紅霉內(nèi)酯的產(chǎn)生[24]。本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)這株嗜鹽菌的全基因組測序，定位得到全新的紅霉素生物合成基因簇；結(jié)合化學(xué)型-基因型關(guān)聯(lián)分析，推導(dǎo)了其中紅霉素類化合物的生物合成機(jī)制[25]。本文綜述了近年來基于紅霉素A生物合成機(jī)制展開的以產(chǎn)量提高和結(jié)構(gòu)改造為目標(biāo)的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 紅霉素A的生物合成機(jī)制

紅霉素A的生物合成可以分為大環(huán)內(nèi)酯骨架6-脫氧紅霉內(nèi)酯B (6-deoxyerythronolide B，6-dEB) 的形成和后修飾兩大步驟[23]。

6-dEB 的生物合成由 I型聚酮合酶(Polyketide synthase，PKS) 復(fù)合酶系催化。該復(fù)合酶系含有 3個(gè)酶蛋白亞基：DEBS1、DEBS2和DEBS3，總共包括1個(gè)起始模塊 (Module) 和6個(gè)延伸模塊，涉及3個(gè)基本功能域 (Domain)：β-酮基硫酯合成酶 (Ketosynthase，KS)、?；D(zhuǎn)移酶 (Acyltransferase，AT)、?；d體蛋白(Acyl carrier protein，ACP)[26]。起始模塊中的AT特異性識(shí)別丙酰輔酶A (Coenzyme A，CoA)，將其轉(zhuǎn)移到ACP上作為起始單元。起始單元隨后被轉(zhuǎn)移到第一個(gè)延伸模塊的KS上，同時(shí)第一個(gè)延伸模塊中的 AT特異識(shí)別甲基丙二酰 CoA并將其轉(zhuǎn)移到第一個(gè)延伸模塊的 ACP上，KS催化起始單元丙?；c延伸單元甲基丙二?；s合形成 β-酮完成第一輪延伸。其他 5個(gè)延伸模塊采用類似的機(jī)理依次線性完成縮合，連接在PKS上的聚酮鏈在每一輪延伸后都會(huì)增加兩碳單元。此外，延伸模塊還選擇性含有 β-酮基還 原 酶 (β-ketoreductase， KR)、 脫 水 酶(Dehydratase， DH)、 烯 醇 還 原 酶(Enoylreductase，ER) 功能域，分別特異性地將延伸聚酮鏈的 β-羰基還原至羥基、反式烯基或完全飽和的狀態(tài)，最終形成一個(gè)十四碳的聚酮鏈。在末端硫酯酶 (Thioesterase，TE) 的催化下，該聚酮中間體從PKS上解離下來，環(huán)化形成 6-dEB[27](圖 2)。

大環(huán)內(nèi)酯骨架 6-dEB在形成之后，還需要經(jīng)歷一系列后修飾反應(yīng)才能獲得成熟的終產(chǎn)物紅霉素A，以及包括紅霉素B、C、D在內(nèi)的中間產(chǎn)物。首先，細(xì)胞色素P450氧化酶EryF在6-dEB的 C6位進(jìn)行羥化，形成紅霉內(nèi)酯 B(Erythronolide B，EB)[28]。然后，糖基轉(zhuǎn)移酶EryBV在EB的C3位羥基上連接L-碳霉糖，形成 3-O-碳霉糖基紅霉內(nèi)酯 B (3-α-mycarosyl erythronolide B，MEB)。緊接著，另一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶 EryCⅢ在MEB的 C5位羥基上連接D-脫氧糖胺，形成首個(gè)具有生物活性的中間體——紅霉素D[29]。紅霉素D在細(xì)胞色素P450氧化酶EryK的催化下完成C12位的羥化，合成紅霉素C；再在 S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosyl methionine，SAM) 依賴的甲基化酶 EryG作用下完成碳霉糖單元 C3’’位的羥甲基化，合成最終產(chǎn)物紅霉素A。此外，紅霉素D也可以以較低的效率先在EryG的作用下完成碳霉糖單元的羥甲基化，得到紅霉素B；再通過EryK的作用，合成紅霉素A[30](圖2)。作為后修飾不完全的中間體，紅霉素B、C、D等組分在原始產(chǎn)生菌種的發(fā)酵液中廣泛存在、難以去除，被視為副產(chǎn)物。

2 以生物合成為基礎(chǔ)的紅霉素A的產(chǎn)量提高研究

由于紅霉素A的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，采用化學(xué)合成工藝?yán)鄯e步驟繁瑣、成本較高，因此，生產(chǎn)上主要采用微生物發(fā)酵的方法獲得。紅霉素發(fā)酵產(chǎn)業(yè)所面臨的主要問題是發(fā)酵單位不高、組分比例不佳，這也使我國紅霉素A原料藥的競爭力受到了很大的限制。

圖2 紅霉素A的生物合成途徑[23]Fig. 2 Biosynthetic pathway of erythromycin A[23].

針對(duì)發(fā)酵單位不高的問題，除了傳統(tǒng)的誘變育種以外，人們也基于紅霉素A的生物合成機(jī)制開發(fā)了若干行之有效的高產(chǎn)菌種遺傳改造策略。例如，每分子紅霉素A的生物合成都需要引入1分子的丙酰CoA和6分子的甲基丙二酰 CoA。因此，提高這兩種前體特別是甲基丙二酰CoA的體內(nèi)供給量將極大地提高紅霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。Reeves等[31-32]通過過量表達(dá)甲基丙二酰CoA變位酶 (Methylmalonyl-CoA mutase，MCM)，強(qiáng)化了甲基丙二酰 CoA前體的體內(nèi)供給量，獲得了紅霉素的高產(chǎn)菌株。如果把紅色糖多孢菌看成紅霉素生物合成的車間，那么最有效直接的提高生產(chǎn)速度的方法不是改變生產(chǎn)過程中某一個(gè)環(huán)節(jié)的工藝，而是重新建設(shè)一條新的生產(chǎn)線。本實(shí)驗(yàn)室在紅色糖多孢菌體內(nèi)倍增了紅霉素的PKS編碼基因，使紅霉素的產(chǎn)量提高了近50%，并使發(fā)酵周期縮短了1/3。此外，由于大腸桿菌 Escherichia coli具有生長代謝快速、基因操作方便、遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)，是理想的紅霉素A異源表達(dá)宿主。Pfeifer課題組通過導(dǎo)入紅霉素生物合成基因簇中的全部結(jié)構(gòu)基因，實(shí)現(xiàn)了紅霉素A在大腸桿菌中的異源表達(dá)[33]。他們還通過強(qiáng)化外源蛋白的表達(dá)，在大腸桿菌中合理地調(diào)控丙酰CoA和甲基丙二酰CoA前體的生物合成，提高了紅霉素的產(chǎn)量[34]。

針對(duì)組分比例不佳的問題，解決方法在于選育紅霉素A的絕對(duì)優(yōu)勢菌株。根據(jù)紅霉素A的骨架結(jié)構(gòu)后修飾途徑，控制紅霉素從D組分到A組分的轉(zhuǎn)化需要兩個(gè)關(guān)鍵的后修飾蛋白參與：細(xì)胞色素P450氧化酶EryK和SAM依賴的甲基化酶 EryG。這兩個(gè)酶催化效力的不足直接導(dǎo)致了紅霉素B和C的積累[30]。本實(shí)驗(yàn)室首先通過同源重組的方式把2個(gè)拷貝的eryK和1個(gè)拷貝的eryG導(dǎo)入到紅色糖多孢菌E3染色體中。當(dāng)羥化酶基因 eryK與甲基化酶基因 eryG的拷貝數(shù)為3∶2時(shí)，雜質(zhì)紅霉素B和C完全消失，紅霉素A的產(chǎn)量也提高了約30%[35]。這是首例采用基因工程的方法從根源上把紅霉素雜質(zhì)組分 B和 C完全除去。為了克服菌種發(fā)酵的不穩(wěn)定性，保證高產(chǎn)菌株在沒有抗性壓力的情況下依然維持穩(wěn)定的基因型和高產(chǎn)表型，本實(shí)驗(yàn)室嘗試采用由放線菌噬菌體ΦC31整合酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的紅霉素A高產(chǎn)菌株。我們在紅色糖多孢菌基因組中一段功能喪失的 PKS區(qū)域?qū)牖讦礐31整合酶整合的基因插入盒，將8個(gè)拷貝的ΦC31整合酶特異性識(shí)別的細(xì)菌插入序列(Bacterial attachment site，attB) 導(dǎo)入上述PKS區(qū)域，以后便可以實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定整合 (圖3)，也為紅霉素A的工業(yè)生產(chǎn)帶來了便利[36]。

3 以生物合成為基礎(chǔ)的紅霉素A的結(jié)構(gòu)改造研究

紅霉素A的生物合成包含兩大步驟，相應(yīng)地，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的策略也主要從兩方向展開：其一是對(duì)編碼6-dEB形成的PKS基因進(jìn)行遺傳改造，定向改變大環(huán)內(nèi)酯的骨架結(jié)構(gòu)；其二是對(duì)紅霉素合成的后修飾途徑進(jìn)行遺傳改造，特別是定向改變糖基單元的結(jié)構(gòu)。

3.1 大環(huán)內(nèi)酯骨架的結(jié)構(gòu)改造

Ⅰ型PKS的組織結(jié)構(gòu)和催化功能之間存在著一一對(duì)應(yīng)的線性邏輯關(guān)系，在蛋白亞基、模塊、功能域水平上的任何改變，都會(huì)影響大環(huán)內(nèi)酯合成反應(yīng)中的某一環(huán)節(jié)，從而引起骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的變化。由此產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯大多能夠經(jīng)歷后修飾反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的紅霉素類似物。目前，對(duì)紅霉素大環(huán)內(nèi)酯骨架的結(jié)構(gòu)改造研究主要集中在模塊和功能域的改變上，常見的策略包括功能域的替換、失活或插入，以及模塊的替換、重組或改造等[37]。

圖3 紅霉素A高產(chǎn)菌株的構(gòu)建策略和發(fā)酵產(chǎn)物分析[36]Fig. 3 Strategy of constructing high erythromycin A-producing strains and analysis of the fermentation products[36].

3.1.1 Ⅰ型PKS功能域水平上的遺傳操作

在Ⅰ型PKS中，AT功能域負(fù)責(zé)小分子羧酸底物的識(shí)別和上載。將其替換為識(shí)別不同底物的AT，可以在聚酮鏈的合成過程中摻入不同的結(jié)構(gòu)單元。在6-dEB的形成過程中，6個(gè)延伸模塊的AT都特異識(shí)別和上載甲基丙二酰CoA。將特異識(shí)別丙二酰CoA的AT分別替換模塊1到模塊6的AT，能夠分別產(chǎn)生在大環(huán)內(nèi)酯C12、C10、C8、C6、C4和 C2位缺少甲基的紅霉內(nèi)酯 1-6[38-41]。類似地，采用來自尼達(dá)霉素(Niddamycin) 的PKS模塊7的識(shí)別乙基丙二酰CoA的AT替換紅霉素PKS模塊5的AT，則可獲得C6位乙基取代的紅霉內(nèi)酯7[42](圖4)。

Ⅰ型PKS的延伸模塊選擇性含有KR、DH和ER功能域，通過影響延伸中聚酮鏈的β-羰基的還原水平，改變大環(huán)內(nèi)酯的骨架結(jié)構(gòu)。對(duì)紅霉素PKS模塊6中的KR和模塊4中的ER進(jìn)行點(diǎn)突變失活，可以分別得到C3位酮基取代的紅霉內(nèi)酯 8和 C6-C7位不飽和的紅霉內(nèi)酯9[43-44]。此外，直接敲除模塊6中的KR將影響與之相連的AT的底物識(shí)別特異性，除產(chǎn)生化合物8外，還意外地產(chǎn)生了化合物10[37](圖5)。而對(duì)紅霉素PKS唯一的模塊4中的DH進(jìn)行點(diǎn)突變失活，將導(dǎo)致DEBS2功能的完全喪失[45]。

圖 4 延伸模塊 AT功能域替換所產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯1-7[38-42]Fig. 4 Novel erythronolides 1-7 produced by substituting the AT domains in the extender modules[38-42].

圖5 延伸模塊KR和ER功能域失活所產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯8-10[37,43-44]Fig. 5 Novel erythronolides 8-10 produced by inactivating the KR and ER domains in the extender modules[37,43-44].

向紅霉素PKS的相關(guān)模塊插入原本不存在的KR、DH和ER功能域，同樣能夠產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)類似物。McDaniel等用雷帕霉素(Rapamycin) PKS模塊4中的DH-KR區(qū)域分別取代紅霉素PKS模塊2和模塊6中的KR，產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯C10-C11位和C2-C3位含有不飽和烯鍵的紅霉內(nèi)酯 11和 12。而用雷帕霉素 PKS模塊 1中的 DH-ER-KR區(qū)域分別取代紅霉素PKS模塊2和模塊5中的KR，則產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯C11位和C5位脫羥基的紅霉內(nèi)酯13和14。然而，用此區(qū)域替換紅霉素PKS模塊6的KR時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)C3位脫羥基的化合物出現(xiàn)，反而有較多的化合物12和15積累[39]。由此可見，替換后的模塊ER無活性，KR只有部分活性。這點(diǎn)可以反映出插入功能域的活性受到蛋白整體結(jié)構(gòu)的影響。許多由Ⅰ型PKS編碼的聚酮化合物，如泰樂菌素 (Tylosin)[46]、苦霉素 (Pikromycin)[47]、多殺菌素 (Spinosyn)[48]、竹桃霉素(Oleandomycin)[49]等，其起始模塊在AT-ACP區(qū)域的前端含有 β-酮?；铣擅?(β-ketoacyl synthase，KSQ) 功能域。首先，AT識(shí)別丙二酰CoA，將其結(jié)合到ACP上；隨后，KSQ催化丙二酰硫醇脫羧形成乙酰基；最后，再轉(zhuǎn)移到第一個(gè)延伸模塊的KS上進(jìn)行后續(xù)的合成。把竹桃霉素起始模塊中的KSQ與雷帕霉素模塊2中識(shí)別丙二酰CoA的AT相連，用以替換紅霉素PKS起始模塊中識(shí)別丙酰CoA的AT，該雜合的起始模塊最終把乙?；鶄鬟f到紅霉素PKS第一個(gè)延伸模塊的 KS上，產(chǎn)生 C13位帶有甲基的紅霉內(nèi)酯 16[50](圖6)。

圖6 延伸模塊KR和ER-KR功能域插入所產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯11-16[39,50]Fig. 6 Novel erythronolides 11-16 produced by inserting the KR and ER-KR domains in the extender modules[39,50].

3.1.2 Ⅰ型PKS模塊水平上的遺傳操作

紅霉素和阿維菌素 (Avermectin) PKS的起始模塊均只含有AT-ACP結(jié)構(gòu)域。前者的AT能夠特異性識(shí)別丙酰CoA為起始單元，并將其上載到同模塊的ACP上；后者的AT具有較為寬泛的底物選擇性，能夠識(shí)別異丁酰CoA或者2-甲基丁酰CoA為起始單元，將其上載到同模塊的ACP上[51]。用阿維菌素PKS的起始模塊替換紅霉素PKS的起始模塊，雜合的PKS能合成大環(huán)內(nèi)酯 C13位上連接異丙基或仲丁基的紅霉內(nèi)酯 17和 18[52](圖 7)。

圖7 起始模塊替換所產(chǎn)生的新型紅霉內(nèi)酯17-18[52]Fig. 7 Novel erythronolides 17-18 produced by substituting the loading module[52].

紅霉素DEBS3末端的TE功能域負(fù)責(zé)聚酮鏈的水解，并將其環(huán)化成為十四元環(huán)骨架6-dEB[53]。該TE對(duì)聚酮鏈的長度有較高的容忍度，能夠識(shí)別和催化不同長短的聚酮鏈形成不同大小的內(nèi)酯環(huán)。將TE連接到DEBS1的末端能夠產(chǎn)生六元環(huán)內(nèi)酯化合物19[54](圖8A)。而將含有紅霉素PKS模塊5和6及TE的DEBS3基因?qū)氲教焖{(lán)色鏈霉菌 Streptomyces coelicolor CH999中，在不含起始模塊的情況下，DEBS3仍能識(shí)別甲基丙二酰CoA為底物，脫羧形成丙酰基繼續(xù)往下延伸，最終環(huán)化形成六元環(huán)內(nèi)酯20[55](圖8B)。這與前面所述起始模塊含有KRQ結(jié)構(gòu)域的催化機(jī)制十分相似。化合物 19與 20的構(gòu)型不同，原因在于KR催化的立體選擇性：其中，模塊 1的 KR在催化β-酮基還原成羥基時(shí)，專一地產(chǎn)生R構(gòu)型產(chǎn)物；而其他模塊的KR則都產(chǎn)生 S構(gòu)型的產(chǎn)物[56-57]。KR屬于短鏈脫氫/還原酶 (Short-chain dehydrogenase/reductase，SDR) 家族[58]，催化產(chǎn)生R構(gòu)型化合物的 KR活性中心一側(cè)含有高度保守的天冬氨酸殘基，催化產(chǎn)生S構(gòu)型化合物的 KR活性中心則缺少此天冬氨酸殘基而在活性中心相反的一側(cè)含有色氨酸殘基。如此細(xì)微差異使聚酮化合物在進(jìn)入KR活性中心時(shí)的方向不同，從而導(dǎo)致還原產(chǎn)物形成不同的立體構(gòu)型[44,57]。將TE連接到模塊5的末端能夠產(chǎn)生十二元環(huán)內(nèi)酯21[59](圖8C)。將雷帕霉素PKS模塊2或模塊5插入到紅霉素PKS模塊1之后，能夠產(chǎn)生十六元環(huán)化合物22和23以及在C13位環(huán)化的十四元環(huán)產(chǎn)物 24和 25[60](圖 8D)。

近年來對(duì) DEBS的蛋白晶體學(xué)研究日益深入，基于對(duì)蛋白立體結(jié)構(gòu)和蛋白亞基相互作用的分析，可以人為地對(duì)PKS模塊進(jìn)行定向改造。研究發(fā)現(xiàn)，ACP功能域的結(jié)構(gòu)對(duì)延伸中的聚酮鏈在模塊內(nèi)和模塊間的傳遞都至關(guān)重要[61]。通過改造紅霉素PKS模塊3中的ACP，將其部分替換成模塊2的ACP，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)模塊3的重復(fù)使用，形成四酮產(chǎn)物26[62](圖9)。

3.2 后修飾途徑中糖基單元的結(jié)構(gòu)改造

圖8 重組模塊的結(jié)構(gòu)與其催化合成的產(chǎn)物[54-55,59-60] (A：TE功能域與起始模塊、延伸模塊1-2組合所產(chǎn)生的新型六元內(nèi)酯19；B：TE功能域與延伸模塊5-6組合所產(chǎn)生的新型六元內(nèi)酯20；C：TE功能域與起始模塊、延伸模塊1-5組合所產(chǎn)生的新型十二元內(nèi)酯21；D：雷帕霉素延伸模塊2或5插入所產(chǎn)生的新型十六元內(nèi)酯22和23、新型十四元內(nèi)酯24和25)Fig. 8 Domain organization of hybrid PKSs and their products[54-55,59-60]. (A) A novel six-membered erythronolide 19 produced by coupling the TE domain with the loading module and the extender modules 1-2. (B) A novel six-membered erythronolide 20 produced by coupling the TE domain with the loading module and the extender modules 5-6. (C) A

紅霉素 A生物合成的后修飾過程包括在6-dEB上的兩步羥基化、兩步糖基化以及在糖基上的一步甲基化。由于糖基單元能夠直接參與天然產(chǎn)物與靶點(diǎn)之間的相互作用，或者參與靶細(xì)胞的識(shí)別[63]，因此，在紅霉素A后修飾途徑研究中最有價(jià)值的部分是大環(huán)內(nèi)酯骨架的糖基化。C5位的D-脫氧糖胺幾乎存在于所有的十四元大環(huán)內(nèi)酯類活性天然產(chǎn)物中，被認(rèn)為是紅霉素A與核糖體結(jié)合從而抑制細(xì)菌生長的一個(gè)關(guān)鍵因素[37,64]。而C3位L-碳霉糖的存在似乎對(duì)于紅霉素A的抗菌活性貢獻(xiàn)不大，去除以后的紅霉素衍生物反而能夠克服一些已經(jīng)出現(xiàn)的細(xì)菌耐藥性問題[65]。由此提示，對(duì)于紅霉素A糖基novel twelve-membered erythronolide 21 produced by coupling the TE domain with the loading module and the extender modules 1-5. (D) Novel sixteen-membered erythronolides 22 and 23 and fourteen-membered erythronolides 24 and 25 produced by inserting the extender module 2 or 5 of rapamycin.單元的結(jié)構(gòu)改造著眼點(diǎn)應(yīng)該放在由糖基轉(zhuǎn)移酶EryBV催化紅霉素內(nèi)酯環(huán) C3位羥基的糖基化上。體外測活實(shí)驗(yàn)證實(shí)，EryBV對(duì)糖基單元具有比較寬泛的底物選擇性，能夠識(shí)別一系列的糖基作為底物以較低的催化效率合成紅霉素類似物 27?37[66]。

圖9 改造ACP功能域使模塊3重復(fù)催化鏈延伸[62]Fig. 9 Engineered module 3 with the chimeric ACP domain exhibits iterative chain elongation[62].

圖10 EryBV底物寬泛性所產(chǎn)生的紅霉素中間體[66]Fig. 10 Erythromycin intermediates based on the substrate promiscuity of EryBV[66].

圖 11 EryCⅢ底物寬泛性所產(chǎn)生的紅霉素類似物[68-69]Fig. 11 Erythromycin analogues based on the substrate promiscuity of EryCⅢ[68-69].

相對(duì)于EryBV，糖基轉(zhuǎn)移酶EryCⅢ對(duì)糖基單元具有較高的底物特異性[67]。有報(bào)道顯示，EryCⅢ能夠把 D-麥氨糖 (D-mycaminose) 轉(zhuǎn)移到大環(huán)內(nèi)酯C5位的羥基上，從而形成新的紅霉素類似物紅霉素M[68]。當(dāng)缺乏D-脫氧糖胺時(shí)，EryCⅢ也可能識(shí)別 L-碳霉糖，催化形成化合物38[69]。

許多糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)底物的容忍性都比較高，可能將不同的糖基轉(zhuǎn)移至紅霉素大環(huán)內(nèi)酯骨架。例如，來自泛溫鏈霉菌 Streptomyces eurythermus的 AngMⅡ是泰樂菌素生物合成中糖基轉(zhuǎn)移酶。以泰樂酮 (Tylactone) 作為天然底物，將 D-麥氨糖轉(zhuǎn)移到 C5位的羥基上，產(chǎn)生化合物 39。研究發(fā)現(xiàn)，AngMⅡ同樣能夠識(shí)別EB 作為底物，糖基化產(chǎn)生化合物 40[69]，并且糖基化的位置是C5位的羥基，而不是C3位的羥基。又如，苦霉素生物合成中負(fù)責(zé)C5位羥基糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)底物的容忍性也較高，能夠識(shí)別一系列 6-dEB類似物，可以合成超過20種以上的新化合物[70]。

圖 12 糖基轉(zhuǎn)移酶 AngMⅡ催化產(chǎn)生的新型紅霉素40[69]Fig. 12 Novel erythromycin 40 generated by the glycosyltransferase AngMⅡ[69].

4 總結(jié)

作為紅霉素最為有效的天然組分和化學(xué)修飾獲得第二代、第三代紅霉素藥物的底物，紅霉素A的產(chǎn)量提高和結(jié)構(gòu)改造具有非常重要的意義和價(jià)值?；谏锖铣蓹C(jī)制，可以明確與紅霉素A生物合成直接相關(guān)的關(guān)鍵因素，包括PKS前體、催化蛋白等。在高產(chǎn)菌株遺傳改造方面，傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)目標(biāo)不明確，結(jié)果不穩(wěn)定，弊端顯而易見。通過對(duì)生物合成中的限速步驟的預(yù)測，可以對(duì)高產(chǎn)菌株的遺傳改造進(jìn)行良好的指導(dǎo)。例如，在紅霉素A產(chǎn)生菌的體內(nèi)增加催化蛋白和PKS前體的濃度，可以提高紅霉素的發(fā)酵產(chǎn)量[31-32]；對(duì)后修飾途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)化，則可以特異性提高紅霉素A的組分比例[35-36]。在化合物結(jié)構(gòu)改造方面，采用化學(xué)合成或修飾的方法所能進(jìn)行的結(jié)構(gòu)衍生也非常有限。通過對(duì)關(guān)鍵催化蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的分析，則可以更好地利用組合生物合成技術(shù)獲得大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜的紅霉素 A類似物。目前的研究重點(diǎn)主要集中在 6-dEB大環(huán)內(nèi)酯骨架結(jié)構(gòu)的改造和后修飾步驟中的糖基化反應(yīng)。我們相信，充分利用生物合成的基本原理進(jìn)行菌種的遺傳改造，可以彌補(bǔ)化學(xué)合成和修飾的不足，降低紅霉素A的生產(chǎn)成本，促進(jìn)新藥的研發(fā)。

值得一提的是，以對(duì)天然產(chǎn)物生物合成機(jī)制的理性認(rèn)識(shí)指導(dǎo)微生物菌種遺傳改造的這種“師從于自然”的理念對(duì)于大量具有高附加值的抗生素類藥物同樣適用。本實(shí)驗(yàn)室長期致力于采用化學(xué)思想和生物學(xué)技術(shù)解決在大宗微生物藥物發(fā)酵工業(yè)中的實(shí)際問題，在阿維菌素(Avemectin)[71]、硫鏈絲菌素 (Thiostrepton)[72-73]、他克莫司 (Tacrolimus)[74]、林可霉素(Lincomycin)[75]的產(chǎn)生菌種改造方面做出了大量基礎(chǔ)型和應(yīng)用型的研究工作。在改造菌種的發(fā)酵產(chǎn)品中，有效組分的產(chǎn)量提高、比例優(yōu)化，可以大幅度地提高生產(chǎn)效益，簡化后續(xù)工藝，增強(qiáng)企業(yè)競爭力，同時(shí)促進(jìn)微生物藥物的更新升級(jí)。

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