武偉 周洪偉 李國(guó)蘭 何樺波
miRNA-133b在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義
武偉 周洪偉 李國(guó)蘭 何樺波
目的 分析miRNA-133b表達(dá)水平的改變與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系,探討miRNA-133b在胃組織中表達(dá)的意義。方法 選擇手術(shù)治療的胃癌患者腫瘤組織63例為研究對(duì)象,取切緣正常胃黏膜為對(duì)照,設(shè)計(jì)針對(duì)miRNA-133b的特異性引物,應(yīng)用定量PCR方法檢測(cè)胃癌組織中miRNA-133b表達(dá)水平的變化。結(jié)合臨床病理資料對(duì)miRNA-133b的表達(dá)水平與腫瘤病理類型及臨床病理分期之間的關(guān)系進(jìn)行分析。檢測(cè)胃癌細(xì)胞株中miRNA-133b的表達(dá)水平變化。結(jié)果 miRNA-133b在胃癌組織中表達(dá)水平明顯低于正常胃黏膜組織[ΔCt:(-6.94±3.319)vs(-4.98±2.846),P<0.001]。其中45例miRNA-133b下調(diào)≥2.0倍,占71%;6例上調(diào)≥2.0倍,占10%;12例無(wú)明顯變化,占19%。miRNA-133b與腫瘤病理類型、腫瘤TNM分期無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。與正常胃黏膜細(xì)胞相比,在胃癌細(xì)胞株中miRNA-133b表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。 結(jié)論 在胃癌組織及胃癌細(xì)胞中,miRNA-133b的表達(dá)水平均有不同程度的降低,但其下降程度和比例與臨床特征無(wú)明顯相關(guān)性。miRNA-133b的表達(dá)水平下調(diào)可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。
miRNA-133b 胃癌 定量PCR
胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,全球每年胃癌新發(fā)病例近百萬(wàn),我國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)40萬(wàn)胃癌患者,占世界胃癌發(fā)病人數(shù)的42%[1]。探討胃癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)胃癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。近年來(lái),有研究證實(shí)了微小RNA(miRNA)在胃癌研究中的重要作用,miRNA是一種內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA,長(zhǎng)度約為16~28nt。miRNA在各種生長(zhǎng)分化及生理過(guò)程中都有廣泛的影響,參與基因組的穩(wěn)定及后天修飾,調(diào)節(jié)新陳代謝及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[2],目前已有研究表明miRNAs如 miRNA-21、miRNA-27a、miRNA-451、miRNA-143及miRNA-145等在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3-6],另外參考胃癌臨床樣本miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)miRNA-133b在胃癌中表達(dá)明顯下調(diào)[7]。本研究旨在觀察miRNA-133b在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用,以加深對(duì)胃癌生物學(xué)特點(diǎn)的認(rèn)識(shí),探尋胃癌預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)。
1.1 一般資料 經(jīng)杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者本人或家屬簽署知情同意書,收集我院普外科2012年6月至2014年6月期間經(jīng)胃癌根治術(shù)獲得的新鮮標(biāo)本共63例,經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)所得標(biāo)本為胃癌組織。所有患者在手術(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療等,此次是首次進(jìn)行胃癌根治術(shù)。按美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)胃癌TNM分期(2010年第7版)標(biāo)準(zhǔn)分期將胃癌組織分為為Ⅱ期(13例),Ⅲ期(40例),Ⅳ期(10例)。
1.2 方法
1.2.1 標(biāo)本采集及保存 腫瘤標(biāo)本取自腫瘤部位,陰性對(duì)照標(biāo)本取自距離腫瘤外緣5cm以外的正常胃黏膜組織。所有標(biāo)本取下后立即放入液氮中,隨后放在-80℃冰箱中保存。胃上皮細(xì)胞株GES-1和胃癌上皮細(xì)胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45由本實(shí)驗(yàn)室凍存,采用DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.2.2 總RNA提純 按Trizol試劑說(shuō)明書,采用Trizol一步法提取組織和細(xì)胞中總RNA,使用ND-1000紫外/可見光分光光度計(jì)進(jìn)行RNA質(zhì)量和濃度鑒定。用瓊脂電泳驗(yàn)證RNA的完整性。提取的RNA分裝保存于-80℃超低溫冰箱或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。
1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 以U6基因作內(nèi)參,轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作使用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Rotor-Gene 3000,Corbett Research,AUS)和PCRmix試劑盒(QPK-201,TOYOBO)檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。目的基因ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因的Ct值。引物序列見表1。
表1 miRNA-133b和U6的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增引物序列
1.3 miRNA-133b表達(dá)水平與臨床資料的相關(guān)分析 收集63例胃癌患者的基本人口學(xué)資料和相關(guān)臨床資料,包括年齡、性別、腫瘤大小、病理分型、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。根據(jù)以上資料對(duì)病例進(jìn)行分組,比較miRNA-133b相對(duì)表達(dá)倍數(shù)在不同組間的差異。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以或中位數(shù)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析或Friedman M檢驗(yàn)。
2.1 miRNA-133b在人胃癌組織中及胃癌細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)明顯降低 miRNA-133b在多數(shù)胃癌組織中表達(dá)水平明顯低于癌旁組織[ΔCt:(-6.94±3.319)vs(-4.98±2.846),P<0.001]。其中45例miRNA-133b下調(diào)≥2.0倍,占71%;6例上調(diào)≥2.0倍,占10%;12例無(wú)明顯變化,占19%。此外,分別培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜細(xì)胞,并提取RNA,定量PCR檢測(cè)miRNA-133b的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,miRNA-133b在胃癌細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)水平較胃正常上皮細(xì)胞內(nèi)亦明顯下降。在5個(gè)細(xì)胞株之間,BGC-823細(xì)胞中miRNA-133b表達(dá)水平最低,較GES-1細(xì)胞下降77.0%,AGS、HGC-27、MKN-28和MKN-45細(xì)胞中miRNA-133b表達(dá)水平與GES-1細(xì)胞比較,分別下降71.5%、68.3%、64.7%和50.8%(圖1),該結(jié)果與胃癌組織標(biāo)本中的檢測(cè)結(jié)果一致,提示miRNA-133b表達(dá)水平與胃癌發(fā)生有緊密聯(lián)系,miRNA-133b可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的作用。
圖1 胃癌細(xì)胞株中miR-133b表達(dá)水平分析
2.2 miRNA-133b表達(dá)水平與臨床資料的相關(guān)分析 63例胃癌患者中,與Ⅱ期胃癌相比,miRNA-133b表達(dá)水平在Ⅲ、Ⅳ期胃癌中也有較明顯的下降趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他特征如年齡、性別、腫瘤大小及病理分型等因素與miRNA-133b的表達(dá)水平無(wú)關(guān)(均P>0.05),見表2。
miRNA-133家族包括miRNA-133a和miRNA-133b兩個(gè)成員,miRNA-133a在基因組定位于第18號(hào)染色體,而miRNA-133b則定位于第6號(hào)染色體。PrimiRNA-133b是一個(gè)由119個(gè)堿基組成的發(fā)夾狀前體,經(jīng)過(guò)Drosha和Dicer酶的剪切,最終變成22nt成熟的miRNA。既往研究提示,miRNA-133a和miRNA-133b在小鼠肌肉發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平明顯升高,并且可促進(jìn)其分化成熟[8],被認(rèn)為是“肌肉組織特定的miRNA”。然而新近的研究顯示,miRNA-133b在正常人體組織中同樣表達(dá),而正常組織變成惡性腫瘤組織時(shí),其表達(dá)水平又發(fā)生明顯的改變。如在舌癌、膀胱癌、口腔上皮癌、肺癌、食管癌等[9-14],miRNA-133b表達(dá)水平明顯發(fā)生改變,并能影響腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究中,我們?cè)隗w內(nèi)和體外水平對(duì)63例胃癌中心組織及配對(duì)癌旁正常組織和多個(gè)胃癌細(xì)胞株中的miRNA-133b進(jìn)行相關(guān)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)多數(shù)胃癌組織中miRNA-133b的表達(dá)水平低于癌旁組織。另外,我們檢測(cè)了miRNA-133b在胃癌上皮細(xì)胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45中的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常黏膜細(xì)胞株GES-1相比,miRNA-133b在胃癌細(xì)胞株表達(dá)水平也明顯下調(diào)。因此,基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說(shuō)明無(wú)論在組織水平還是細(xì)胞水平,miRNA-133b的下調(diào)表達(dá)是一個(gè)普遍現(xiàn)象。
表2 胃癌病例臨床特征與miR-133b表達(dá)水平的相關(guān)分析
進(jìn)一步分析miRNA-133b的表達(dá)與胃癌的臨床病理因素的相關(guān)性顯示,miRNA-133b的表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小及胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。因此在臨床胃癌中,miRNA-133b表達(dá)水平下降的程度不能反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)行為,它不是一個(gè)理想的早期診斷及預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移潛能的指標(biāo)。然而由于本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本是近1~3年的手術(shù)切除標(biāo)本,還缺乏長(zhǎng)期跟蹤隨訪的研究資料,因此我們尚不能確定miRNA-133b是否與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。
本研究表明,miRNA-133b在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)普遍下調(diào),由此可認(rèn)為miRNA-133b在抑制胃癌發(fā)生、發(fā)展的某個(gè)或某些環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用;而在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡述。
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Expression of miRNA-133b in gastric cancer and its clinical significance
WUWei,ZHOU Hongwei,LI Guolan,et al.Department of General Surgery,Affiliated Hospital,Hangzhou Normal University,Hangzhou 300015,China
miRNA-133b Gastric cance Quantitative real-time PCR
2015-05-26)
(本文編輯:嚴(yán)瑋雯)
310015杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院普外科
【 Abstract】 Objective To investigate the exp ression of miR-133b in gastric cancer and its c linicopathological significance. Methods Sixty three specimens of p rimary gastric cancer and corresponding pericancerous gastric tissue were collected.The level of miRNA-133b was exam ined using quantitative real-time PCR assay(qPCR);the correlation between miRNA-133b level and c linicopathologic features were analyzed.The exp ression ofmiR-133b in 5 human gastric cancer cell lines was also exam ined by qPCR.Results Themean exp ression levelofmiRNA-133b was down-regulated in gastric cancer tissues compared with the ad jacent tissues[ΔCt:(-6.94±3.319)vs(-4.98±2.846),P<0.001].Among 63 pairs gastric cancer tissues,45 cases showed down-regulation of miRNA-133b>2 folds,12 cases had no d ifference,6 cases d isp layed up-regulation>2 folds.No significantassociations were detected between the levelofmiRNA-133b exp ression and TNM stage in gastric cancer(P>0.05).miRNA-133b was also marked ly down-regulated in gastric cancer cell lines. Conclusion miRNA-133b exp ression is down-regulated in gastric cancer tissue and human gastric cell lines.There is no association of miRNA-133b exp ression w ith TNM staging.