• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miRNA-133b在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

    2015-02-08 05:58:12武偉周洪偉李國(guó)蘭何樺波
    浙江醫(yī)學(xué) 2015年21期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株標(biāo)本胃癌

    武偉 周洪偉 李國(guó)蘭 何樺波

    miRNA-133b在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

    武偉 周洪偉 李國(guó)蘭 何樺波

    目的 分析miRNA-133b表達(dá)水平的改變與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系,探討miRNA-133b在胃組織中表達(dá)的意義。方法 選擇手術(shù)治療的胃癌患者腫瘤組織63例為研究對(duì)象,取切緣正常胃黏膜為對(duì)照,設(shè)計(jì)針對(duì)miRNA-133b的特異性引物,應(yīng)用定量PCR方法檢測(cè)胃癌組織中miRNA-133b表達(dá)水平的變化。結(jié)合臨床病理資料對(duì)miRNA-133b的表達(dá)水平與腫瘤病理類型及臨床病理分期之間的關(guān)系進(jìn)行分析。檢測(cè)胃癌細(xì)胞株中miRNA-133b的表達(dá)水平變化。結(jié)果 miRNA-133b在胃癌組織中表達(dá)水平明顯低于正常胃黏膜組織[ΔCt:(-6.94±3.319)vs(-4.98±2.846),P<0.001]。其中45例miRNA-133b下調(diào)≥2.0倍,占71%;6例上調(diào)≥2.0倍,占10%;12例無(wú)明顯變化,占19%。miRNA-133b與腫瘤病理類型、腫瘤TNM分期無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。與正常胃黏膜細(xì)胞相比,在胃癌細(xì)胞株中miRNA-133b表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。 結(jié)論 在胃癌組織及胃癌細(xì)胞中,miRNA-133b的表達(dá)水平均有不同程度的降低,但其下降程度和比例與臨床特征無(wú)明顯相關(guān)性。miRNA-133b的表達(dá)水平下調(diào)可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。

    miRNA-133b 胃癌 定量PCR

    胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,全球每年胃癌新發(fā)病例近百萬(wàn),我國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)40萬(wàn)胃癌患者,占世界胃癌發(fā)病人數(shù)的42%[1]。探討胃癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)胃癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。近年來(lái),有研究證實(shí)了微小RNA(miRNA)在胃癌研究中的重要作用,miRNA是一種內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA,長(zhǎng)度約為16~28nt。miRNA在各種生長(zhǎng)分化及生理過(guò)程中都有廣泛的影響,參與基因組的穩(wěn)定及后天修飾,調(diào)節(jié)新陳代謝及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[2],目前已有研究表明miRNAs如 miRNA-21、miRNA-27a、miRNA-451、miRNA-143及miRNA-145等在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3-6],另外參考胃癌臨床樣本miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)miRNA-133b在胃癌中表達(dá)明顯下調(diào)[7]。本研究旨在觀察miRNA-133b在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用,以加深對(duì)胃癌生物學(xué)特點(diǎn)的認(rèn)識(shí),探尋胃癌預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)。

    1 資料和方法

    1.1 一般資料 經(jīng)杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者本人或家屬簽署知情同意書,收集我院普外科2012年6月至2014年6月期間經(jīng)胃癌根治術(shù)獲得的新鮮標(biāo)本共63例,經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)所得標(biāo)本為胃癌組織。所有患者在手術(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療等,此次是首次進(jìn)行胃癌根治術(shù)。按美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)胃癌TNM分期(2010年第7版)標(biāo)準(zhǔn)分期將胃癌組織分為為Ⅱ期(13例),Ⅲ期(40例),Ⅳ期(10例)。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)本采集及保存 腫瘤標(biāo)本取自腫瘤部位,陰性對(duì)照標(biāo)本取自距離腫瘤外緣5cm以外的正常胃黏膜組織。所有標(biāo)本取下后立即放入液氮中,隨后放在-80℃冰箱中保存。胃上皮細(xì)胞株GES-1和胃癌上皮細(xì)胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45由本實(shí)驗(yàn)室凍存,采用DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2.2 總RNA提純 按Trizol試劑說(shuō)明書,采用Trizol一步法提取組織和細(xì)胞中總RNA,使用ND-1000紫外/可見光分光光度計(jì)進(jìn)行RNA質(zhì)量和濃度鑒定。用瓊脂電泳驗(yàn)證RNA的完整性。提取的RNA分裝保存于-80℃超低溫冰箱或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。

    1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 以U6基因作內(nèi)參,轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作使用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Rotor-Gene 3000,Corbett Research,AUS)和PCRmix試劑盒(QPK-201,TOYOBO)檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。目的基因ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因的Ct值。引物序列見表1。

    表1 miRNA-133b和U6的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增引物序列

    1.3 miRNA-133b表達(dá)水平與臨床資料的相關(guān)分析 收集63例胃癌患者的基本人口學(xué)資料和相關(guān)臨床資料,包括年齡、性別、腫瘤大小、病理分型、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。根據(jù)以上資料對(duì)病例進(jìn)行分組,比較miRNA-133b相對(duì)表達(dá)倍數(shù)在不同組間的差異。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以或中位數(shù)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析或Friedman M檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 miRNA-133b在人胃癌組織中及胃癌細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)明顯降低 miRNA-133b在多數(shù)胃癌組織中表達(dá)水平明顯低于癌旁組織[ΔCt:(-6.94±3.319)vs(-4.98±2.846),P<0.001]。其中45例miRNA-133b下調(diào)≥2.0倍,占71%;6例上調(diào)≥2.0倍,占10%;12例無(wú)明顯變化,占19%。此外,分別培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜細(xì)胞,并提取RNA,定量PCR檢測(cè)miRNA-133b的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,miRNA-133b在胃癌細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)水平較胃正常上皮細(xì)胞內(nèi)亦明顯下降。在5個(gè)細(xì)胞株之間,BGC-823細(xì)胞中miRNA-133b表達(dá)水平最低,較GES-1細(xì)胞下降77.0%,AGS、HGC-27、MKN-28和MKN-45細(xì)胞中miRNA-133b表達(dá)水平與GES-1細(xì)胞比較,分別下降71.5%、68.3%、64.7%和50.8%(圖1),該結(jié)果與胃癌組織標(biāo)本中的檢測(cè)結(jié)果一致,提示miRNA-133b表達(dá)水平與胃癌發(fā)生有緊密聯(lián)系,miRNA-133b可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的作用。

    圖1 胃癌細(xì)胞株中miR-133b表達(dá)水平分析

    2.2 miRNA-133b表達(dá)水平與臨床資料的相關(guān)分析 63例胃癌患者中,與Ⅱ期胃癌相比,miRNA-133b表達(dá)水平在Ⅲ、Ⅳ期胃癌中也有較明顯的下降趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其他特征如年齡、性別、腫瘤大小及病理分型等因素與miRNA-133b的表達(dá)水平無(wú)關(guān)(均P>0.05),見表2。

    3 討論

    miRNA-133家族包括miRNA-133a和miRNA-133b兩個(gè)成員,miRNA-133a在基因組定位于第18號(hào)染色體,而miRNA-133b則定位于第6號(hào)染色體。PrimiRNA-133b是一個(gè)由119個(gè)堿基組成的發(fā)夾狀前體,經(jīng)過(guò)Drosha和Dicer酶的剪切,最終變成22nt成熟的miRNA。既往研究提示,miRNA-133a和miRNA-133b在小鼠肌肉發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平明顯升高,并且可促進(jìn)其分化成熟[8],被認(rèn)為是“肌肉組織特定的miRNA”。然而新近的研究顯示,miRNA-133b在正常人體組織中同樣表達(dá),而正常組織變成惡性腫瘤組織時(shí),其表達(dá)水平又發(fā)生明顯的改變。如在舌癌、膀胱癌、口腔上皮癌、肺癌、食管癌等[9-14],miRNA-133b表達(dá)水平明顯發(fā)生改變,并能影響腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究中,我們?cè)隗w內(nèi)和體外水平對(duì)63例胃癌中心組織及配對(duì)癌旁正常組織和多個(gè)胃癌細(xì)胞株中的miRNA-133b進(jìn)行相關(guān)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)多數(shù)胃癌組織中miRNA-133b的表達(dá)水平低于癌旁組織。另外,我們檢測(cè)了miRNA-133b在胃癌上皮細(xì)胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45中的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常黏膜細(xì)胞株GES-1相比,miRNA-133b在胃癌細(xì)胞株表達(dá)水平也明顯下調(diào)。因此,基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說(shuō)明無(wú)論在組織水平還是細(xì)胞水平,miRNA-133b的下調(diào)表達(dá)是一個(gè)普遍現(xiàn)象。

    表2 胃癌病例臨床特征與miR-133b表達(dá)水平的相關(guān)分析

    進(jìn)一步分析miRNA-133b的表達(dá)與胃癌的臨床病理因素的相關(guān)性顯示,miRNA-133b的表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小及胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。因此在臨床胃癌中,miRNA-133b表達(dá)水平下降的程度不能反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)行為,它不是一個(gè)理想的早期診斷及預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移潛能的指標(biāo)。然而由于本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本是近1~3年的手術(shù)切除標(biāo)本,還缺乏長(zhǎng)期跟蹤隨訪的研究資料,因此我們尚不能確定miRNA-133b是否與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。

    本研究表明,miRNA-133b在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)普遍下調(diào),由此可認(rèn)為miRNA-133b在抑制胃癌發(fā)生、發(fā)展的某個(gè)或某些環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用;而在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡述。

    [1] 鄒小農(nóng),孫喜斌,陳萬(wàn)青,等.2003-2007年中國(guó)胃癌發(fā)病與死亡情況分析[J].腫瘤,2012,(2):109-114.

    [2] BushatiN,Cohen SM.MicroRNA functions[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2007,23:175-205.

    [3] Zhang Z Y,Li Z J,Gao C P,et al.miR-21 plays a pivotal role in gastric cancer pathogenesis and progression[J].Lab Invest,2008, 88(12):1358-1366.

    [4] Liu T,Tang H,Lang Y,et al.MicroRNA-27 a functions as an oncogene in gastric asenocarcinoma by targeting prohibitin[J]. Cancer Lett,2009,273(2):233-242.

    [5] Band res E,Bitarte N,Arias F,et al.MicroRNA-451 regulates macro-phage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J].Clin Cancer Res,2009,15 (7):2281-2290.

    [6] Takagi T,Iio A,Nakagawa Y,et al.Decreased expression of microRNA-143 and-145 in human gastric cancers[J].Oncology, 2009,77(1):12-21.

    [7] Akcakaya P,Ekelund S,Kolosenko I,et al.miR-185 and miR-133b deregulation is associated with overall survival and metastasis in gastrointestinal cancer[J].Int J Oncol,2011,39(2):311-318.

    [8] Koutsoulidou A,Mastroyiannopoulos N P,Furling D,et al.Expression of miR-1,miR-133a,miR-133b and miR-206 increases during development of human skeletal muscle[J].BMC Dev Biol, 2011,11(6):34.

    [9] Wong T S,Liu X B,Chung-Wai Ho A,et al.Identification of pyruvate kinase type M2 as potential oncoprotein in squamous cell carcinoma of tongue through microRNA profiling[J].Int J Cancer, 2008,123(2):251-257.

    [10] Nohata N,Hanazawa T,Enokida H,et al.microRNA-1/133a and microRNA-206/133b clusters:dysregulation and functional roles in human cancers[J].Oncotarget,2012,3(1):9-21.

    [11] Kozaki K,Imoto I,MogiS,et a l.Exploration of tumor-suppressive microRNAs silenced by DNA hypermethylation in oral cancer[J].Cancer Res,2008,68(7):2094-2105.

    [12] Kano M,Seki N,Kikkawa N,et al.miR-145,miR-133a andmiR-133b:Tum or-supp ressive miRNAs target FSCN1 in esophagealsquamous cell carcinom a[J].Int J Cancer,2010,127 (12):2804-2814.

    [13] Craw ford M,Batte K,Yu L,et a l.MicroRNA 133B targets prosurvival molecules MCL-1 and BCL2L2 in lung cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,388(3):483-489.

    [14] Ichimi T,Enokida H,Okuno Y,et al.Identification of novel microRNA targets based on microRNA signatures in bladder cancer[J].Int J Cancer,2009,125(2):345-352.

    Expression of miRNA-133b in gastric cancer and its clinical significance


    WUWei,ZHOU Hongwei,LI Guolan,et al.Department of General Surgery,Affiliated Hospital,Hangzhou Normal University,Hangzhou 300015,China

    miRNA-133b Gastric cance Quantitative real-time PCR

    2015-05-26)

    (本文編輯:嚴(yán)瑋雯)

    310015杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院普外科

    【 Abstract】 Objective To investigate the exp ression of miR-133b in gastric cancer and its c linicopathological significance. Methods Sixty three specimens of p rimary gastric cancer and corresponding pericancerous gastric tissue were collected.The level of miRNA-133b was exam ined using quantitative real-time PCR assay(qPCR);the correlation between miRNA-133b level and c linicopathologic features were analyzed.The exp ression ofmiR-133b in 5 human gastric cancer cell lines was also exam ined by qPCR.Results Themean exp ression levelofmiRNA-133b was down-regulated in gastric cancer tissues compared with the ad jacent tissues[ΔCt:(-6.94±3.319)vs(-4.98±2.846),P<0.001].Among 63 pairs gastric cancer tissues,45 cases showed down-regulation of miRNA-133b>2 folds,12 cases had no d ifference,6 cases d isp layed up-regulation>2 folds.No significantassociations were detected between the levelofmiRNA-133b exp ression and TNM stage in gastric cancer(P>0.05).miRNA-133b was also marked ly down-regulated in gastric cancer cell lines. Conclusion miRNA-133b exp ression is down-regulated in gastric cancer tissue and human gastric cell lines.There is no association of miRNA-133b exp ression w ith TNM staging.

    猜你喜歡
    細(xì)胞株標(biāo)本胃癌
    昆蟲標(biāo)本制作——以蝴蝶標(biāo)本為例
    鞏義丁香花園唐墓出土器物介紹
    COVID-19大便標(biāo)本采集器的設(shè)計(jì)及應(yīng)用
    P53及Ki67在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義
    胃癌組織中LKB1和VEGF-C的表達(dá)及其意義
    穩(wěn)定敲低MYH10基因細(xì)胞株的建立
    胃癌組織中VEGF和ILK的表達(dá)及意義
    Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
    穩(wěn)定抑制PAK2蛋白表達(dá)的HUH—7細(xì)胞株的建立
    CYP2E1基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的建立及鑒定
    91久久精品国产一区二区三区| 国产成人一区二区在线| 一边亲一边摸免费视频| 欧美97在线视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产欧美亚洲国产| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久久亚洲精品成人影院| 中文在线观看免费www的网站| 日韩大片免费观看网站| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 精品国产一区二区久久| a 毛片基地| 免费人妻精品一区二区三区视频| 99热这里只有是精品50| 黑人猛操日本美女一级片| 国产av码专区亚洲av| 男人添女人高潮全过程视频| 国产男女内射视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品国产国语对白av| 欧美精品一区二区大全| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品三级大全| 高清午夜精品一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 国产亚洲欧美精品永久| 女性生殖器流出的白浆| 新久久久久国产一级毛片| 国产亚洲91精品色在线| 国产av码专区亚洲av| 婷婷色综合www| 国产 一区精品| 少妇高潮的动态图| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品国产一区二区久久| 国产av一区二区精品久久| 在线观看美女被高潮喷水网站| 午夜日本视频在线| 欧美人与善性xxx| 成年人午夜在线观看视频| 九色成人免费人妻av| 亚洲av国产av综合av卡| 久久鲁丝午夜福利片| av在线app专区| 亚洲情色 制服丝袜| 精品国产一区二区久久| 永久网站在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 人体艺术视频欧美日本| 久久99热6这里只有精品| 男女边吃奶边做爰视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产免费福利视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 色5月婷婷丁香| 久久毛片免费看一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产69精品久久久久777片| 美女内射精品一级片tv| 91久久精品国产一区二区成人| 精品久久久久久久久av| 黄色日韩在线| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲精品成人av观看孕妇| 水蜜桃什么品种好| 丰满少妇做爰视频| 国产美女午夜福利| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲av成人精品一区久久| av视频免费观看在线观看| h日本视频在线播放| 国产男女超爽视频在线观看| 看免费成人av毛片| .国产精品久久| 亚洲精品,欧美精品| freevideosex欧美| 交换朋友夫妻互换小说| 久久国产乱子免费精品| 日韩制服骚丝袜av| 一级二级三级毛片免费看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 乱系列少妇在线播放| 亚洲不卡免费看| 国产精品不卡视频一区二区| 日本黄大片高清| 欧美bdsm另类| 在线观看三级黄色| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲美女视频黄频| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久鲁丝午夜福利片| 国产永久视频网站| 搡女人真爽免费视频火全软件| 精品午夜福利在线看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 一级毛片我不卡| 热re99久久精品国产66热6| 免费人成在线观看视频色| 看免费成人av毛片| 最新的欧美精品一区二区| 国产亚洲最大av| 韩国av在线不卡| 日韩成人伦理影院| 99热网站在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 人人妻人人看人人澡| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品免费大片| 欧美丝袜亚洲另类| 久久久久久久久久久免费av| 在线观看三级黄色| videossex国产| 丁香六月天网| 亚洲第一区二区三区不卡| 午夜久久久在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 97超碰精品成人国产| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 嘟嘟电影网在线观看| 国产在线免费精品| 亚洲国产欧美在线一区| 久久精品夜色国产| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲国产色片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 26uuu在线亚洲综合色| 精品少妇内射三级| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 9色porny在线观看| 在线观看人妻少妇| 两个人的视频大全免费| www.色视频.com| 成人影院久久| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美精品亚洲一区二区| 精品亚洲成国产av| 18+在线观看网站| 精品国产露脸久久av麻豆| 美女主播在线视频| 国产精品欧美亚洲77777| 能在线免费看毛片的网站| 免费黄色在线免费观看| 免费黄频网站在线观看国产| 99国产精品免费福利视频| 高清黄色对白视频在线免费看 | 三上悠亚av全集在线观看 | 国产精品女同一区二区软件| 国产黄色视频一区二区在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲在久久综合| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 激情五月婷婷亚洲| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 免费看av在线观看网站| 两个人免费观看高清视频 | 日韩制服骚丝袜av| 欧美精品国产亚洲| 91精品伊人久久大香线蕉| av女优亚洲男人天堂| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久久网色| 亚洲精品第二区| 国产精品欧美亚洲77777| 黑人高潮一二区| 一级毛片 在线播放| 国产亚洲91精品色在线| 精品久久国产蜜桃| 国产亚洲最大av| 日韩大片免费观看网站| 亚洲国产精品专区欧美| 中国三级夫妇交换| 亚洲精品国产成人久久av| 久久97久久精品| 麻豆成人午夜福利视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一个人免费看片子| 人妻一区二区av| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲av男天堂| av国产精品久久久久影院| 秋霞在线观看毛片| 国产av一区二区精品久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一本色道久久久久久精品综合| 97在线视频观看| 人人澡人人妻人| 精品少妇久久久久久888优播| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日韩强制内射视频| 免费观看无遮挡的男女| 中国国产av一级| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 最近手机中文字幕大全| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品蜜桃在线观看| 久久99热6这里只有精品| 亚洲国产精品国产精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久精品免费免费高清| 久久这里有精品视频免费| a级一级毛片免费在线观看| 久久久久国产网址| 一级,二级,三级黄色视频| 少妇人妻 视频| 观看美女的网站| 国产中年淑女户外野战色| 一级毛片aaaaaa免费看小| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲不卡免费看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲精品视频女| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲国产最新在线播放| 少妇精品久久久久久久| 久久人妻熟女aⅴ| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 老司机亚洲免费影院| 美女中出高潮动态图| 欧美日韩综合久久久久久| 男女边摸边吃奶| 日本午夜av视频| 亚洲av男天堂| 一边亲一边摸免费视频| 日韩强制内射视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 老司机影院成人| a 毛片基地| 欧美3d第一页| 国产精品.久久久| 各种免费的搞黄视频| 秋霞伦理黄片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 男人舔奶头视频| 一边亲一边摸免费视频| 日本欧美国产在线视频| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜影院在线不卡| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 有码 亚洲区| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 乱人伦中国视频| 在线观看av片永久免费下载| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 97超碰精品成人国产| 一级毛片 在线播放| 国产视频内射| 男的添女的下面高潮视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 丁香六月天网| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品熟女久久久久浪| 十八禁网站网址无遮挡 | 成年女人在线观看亚洲视频| 日本vs欧美在线观看视频 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲人与动物交配视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本av手机在线免费观看| 黄色欧美视频在线观看| 精品一区二区免费观看| 嘟嘟电影网在线观看| 我的老师免费观看完整版| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 免费看av在线观看网站| 亚洲av中文av极速乱| 性色avwww在线观看| 尾随美女入室| 黑人猛操日本美女一级片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品日本国产第一区| 免费大片黄手机在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 丝袜喷水一区| 日本vs欧美在线观看视频 | 各种免费的搞黄视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩av在线免费看完整版不卡| 人妻人人澡人人爽人人| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产高清国产精品国产三级| 久久婷婷青草| 亚洲国产欧美在线一区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久99蜜桃精品久久| 国产淫片久久久久久久久| www.av在线官网国产| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产男人的电影天堂91| 又爽又黄a免费视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 人人澡人人妻人| 成人二区视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 在线观看免费高清a一片| 又爽又黄a免费视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 下体分泌物呈黄色| 日本黄大片高清| 六月丁香七月| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费大片黄手机在线观看| 18禁在线播放成人免费| 97超碰精品成人国产| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 777米奇影视久久| 亚洲图色成人| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日本黄色片子视频| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 一级片'在线观看视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日韩制服骚丝袜av| 久久精品国产a三级三级三级| 国产真实伦视频高清在线观看| 51国产日韩欧美| 熟女电影av网| 国精品久久久久久国模美| 亚洲精品一二三| 亚洲内射少妇av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 免费看av在线观看网站| 久久国产乱子免费精品| 免费看日本二区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 最近2019中文字幕mv第一页| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲av免费高清在线观看| 熟女电影av网| 99久国产av精品国产电影| 欧美日韩综合久久久久久| 久久 成人 亚洲| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产综合精华液| 国产成人午夜福利电影在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲欧洲日产国产| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲av福利一区| 久久久国产欧美日韩av| 最近最新中文字幕免费大全7| 高清毛片免费看| 精品久久久久久久久亚洲| 日韩 亚洲 欧美在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 老司机亚洲免费影院| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| 波野结衣二区三区在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产熟女欧美一区二区| 我要看黄色一级片免费的| 久久国产精品大桥未久av | 在线观看av片永久免费下载| 秋霞在线观看毛片| av播播在线观看一区| 国产乱来视频区| 一区二区三区精品91| 亚洲精品第二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久精品夜色国产| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲成人一二三区av| 午夜av观看不卡| 丝袜在线中文字幕| 少妇人妻 视频| 国产爽快片一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 特大巨黑吊av在线直播| 视频区图区小说| 亚洲精品一区蜜桃| 成人国产av品久久久| 久久久欧美国产精品| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品国产av在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 日本黄色日本黄色录像| 久久国产亚洲av麻豆专区| 伦理电影大哥的女人| 热re99久久国产66热| 亚洲av二区三区四区| 嫩草影院入口| 国产熟女欧美一区二区| 曰老女人黄片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久精品国产亚洲网站| 日韩中字成人| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲av男天堂| 亚洲三级黄色毛片| 精品一区在线观看国产| 国产伦在线观看视频一区| 国产综合精华液| 免费大片黄手机在线观看| av卡一久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 能在线免费看毛片的网站| 九九在线视频观看精品| 下体分泌物呈黄色| 国产精品成人在线| 三上悠亚av全集在线观看 | av专区在线播放| 久久久久人妻精品一区果冻| 黄色配什么色好看| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲第一区二区三区不卡| 大香蕉97超碰在线| 22中文网久久字幕| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品无大码| 中文字幕制服av| 精品久久久久久电影网| 免费少妇av软件| 色哟哟·www| 18+在线观看网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 女性生殖器流出的白浆| 成人无遮挡网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品福利在线免费观看| 三上悠亚av全集在线观看 | 久久久欧美国产精品| 综合色丁香网| 色94色欧美一区二区| 亚洲四区av| 22中文网久久字幕| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 赤兔流量卡办理| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | av.在线天堂| 在线 av 中文字幕| av播播在线观看一区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 一级二级三级毛片免费看| 伦理电影大哥的女人| 一本大道久久a久久精品| 午夜福利视频精品| av.在线天堂| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美日韩视频精品一区| 久久久久久久久久久丰满| 国产精品人妻久久久影院| 午夜免费观看性视频| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美日本中文国产一区发布| 高清不卡的av网站| 日本免费在线观看一区| 精品人妻熟女av久视频| 日本午夜av视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲av福利一区| 熟女av电影| av卡一久久| 国产成人精品无人区| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美97在线视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 免费观看无遮挡的男女| 日本黄大片高清| 国产视频内射| 久久久久久伊人网av| 人妻 亚洲 视频| 国产黄片视频在线免费观看| 国产男女超爽视频在线观看| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品日韩av片在线观看| 在线观看人妻少妇| av一本久久久久| 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 国产黄频视频在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 午夜久久久在线观看| 国产成人一区二区在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产一级毛片在线| 十分钟在线观看高清视频www | 国产亚洲91精品色在线| 亚洲性久久影院| 嫩草影院入口| 亚洲精品自拍成人| 乱人伦中国视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日日啪夜夜撸| 成年av动漫网址| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩欧美精品免费久久| 永久免费av网站大全| 久久99热6这里只有精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲电影在线观看av| 一级黄片播放器| 精品国产一区二区久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 嫩草影院新地址| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲精品第二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久ye,这里只有精品| 久久久久久久久久久免费av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久国产乱子免费精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 校园人妻丝袜中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看| 如何舔出高潮| 国产男人的电影天堂91| 黄色配什么色好看| 水蜜桃什么品种好| 成人国产麻豆网| 国产欧美日韩精品一区二区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲电影在线观看av| 久久精品国产亚洲网站| 少妇人妻久久综合中文| 国产成人午夜福利电影在线观看| 99九九在线精品视频 | 亚洲美女搞黄在线观看| 久久久精品94久久精品| 色网站视频免费| 免费在线观看成人毛片| 99热网站在线观看| 尾随美女入室| 亚洲国产最新在线播放| 久久久午夜欧美精品| 精品亚洲成国产av| 午夜免费鲁丝| 在线看a的网站| 久热久热在线精品观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲国产日韩一区二区| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产精品国产av在线观看| 午夜老司机福利剧场| 国产极品天堂在线| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品久久久久久久电影| 丝袜在线中文字幕| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲成人av在线免费| 欧美3d第一页| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 男人爽女人下面视频在线观看| 69精品国产乱码久久久| 精品视频人人做人人爽| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲av中文av极速乱| 免费黄频网站在线观看国产| 午夜免费鲁丝| 久久热精品热| 精品亚洲成国产av| 免费观看性生交大片5| 两个人的视频大全免费| 乱人伦中国视频| 免费大片18禁| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| a级毛片免费高清观看在线播放| 99视频精品全部免费 在线| 免费看日本二区| 欧美另类一区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 成人国产av品久久久| 国产精品成人在线| 精品视频人人做人人爽| 成人无遮挡网站| 国产熟女午夜一区二区三区 | 亚洲av中文av极速乱| 99热这里只有是精品50| 国产成人a∨麻豆精品| av播播在线观看一区| 免费人成在线观看视频色| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲欧美精品专区久久|