解郁育胞方對慢性應(yīng)激大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響

耿會轉(zhuǎn)，賀漪，周順長,韋文雙，方鴻浩，黎烈榮

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430061；2.武漢市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430022；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，武漢 430030)

解郁育胞方對慢性應(yīng)激大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響

耿會轉(zhuǎn)1，賀漪2，周順長3,韋文雙1，方鴻浩1，黎烈榮1

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430061；2.武漢市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430022；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，武漢 430030)

目的 研究解郁育胞方對慢性應(yīng)激大鼠的子宮內(nèi)膜胞飲突、HOXa-10 mRNA的影響，探討其對慢性應(yīng)激大鼠子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法 SPF級SD大鼠48只，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為3組：正常對照組、模型對照組、實驗藥物組。模型對照組、實驗藥物組大鼠建立慢性應(yīng)激模型。實驗藥物組于刺激第1天開始，每日9:00給予解郁育胞方溶液(相當(dāng)于生藥1 g ·mL-1)灌胃，給藥容量為11.8 mL·kg-1,每日1次，至經(jīng)陰道涂片檢查確認(rèn)妊娠后第4天停藥。正常對照組、模型對照組每日9：00灌服純化水11.8 mL·kg-1。3組大鼠分別于第21天16:00按照雌：雄=2：1合籠,確認(rèn)妊娠后第4天處死大鼠，透射電鏡制片評價子宮內(nèi)膜胞飲突的成熟度，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測HOXa-10 mRNA含量。結(jié)果 胞飲突成熟度：正常對照組評分(2.7±0.3)分，模型對照組組評分(1.3±0.3)分，實驗藥物組評分(2.1±0.2)分，實驗藥物組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HOXa-10 mRNA的表達(dá)：模型對照組HOXa-10 mRNA水平(0.658±0.031)較正常對照組(0.965±0.102)顯著下降(P<0.05)，實驗藥物組(0.866±0.125),與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 解郁育胞方可能通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HOXa-10 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，從而使胞飲突的數(shù)量和成熟度增加，進(jìn)而改善子宮內(nèi)膜的容受性。

解郁育胞方；應(yīng)激，慢性；子宮內(nèi)膜；容受性

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮對胚胎定位、黏附、侵入子宮內(nèi)膜的接受能力。子宮內(nèi)膜容受性差導(dǎo)致胚泡著床率低是不孕的重要原因?，F(xiàn)代生殖技術(shù)體外受精-胚胎移植(invitrofertilization and embryo transplantation,IVF-ET,俗稱試管嬰兒)通過改良促排卵方案、優(yōu)化實驗室手段或移植前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)等技術(shù)，已經(jīng)能夠獲得優(yōu)質(zhì)胚胎，但胚胎的著床率低成為制約助孕技術(shù)發(fā)展的瓶頸。臨床可通過使用激素調(diào)節(jié)內(nèi)膜厚度[1]，應(yīng)用小劑量阿司匹林增加子宮血流供應(yīng)[2]等方式改善內(nèi)膜容受性，以提高臨床妊娠率；也有中醫(yī)藥研究結(jié)果表明，通過補(bǔ)腎健脾活血[3-4]等能夠改善內(nèi)膜容受性。近年來人們逐漸認(rèn)識到心理因素可能對子宮內(nèi)膜容受性有影響，推測負(fù)性心理應(yīng)激影響子宮內(nèi)膜容受性是導(dǎo)致不孕的重要原因[5]。然而，通過改善患者機(jī)體心理應(yīng)激狀態(tài)提高子宮內(nèi)膜容受性的研究鮮見。解郁育胞方是我院婦科驗方，由《傅青主女科》開郁種玉湯化裁，獨辟蹊徑，從疏肝養(yǎng)肝的角度，改善不孕患者情志對子宮內(nèi)膜容受性的影響，提高臨床妊娠率。筆者在本研究中建立慢性應(yīng)激大鼠模型，從實驗角度進(jìn)一步探索解郁育胞方對慢性應(yīng)激大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響，闡明其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級未孕斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)雌性大鼠，連續(xù)1周做陰道脫落細(xì)胞涂片觀察，選擇有正常動情周期者48只納入實驗，8周齡，體質(zhì)量(200±10)g；雄性健康性成熟SD大鼠24只，SPF級，體質(zhì)量(200±10)g，均由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2008-0005，動物合格證號:42000600003755。所有大鼠購入后無菌程序轉(zhuǎn)入華中科技大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障系統(tǒng)動物實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2010-0057；湖北省實驗動物設(shè)施使用證明號：NO.00126877。動物實驗環(huán)境維持溫度20～24 ℃，相對濕度40%～60%，噪聲<60 dB，自由飲用無菌水，進(jìn)食經(jīng)121 ℃、15 min滅菌的全價營養(yǎng)顆粒飼料(湖北萬千佳興實驗動物有限公司提供)。

1.2 藥物與試劑 解郁育胞方方藥組成：白芍15 g(批號：1403139)，當(dāng)歸12 g(批號：1402123)，白術(shù)12 g(批號：1403081)，茯苓15 g(批號：1402007)，熟地20 g(批號：1402119)，山藥20 g(批號：1401360)，酒萸肉15 g(批號：1403014)，醋香附10 g(批號：1402005)，玫瑰花6 g(批號：1312027)。所有藥物均為免煎顆粒，由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。2份解郁膏胞方顆粒加雙蒸水配成250 mL混懸溶液備用(相當(dāng)于生藥1 g·mL-1)，放入冰箱4 ℃保存。雙蒸水(廣州復(fù)能基因有限公司，批號：C1D230A)。Trizol-RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，批號：008065yjj)，DL2000 DNA Marker試劑盒(日本Takara公司，批號：M2505)，5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液及M-MLV(廣州復(fù)能基因有限公司，批號：CO2010A)，Oligo(dT)、β-Actin引物(金斯瑞生物科技有限公司合成引物)，SYBR Green/Flour escein qPCR Master Mix(2X)試劑盒(美國ABI公司，批號：#D01010A)。

1.3 主要儀器 JY300水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，分光光度計(上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司),Viia7實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，透射電鏡(日本Hatachi公司)。

1.4 動物造模 采用文獻(xiàn)[6-7]所述方法制作慢性心理應(yīng)激大鼠模型。接受應(yīng)激處理的組別大鼠置于獨立房間，接受21 d 不同的應(yīng)激原刺激，包括行動受限(2 h)、夾尾(1 min,tid)、冰水游泳(4 ℃,5 min)、噪音(75 dB，1 h)、禁食(24 h)、禁水(24 h)。每周一至周六依次安排 1 種刺激，周日不給予任何刺激。大鼠出現(xiàn)神情倦怠，體質(zhì)量增加緩慢，進(jìn)食興趣降低，修飾行為(抬舉、抓癢、舔足等)減少，提示造模成功。

1.5 分組與給藥 將大鼠按照體質(zhì)量分層隨機(jī)分為3組，每組16只。正常對照組(無應(yīng)激，無灌藥)，模型對照組只有應(yīng)激，實驗藥物組(應(yīng)激+灌解郁育胞方藥液)。實驗藥物組于應(yīng)激第1天開始，每日9：00給予解郁育胞方溶液灌胃，按體表面積折算臨床有效劑量[8]，劑量為相當(dāng)于生藥11.8 g·kg-1,轉(zhuǎn)化為混懸藥液11.8 mL·kg-1，每日1次，至處死。正常對照組、模型對照組每日9：00灌服等體積純化水11.8 mL·kg-1，每日1次，直至處死。

3組大鼠分別于第21天16：00雌雄2：1合籠,次日晨9：00時檢查陰栓,并經(jīng)過陰道涂片檢查，發(fā)現(xiàn)精子或陰栓者記為妊娠第1天。

1.6 標(biāo)本采集 各組分別于妊娠后第4天處死大鼠，剖取并分離子宮，將子宮內(nèi)膜沿縱軸剖開，展平，反復(fù)用0.9%氯化鈉溶液沖洗后，取單側(cè)子宮置于4%戊二醛中固定24 h，制成透射電鏡標(biāo)本。取另側(cè)子宮取出后立即置于-80 ℃冰箱保存，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)測HOXa-10 mRNA含量。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 子宮內(nèi)膜胞飲突的表達(dá) 取子宮組織(含內(nèi)膜組織)，浸入0.9%氯化鈉溶液中超聲清洗5～10 min，置于4%戊二醛中固定24 h，再浸入1%鋨酸后固定2 h。然后浸入系列丙酮液中梯度脫水10 min,置入2%醋酸異戊酯中置換3 h，臨界點干燥,裝臺粘膠,涂銀粉導(dǎo)電膠,用真空鍍膜儀對樣本進(jìn)行金屬鍍膜,電鏡下觀察、獲取圖片以觀察子宮內(nèi)膜胞飲突。按REBECCA[9]方法,每個樣品選取12個視野觀察胞飲突,根據(jù)胞飲突的范圍進(jìn)行評分, 0分:無胞飲突； 1分:<25%； 2分:25%～50%；3分:>50%,然后對評分進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7.2 Real-Time PCR技術(shù)檢測大鼠子宮內(nèi)膜 HOXa-10mRNA表達(dá)

1.7.2.1 RNA提取和cDNA合成 將-80 ℃凍存標(biāo)本于4 ℃融化,用trizol試劑提取RNA,具體步驟按說明書操作,總RNA含量用分光光度計檢測。cDNA通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成,每3 μgRNA需Oligo(dT)2 μL,加雙蒸水至14.5 μL，70 ℃ 反應(yīng)5 min,短暫離心后置于冰上。然后將其加入5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL， RNA酶抑制劑0.5 μL，M-MLV 1 μL，加雙蒸水至20 μL，42 ℃ 反應(yīng)60 min，95 ℃反應(yīng) 5 min合成cDNA。

1.7.2.2 引物和探針 HOXa-10基因應(yīng)用BBI庫設(shè)計引物序列，擎科生物合成引物。大鼠HOXa-10,正義: 5′- GAGAATACGCCATTGAGCCC -3′,反義: 5′-TGCCCACCGTGCTATAGAAA-3′。β-Actin引物作為內(nèi)對照。β-Actin ,F：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTC-ATC-3′,R：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。

1.7.2.3 實時熒光定量PCR 采用SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)試劑盒，根據(jù)說明書，用實時熒光定量PCR儀擴(kuò)增cDNA。主要內(nèi)容包括：A.用β-Actin繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(稀釋倍數(shù)為×1,×0.25,×0.0625,×0.0156,×0.003 91)；B.標(biāo)本mRNA含量的測定通過計算標(biāo)本的mRNA與β-Actin mRNA的比值來確定；C.用TAE電泳緩沖液配置 2.0%瓊脂糖凝膠，以 120 V恒壓電泳約15 min后在凝膠成像儀下分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá) 采用透射電鏡以及REBECCA方法評分評價子宮內(nèi)膜胞飲突成熟度。正常對照組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞膜表面有大量“蘑菇狀”突起,界限清楚，無微絨毛，表現(xiàn)為完全發(fā)育的胞飲突；胞飲突評分(2.7±0.3)分。模型對照組子宮內(nèi)膜表面形態(tài)不均一,少量胞飲突局灶性表達(dá),大部分內(nèi)膜表面無膜狀突起,覆以濃密的微絨毛；胞飲突評分(1.3±0.3)分。實驗藥物組子宮內(nèi)膜表面表達(dá)大量胞飲突,仍有少量短而細(xì)的微絨毛,發(fā)育較正常對照組略延后；胞飲突評分(2.1±0.2)分。與正常對照組比較，模型對照組胞飲突評分顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型對照組比較，實驗藥物組胞飲突評分明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 子宮內(nèi)膜HOXa-10的表達(dá) 采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測大鼠子宮內(nèi)膜 HOXa-10基因表達(dá)，大鼠子宮內(nèi)膜HOXa-10 mRNA電泳結(jié)果顯示，3組在250 bp處均出現(xiàn)了特異性HOXa -10 mRNA 基因條帶(圖2)。HOXa-10 mRNA含量通過計算標(biāo)本的mRNA與β-Actin mRNA的比值測定，HOXa-10 mRNA在3組子宮內(nèi)膜和蛻膜組織中均有表達(dá)，正常對照組為(0.965±0.102)，模型對照組為(0.658±0.031)，實驗藥物組為(0.866±0.125)。與正常對照組比較，模型對照組HOXa-10 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，而實驗藥物組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 3組子宮內(nèi)膜 HOXa-10 基因的 RT-RNA 凝膠電泳圖

A.normal control group；B.model control group；C.experimental drug group

Fig.2 RT-RNA gel electrophoresis of HOXa-10 in three groups of endometrium

3 討論

子宮內(nèi)膜允許胚胎著床的關(guān)鍵時期,稱為“植入窗期”，代表子宮內(nèi)膜容受性達(dá)到最高[4]。人類此期通常在受精后5～7 d,持續(xù)不超過48 h；在大鼠、小鼠等嚙齒類動物,植入窗在受精后4 d開放,持續(xù)約24 h[10]。本研究通過了解解郁育胞方對慢性應(yīng)激大鼠植入窗期子宮內(nèi)膜胞飲突以及HOXα-10 mRNA的表達(dá)，了解對子宮內(nèi)膜容受性的影響。

植入窗期間子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表面的微絨毛被一種形態(tài)較大、足狀或蘑菇狀的突起取代,這種膜性突起因其具有胞飲功能而被稱為“胞飲突”。胞飲突使宮腔體積減小,有助于胚胎在子宮內(nèi)膜的定位，防止上皮細(xì)胞表面對胚胎的清除；增加黏附過程中內(nèi)膜上皮細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的接觸面,幫助胚胎與子宮上皮表面更接近，介導(dǎo)上皮細(xì)胞對液體和大分子物質(zhì)的攝入。完全發(fā)育的胞飲突是子宮內(nèi)膜容受性建立和植入窗開放的重要形態(tài)學(xué)標(biāo)志。根據(jù)REBECCA方法評分，與正常對照組相比，模型對照組胞飲突評分顯著降低，而實驗藥物組評分與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明解郁育胞方能顯著改善慢性應(yīng)激大鼠的胞飲突成熟度。

HOXa-10 基因在人類主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜，對子宮內(nèi)膜的增殖和分化、胞飲突和微絨毛的形成、胚胎的著床和發(fā)育等有重要調(diào)控作用[11]。許多學(xué)者將 HOXa-10基因的表達(dá)作為衡量子宮內(nèi)膜容受性的分子標(biāo)志物。研究表明，改變成熟雌鼠子宮HOXa-10的表達(dá),用電鏡檢測在著床期的子宮形態(tài)學(xué)改變,發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞胞飲突的數(shù)量和成熟度與HOXa-10的表達(dá)呈正相關(guān), HOXa-10是胞飲突形成的關(guān)鍵因素[12]。

患者一旦被確診為不孕，長期的心理緊張，導(dǎo)致出現(xiàn)焦慮、抑郁、敏感、處事偏激、負(fù)罪感、人際關(guān)系孤獨等各種負(fù)性心理情緒，使機(jī)體處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，出現(xiàn)睡眠和食欲差、性關(guān)系冷淡等，有13%患者表現(xiàn)出抑郁相關(guān)癥狀[13]。KLONOFF-COBEN等[14]對151例施行IVF 和輸卵管內(nèi)配子移植技術(shù)的患者進(jìn)行心理方面的調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)心理因素可影響包括取卵、移植、臨床妊娠等各個方面。情緒的改變常導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂，血漿中激素水平和神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)變化。本研究中慢性應(yīng)激模型對照組的胞飲突成熟度不足及數(shù)量減少，HOXa-10基因表達(dá)較正常對照組降低。推測負(fù)性心理應(yīng)激通過下調(diào)子宮容受性來影響受孕，導(dǎo)致胚胎移植的失敗率升高。

中醫(yī)學(xué)中，慢性應(yīng)激屬于肝郁范疇。女子素性憂郁，復(fù)因久不受孕，七情內(nèi)傷，繼發(fā)肝氣不舒，氣機(jī)不暢，沖任不能相資，不能攝精成孕。又肝郁克脾，脾傷不能通任脈而達(dá)帶脈，任帶失調(diào)，胎孕不受。解郁育胞方以《傅青主女科》開郁種玉湯化裁，稟疏肝養(yǎng)肝，健脾益精為大法，肝、脾、腎三臟同治，疏中有養(yǎng)，補(bǔ)中寓通，行氣而不傷正，養(yǎng)精而不滯血。方中當(dāng)歸、白芍均為肝經(jīng)要藥，前者辛散，疏達(dá)肝之氣血；后者酸柔，補(bǔ)斂肝之陰血，一動一靜，疏肝養(yǎng)肝，共為君藥。香附、玫瑰花疏肝解郁為臣。白術(shù)、茯苓健脾益氣，非但實土以抑木，且使?fàn)I血生化有源；熟地、山茱萸益腎填精，滋陰養(yǎng)血，均為佐使。諸藥合用，相得益彰，共使肝郁得疏，血虛得養(yǎng)，脾弱得復(fù)，腎精得濡，而胎孕乃成。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用解郁育胞方干預(yù)后，慢性應(yīng)激大鼠在植入窗期的上皮細(xì)胞胞飲突數(shù)量和成熟度明顯升高，HOXa-10 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，且胞飲突的數(shù)量和成熟度與HOXa-10基因的表達(dá)呈正相關(guān)，這與CAKMAK等[12]研究結(jié)果相符；筆者推斷，解郁育胞方通過上調(diào)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HOXa-10基因的表達(dá)，從而調(diào)控著胞飲突的成熟，這可能是解郁育胞方改善子宮內(nèi)膜容受性的機(jī)制之一。另外，由于實驗條件所限，本研究未能全面了解大鼠子宮內(nèi)膜容受性的其他細(xì)胞因子的表達(dá)及調(diào)控情況，還可以通過測定組織學(xué)如子宮內(nèi)膜厚度以及血流的影響，以及最佳藥物劑量和藥物毒性實驗等將在以后的工作中開展進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.010

Effect ofJieyuyubaoPrescription on Endometrial Receptivity for the Chronic Stress Rats

GENG Huizhuan1, HE Yi2, ZHOU Shunchang3, WEI Wenshuang1, FANG Honghao1, LI Lierong1

(1.HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430061,China； 2.DepartmentofObstetrisandGynecology,theFirstHospitalofWuhanCity,Wuhan430022,China； 3.ExperimentalAnimalCenter,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Objective To study the effect ofJieyuyubaoprescription on endometrial pinopodes and HOXa-10 mRNA in chronic stress rats , and to reveal the regulatory mechanisms of the endometrial receptivity. Methods Totally 48 SPF SD rats were randomly divided into three groups with weight stratified: normal control group (group A), model control group (group B) and experimental drug group (group C).Rat model of chronic stress was established in group B and group C.On the first day of stimulation,Jieyuyubaosolution (1 g·mL-1) was intragastrically administered (11.8 mL·kg-1) to the rats of group C at 9:00 am, once daily, and stopped giving at the fourth day of pregnancy (pd4) after being confirmed by vaginal smears.Purified water (11.8 mL·kg-1) was intragastrically administered to the rats of group A and group B at 9:00 am.All the rats were mated at the sex ratio of female：male =2：1 at 16:00 pm on the 21st day.The rats were sacrificed at the pd4.Maturity of endometrium pinopodes was assessed under transmission electron microscope.HOXa-10 mRNA content was evaluated by real-time fluorescence-PCR. Results The maturity of pinopodes was as follows: the maturity score of normal control group, model control group and experimental drug group was (2.7±0.3), (1.3±0.3), and (2.1±0.2), respectively, with significant difference between experimental drug group and model control group (P<0.05).HOXa-10 mRNA expression was significantly decreased in model control group (0.658±0.031) as compared with normal control group (0.965±0.102) (P<0.05). ConclusionJieyuyubaoprescription maybe increase the number and maturity of pinopodes through promoting HOXa-10 mRNA expression in endometrial epithelium cells, and then improve endometrial receptivity.

Jieyuyubaoprescription； Stress, chronic； Endometrial； Receptivity

2014-07-15

2014-12-15

耿會轉(zhuǎn)(1982-)，女，湖北武漢人，博士，研究方向：中醫(yī)輔助生殖。電話：(0)18571766686，E-mail:289589168@qq.com。

黎烈榮(1954-)，女，湖北武漢人，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，從事中醫(yī)婦科臨床醫(yī)療與教學(xué)科研工作。電話：(0)18062550013，E-mail：zhuanzhuan001@sina.com。

R289.5； R285.5

A

1004-0781(2015)06-0741-05