Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)高通量檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

王穎，蒲江，齊乃松，文海若，王欣，胡燕平，宋捷，張海洲，王雪，*

（1. 中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心，藥物非臨床安全評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100176；2.羅氏研發(fā)中國(guó)有限公司，上海201203）

非遺傳毒性致癌物不通過(guò)作用于遺傳物質(zhì)產(chǎn)生致癌性，即不直接作用于DNA并產(chǎn)生相應(yīng)的遺傳損傷或突變，因此現(xiàn)有的遺傳毒性試驗(yàn)方法無(wú)法將其檢出。建立快速、簡(jiǎn)便、可靠的體外方法對(duì)非遺傳毒性致癌物進(jìn)行檢測(cè)是當(dāng)前安全性評(píng)價(jià)毒理學(xué)研究中亟待解決的問(wèn)題，在藥物早期研發(fā)階段意義重大。本研究室利用導(dǎo)入v-Has-ras基因的Bhas 42細(xì)胞系，在成功建立了細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)高通量檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上對(duì)Sasaki[1]建立的H2O2法進(jìn)行了驗(yàn)證與改進(jìn)，將試驗(yàn)結(jié)果量化從而實(shí)現(xiàn)了高通量篩選，提高了檢測(cè)效率和結(jié)果判定的客觀性。此外，我們將其應(yīng)用在化學(xué)物致癌性研究中，對(duì)染料木黃酮(genistein，GEN)的潛在非遺傳毒性致癌性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

采用Bhas 42細(xì)胞進(jìn)行的兩階段細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是近些年發(fā)展起來(lái)的致癌物體外早期篩查的新方法，其特點(diǎn)是方便、快捷、經(jīng)濟(jì)。該試驗(yàn)分啟動(dòng)試驗(yàn)和促癌試驗(yàn)兩部分。啟動(dòng)試驗(yàn)即在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期給予啟動(dòng)劑進(jìn)行短暫處理，引起細(xì)胞基因突變而誘發(fā)轉(zhuǎn)化，檢測(cè)受試物的遺傳毒性。而促癌試驗(yàn)是在細(xì)胞匯合后的生長(zhǎng)靜止期用促癌劑處理較長(zhǎng)的時(shí)間，阻斷細(xì)胞間通訊從而誘發(fā)轉(zhuǎn)化，檢測(cè)受試物的非遺傳毒性[2]。Bhas 42細(xì)胞是將v-Has-ras基因轉(zhuǎn)染到BALB/c 3T3細(xì)胞中建成的細(xì)胞系，被視為已處于啟動(dòng)狀態(tài)，可根據(jù)細(xì)胞接種濃度、藥物作用時(shí)間點(diǎn)和作用時(shí)間的不同[3]，將遺傳毒性和非遺傳毒性致癌物的檢測(cè)過(guò)程完全分開(kāi)。因此該方法既可用于檢測(cè)遺傳毒性致癌物，也可檢出非遺傳毒性致癌物。該方法將試驗(yàn)周期縮短至3周[2，4]， 可在短期內(nèi)獲得篩查結(jié)果，并對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展不同階段的細(xì)胞生物學(xué)特征進(jìn)行研究[5-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞Bhas 42細(xì)胞系(日本健康科學(xué)基金會(huì)健康科學(xué)研究資源庫(kù)，編號(hào)JCRB0149)由日本食品藥品安全中心秦野研究所Sasaki博士饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑和儀器3-甲基膽蒽(3-methylcholanthrene，3-MCA，100 mg)，佛波醇12-十四酸13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA， 10 mg)，GEN(25 mg)，均購(gòu)自Sigma； EMEM培養(yǎng)基(Eagle’s minimum essential m eduim)，D MEM/F12培養(yǎng)基(Dulbecco’s m odified Eagle’s medium/ Ham’s F12)，胎牛血清(批號(hào)737443) 均購(gòu)自Gibco；H2O2(30%)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8)，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；SPECTRA max-PLUS型酶標(biāo)儀，購(gòu)自Molecular Devices公司。

1.1.3 試劑配制啟動(dòng)試驗(yàn)和促癌試驗(yàn)分別以3-MCA和TPA為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO為陰性對(duì)照。3-MCA、TPA、染料木黃酮(GEN)均以DMSO為溶劑，配制成高濃度懸液儲(chǔ)備液，-20 ℃條件下凍存。參照文獻(xiàn)[4]，3-MCA和TPA使用的終濃度為1 μg/mL和50 ng/mL，用配制1000×的儲(chǔ)備液(3-MCA：1 mg/mL；TPA：50 μg/mL)進(jìn)行稀釋。GEN儲(chǔ)備液的配制濃度為30 mg/mL。DMSO的終濃度為0.1%。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與凍存試驗(yàn)前擴(kuò)增凍存Bhas 42細(xì)胞。Bhas 42細(xì)胞用含有15%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，用PBS清洗后用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至5×105/mL，重懸于新鮮的含5% DMSO、15%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基中，將細(xì)胞懸液分裝于凍存管中，每管0.5 mL，并凍存于液氮中。在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)時(shí)，為降低細(xì)胞的自發(fā)轉(zhuǎn)發(fā)率，每次進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)都需要重新復(fù)蘇1個(gè)凍存管進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 高通量檢測(cè)方法[1，4]轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的結(jié)果判定采用細(xì)胞灶法和H2O2法兩種方法。兩種方法分別進(jìn)行啟動(dòng)試驗(yàn)和促癌試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置的陽(yáng)性、陰性組(H2O2法加設(shè)空白對(duì)照組)，每組1個(gè)96孔板。

細(xì)胞灶法是以接種當(dāng)日為第0天，消化細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至4×103/mL，啟動(dòng)試驗(yàn)和促癌試驗(yàn)分別以每孔200、400個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，24 h后啟動(dòng)試驗(yàn)組將細(xì)胞暴露于受試物，處理3 d后更換新鮮培養(yǎng)基。促癌試驗(yàn)組于第4天更換為含TPA的培養(yǎng)基，作用10 d，每3 d換一次液，第14天更換為不含受試物的新鮮培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)至第21天，用甲醇固定10 min，5% Giemsa染色30 min，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化灶個(gè)數(shù)。

H2O2法是在細(xì)胞灶法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。連續(xù)培養(yǎng)至第19天時(shí)每孔加入50 μL 0.0016%的H2O2，共同培養(yǎng)24 h。第20天加入CCK-8(終濃度為5%)染色，培養(yǎng)4 h后，測(cè)定450 nm下的吸光度。之后用0.25%戊二醛固定，5% Giemsa染色，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化灶。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)在進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)前，需要進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)以確定受試物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。啟動(dòng)試驗(yàn)組和促癌試驗(yàn)組分別以每孔200和400個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，24 h后啟動(dòng)試驗(yàn)組不換液，配制含二倍終濃度GEN的培養(yǎng)基，使GEN以30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01 μg/mL的終濃度處理細(xì)胞，第4天更換不含藥的新鮮培養(yǎng)基。促癌試驗(yàn)組于第4天時(shí)更換為含有不同濃度GEN的培養(yǎng)基，同樣處理3 d。第7天采用結(jié)晶紫(crystal violet，CV)染色并于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)率，確定最適藥物濃度。每個(gè)濃度至少8個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置只含有培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔。相對(duì)生長(zhǎng)率計(jì)算方法如下式：

相對(duì)生長(zhǎng)率(%)=[D(570)處理組-D(570)空白組]/[D(570)陰性組-D(570)空白組]×100%

D(570)處理組為藥物處理孔的吸光度；D(570)空白組為空白對(duì)照孔的吸光度；D(570)陰性組為陰性對(duì)照孔的吸 光度。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果選定5個(gè)濃度進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，具體操作方法同1.2.2中的H2O2法。進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的同時(shí)也要對(duì)選定的藥物濃度進(jìn)行并行的細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)，每個(gè)濃度至少采用一塊96孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)化檢測(cè)，且至少8個(gè)孔用于并行的細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)，并設(shè)立陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1、2。

1.3 結(jié)果判定方法

細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶的形態(tài)特征表現(xiàn)為：①多于100個(gè)細(xì)胞；②紡錘形細(xì)胞不同于接觸抑制性單層細(xì)胞(紡錘形的)；③強(qiáng)嗜堿性染料(嗜堿的)；④在轉(zhuǎn)化灶的邊緣(交叉)細(xì)胞隨機(jī)定位；⑤密集的多層排列的細(xì)胞(堆積)；⑥侵入性生長(zhǎng)到周邊接觸抑制性細(xì)胞的單層內(nèi)。對(duì)96孔板中含有細(xì)胞灶的孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，表示為孔/板。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理。細(xì)胞灶法的結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)，H2O2法的結(jié)果采用t檢驗(yàn)。GEN各濃度的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果采用Dunnett-t檢驗(yàn)[1，4，9]，當(dāng)受試物存在兩個(gè)或兩個(gè)以上濃度組的D(450)相對(duì)于陰性對(duì)照組有顯著性差異，則該受試物是陽(yáng)性的。當(dāng)受試物存在一個(gè)或不連續(xù)濃度組的D(450)相對(duì)于陰性對(duì)照組有顯著性差異，則該受試物是可疑的。當(dāng)受試物各個(gè)濃度組的D(450)相對(duì)于陰性對(duì)照組均無(wú)顯著性差異，則該受試物是陰性的。

2 結(jié)果

2.1 高通量檢測(cè)方法的建立

經(jīng)H2O2處理前，可在鏡下觀察到啟動(dòng)試驗(yàn)3-MCA組和促癌試驗(yàn)TPA組細(xì)胞形態(tài)由正常的長(zhǎng)梭形變?yōu)槎趟鬆睿蕪?fù)層生長(zhǎng)，細(xì)胞之間失去接觸抑制并形成轉(zhuǎn)化灶，轉(zhuǎn)化灶邊緣細(xì)胞隨機(jī)排列，形成交叉和旋渦。而啟動(dòng)試驗(yàn)DMSO組和促癌試驗(yàn)DMSO組的細(xì)胞大小、形態(tài)基本一致并表現(xiàn)出良好的接觸性抑制，僅見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn)化灶較小。H2O2作用24 h后，大部分正常細(xì)胞皺縮成圓形并死亡，該處理對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞無(wú)顯著影響。細(xì)胞灶法在第21天進(jìn)行固定染色。啟動(dòng)試驗(yàn)3-MCA組和促癌試驗(yàn)TPA組可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)變化，失去接觸抑制，形成交叉和旋渦。細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化灶較明顯。而啟動(dòng)試驗(yàn)DMSO組和促癌試驗(yàn)DMSO組只有極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn)化效果不明顯，大部分細(xì)胞形態(tài)正常，呈長(zhǎng)梭形(見(jiàn)圖3)。

計(jì)數(shù)各組轉(zhuǎn)化灶并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在細(xì)胞灶法中，啟動(dòng)試驗(yàn)3-MCA組、促癌試驗(yàn)TPA組的轉(zhuǎn)化灶個(gè)數(shù)分別與啟動(dòng)、促癌試驗(yàn)DMSO組相比明顯升高(P＜0.01)。在H2O2法中，啟動(dòng)試驗(yàn)3-MCA組、促癌試驗(yàn)TPA組的轉(zhuǎn)化灶個(gè)數(shù)、D(450)分別與啟動(dòng)、促癌試驗(yàn)DMSO組相比均明顯升高(卡方檢驗(yàn)，P＜0.01)。此外H2O2法試驗(yàn)組利用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性組的D(450)相對(duì)于陰性組也提示顯著性差異( t 檢驗(yàn)，P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞灶法和H O法細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果(n=96，±s)22

表1 細(xì)胞灶法和H O法細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果(n=96，±s)22

a：卡方檢驗(yàn)，與DMSO組比較，P＜0.01； b：t 檢驗(yàn)，與DMSO組比較，P＜0.01.

細(xì)胞灶法H2 O2法組別受試物終濃度轉(zhuǎn)化灶(個(gè)/孔)轉(zhuǎn)化灶(個(gè)/孔)D(450)啟動(dòng)試驗(yàn)DMSO 0.10%13120.267±0.3243-MCA 1 μg/mL 53a 40a 0.609±0.396b促癌試驗(yàn)DMSO 0.10%18150.218±0.356 TPA 50 ng/mL 40a 50a 0.704±0.550b

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)

選擇不同濃度的GEN處理細(xì)胞，第7天通過(guò)CV染色結(jié)果計(jì)算其相對(duì)生長(zhǎng)率，啟動(dòng)試驗(yàn)和促癌試驗(yàn)各組數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。基于生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)立5個(gè)濃度等級(jí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在啟動(dòng)試驗(yàn)中，藥物濃度等級(jí)覆蓋范圍從最高毒性(相對(duì)于對(duì)照組的生存率小于20%)到幾乎無(wú)毒性。理想狀態(tài)下在致癌檢測(cè)中所作的評(píng)價(jià)[4]，一個(gè)濃度等級(jí)低于無(wú)作用之劑量(no-observed effect level，NOEL)，兩個(gè)濃度等級(jí)介于NOEL與IC50之間，兩個(gè)濃度等級(jí)介于IC50和IC90之間。由于在啟動(dòng)試驗(yàn)中，藥物濃度大于1 μg/mL幾乎沒(méi)有毒性，低于1 μg/mL時(shí)相對(duì)生長(zhǎng)率急劇下降且低于20%，因此選擇0.03、0.1、0.3、1、3 μg/mL作為轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中啟動(dòng)試驗(yàn)組藥物作用濃度。在促癌試驗(yàn)中，所選擇的檢測(cè)濃度范圍覆蓋從對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有生長(zhǎng)促進(jìn)作用的濃度到對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有作用的濃度。由表2可看出，促癌試驗(yàn)中GEN對(duì)細(xì)胞具有較弱的促生長(zhǎng)作用，濃度為0.03、0.1、0.3、1、3 μg/mL時(shí)的相對(duì)生長(zhǎng)率均大于50%，因此選擇其作為轉(zhuǎn)化試驗(yàn)促癌試驗(yàn)組藥物作用濃度。

表2 染料木黃酮(GEN)對(duì)Bhas 42細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(n=8)

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

于第7天測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)率和第20天測(cè)得的D(450)結(jié)果見(jiàn)圖4。并采用Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。啟動(dòng)試驗(yàn)GEN各濃度組D(450)相對(duì)于啟動(dòng)試驗(yàn)DMSO組均無(wú)明顯差異。而當(dāng)促癌試驗(yàn)GEN終濃度為0.03、1、3 μg/mL時(shí)相對(duì)促癌試驗(yàn)DMSO組明顯升高(P＜0.01)。表明GEN無(wú)遺傳毒性，而具有非遺傳毒性。

3 討論

非遺傳毒性致癌物的相關(guān)檢測(cè)方法近年來(lái)發(fā)展迅速，如針對(duì)細(xì)胞間隙連接通訊障礙、EB病毒早期抗原(EBV-EA)的表達(dá)、基因表達(dá)譜的改變等機(jī)制或生物標(biāo)志物對(duì)非遺傳毒性致癌物進(jìn)行檢測(cè)。然而以上方法目前均未形成標(biāo)準(zhǔn)化方法，應(yīng)用尚不廣泛。

雖然通過(guò)觀察轉(zhuǎn)化灶判定細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果的細(xì)胞灶法已經(jīng)獲得廣泛認(rèn)可，但因較為費(fèi)時(shí)和主觀性的缺點(diǎn)大大限制了該方法的發(fā)展。為快速而客觀地評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化效率，Sasaki[1]對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了改良，采用分光光度法而非人工計(jì)數(shù)法來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)化效率(即H2O2法)。如Bhas 42細(xì)胞的培養(yǎng)皿中含有轉(zhuǎn)化灶，H2O2處理可選擇性殺死正常細(xì)胞，但對(duì)轉(zhuǎn)化灶無(wú)明顯影響。H2O2法可結(jié)合自動(dòng)化儀器的使用實(shí)現(xiàn)高通量選擇，跳過(guò)固定、染色、洗板、曬干等一系列過(guò)程。實(shí)驗(yàn)人員也不必經(jīng)過(guò)鑒定轉(zhuǎn)化灶的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)便可完成結(jié)果的判定。結(jié)果更為客觀，且極大地節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。

本研究對(duì)Sasaki建立的H2O2法進(jìn)行了驗(yàn)證與改進(jìn)，將H2O2作用時(shí)間點(diǎn)從第21天改至第19天，進(jìn)一步縮短試驗(yàn)周期，并對(duì)H2O2濃度和CCK-8的作用時(shí)間根據(jù)實(shí)際條件進(jìn)行了調(diào)整。為驗(yàn)證該試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，測(cè)定D(450)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行戊二醛固定和Giemsa染色。比較D(450)可發(fā)現(xiàn)，含有轉(zhuǎn)化灶的孔D(450)較高，而沒(méi)有轉(zhuǎn)化灶的孔D(450)很低甚至接近空白孔，具體的選擇機(jī)制還有待深入研究。但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析獲得的結(jié)果與細(xì)胞灶法結(jié)果基本一致，驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性與可靠性。

本研究室成功建立了Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)高通量檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用在非遺傳毒性致癌物研究中。植物雌激素是植物中具有弱雌激素作用的化合物，可通過(guò)與甾體雌激素受體以低親和度結(jié)合而發(fā)揮弱的雌激素樣效應(yīng)，具有組織特異性，在不同組織中發(fā)揮雌激素或抗雌激素作用。GEN是大豆異黃酮的一種苷元形式，是大豆異黃酮中最有效的功能成分[10]。在結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物的雌激素雌二醇相似，具有雌激素的活性基團(tuán)二酚羥基，與雌激素受體的親和力比雌二醇低100倍。迄今為止，植物雌激素的抗腫瘤、預(yù)防骨質(zhì)疏松、減輕更年期綜合癥等有益作用及機(jī)制逐漸被發(fā)現(xiàn)[11]。許多人除在飲食中攝入外，還主動(dòng)攝入含有植物雌激素的保健品，GEN的安全性日益引起人們的關(guān)注。微團(tuán)培養(yǎng)模型研究表明GEN是強(qiáng)致畸物[12]，且孕酮等雌激素有促進(jìn)Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用[1]，是非遺傳毒性致癌物。本研究應(yīng)用Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)檢測(cè)GEN的細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用，以評(píng)價(jià)GEN的遺傳毒性和非遺傳毒性。細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明GEN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)GEN濃度高于3 μg/mL時(shí)，表現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。兩次生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明兩次試驗(yàn)細(xì)胞的狀態(tài)基本一致，驗(yàn)證了試驗(yàn)的可重復(fù)性。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，GEN在啟動(dòng)試驗(yàn)中各劑量組和對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明GEN無(wú)遺傳毒性。而在促癌試驗(yàn)中，有3個(gè)濃度相對(duì)對(duì)照組差異顯著，且有兩個(gè)為連續(xù)濃度，表明在本實(shí)驗(yàn)條件及劑量范圍內(nèi)，GEN在促癌階段可促進(jìn)Bhas 42細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。因此初步認(rèn)為GEN具有非遺傳毒性，屬于非遺傳毒性致癌物。目前對(duì)GEN的促癌機(jī)制尚不明確。有文獻(xiàn)報(bào)道[13]GEN在人體可能達(dá)到的血清濃度下，可抑制HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞間隙連接通訊功能，提示在一定條件下可能有促癌作用。另一項(xiàng)研究則提示[14]GEN對(duì)N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)所誘發(fā)的NIH 3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有明顯的抑制作用，推測(cè)其可能是化學(xué)致癌過(guò)程的抑制劑。GEN與苯并[e]芘共同作用時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率高中于單獨(dú)使用苯并[e]芘，但與TPA共同作用時(shí)，抑制3-MCA誘導(dǎo)的BALB/c-3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化[15]，推測(cè)GEN既可誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，又可抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，具有雙重性。

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