大棗和葛根對酒精性肝病小鼠肝功能和肝組織SIRT1表達(dá)的影響

申軍華，張 云，李芳芳

(1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056000；2.中國五礦集團(tuán)邯鄲職工醫(yī)院，河北 邯鄲 056802；3.河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017)

大棗和葛根對酒精性肝病小鼠肝功能和肝組織SIRT1表達(dá)的影響

申軍華1，張 云2，李芳芳3

(1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056000；2.中國五礦集團(tuán)邯鄲職工醫(yī)院，河北 邯鄲 056802；3.河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017)

目的 探討大棗和葛根對酒精性肝病小鼠肝功能和肝組織SIRT1表達(dá)的影響。方法 114只昆明種小鼠隨機(jī)分為對照組24只、模型組90只，模型組給予54度紅星二鍋頭8 mL/(kg·d)灌胃4周后，2組各隨機(jī)取8只殺死取材，檢測小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和肝臟SIRT1蛋白表達(dá)水平，并觀察肝臟病理改變情況；模型組剩余82只小鼠再次隨機(jī)分為病理組22只、大棗組20只、葛根組20只和聯(lián)苯雙酯組20只，均繼續(xù)隔日灌胃54度紅星二鍋頭8 mL/(kg·d)。在此基礎(chǔ)上，病理組給予蒸餾水0.01 mL/(kg·d)灌胃，大棗組給予大棗提取物0.01 mL/(kg·d)灌胃，葛根組給予葛根提取物0.01 mL/(kg·d)灌胃，聯(lián)苯雙酯組給予聯(lián)苯雙酯0.01 mL/(kg·d)灌胃，觀察灌胃4周、8周、12周小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、肝臟病理切片和肝臟SIRT1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與病理組比較，大棗組、葛根組血清AST、ALT水平均下降，肝組織病理改善，肝組織 SIRT1蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 大棗和葛根均對酒精性肝病有一定療效。

大棗；葛根；酒精性肝??；SIRT1

酒精性肝病是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟損害，根據(jù)病變程度的不同可分為輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化[1]。在肝病的早期常無特異性表現(xiàn)，故不易早期發(fā)現(xiàn)，故探索一種簡便易行的方法預(yù)防和治療酒精性肝病一直是研究的熱點(diǎn)。很多學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對嚙齒類哺乳動物小白鼠長期灌酒也可以導(dǎo)致與人類相似的病變。本研究模仿人類飲酒的方法復(fù)制小鼠酒精性肝病模型，觀察了大棗和葛根對酒精性肝病的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 2～3周齡昆明種清潔級小鼠114只，體質(zhì)量22～25 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物合格證書號：123061號。普通全價飼料喂養(yǎng)，飼料購于河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥物 精選阜平大棗，去核80℃ 4 h焙干，藥物粉碎機(jī)粉碎呈粉末狀，取10g棗粉，用50%乙醇350mL浸泡12 h，離心去沉淀留上清液，高溫煮沸濃縮至50mL(0.2 g/mL即原液)，-80℃儲存?zhèn)溆谩Ｈ?0mL原液加蒸餾水90mL稀釋成0.02 g/mL的濃度,4 ℃儲存?zhèn)溆肹2-3]。葛根20g，購自同仁堂，高壓煮(125 ℃)3次，每次20min，加水80～100mL，留取藥液，3 500r/min離心3 min，留取上清液，煮沸濃縮至60mL(相當(dāng)于生藥333 mg/mL即原液)，-80℃儲存?zhèn)溆?，取該藥?0mL加水190mL， 稀釋成16.65 mg/mL的濃度。

1.3 試劑 轉(zhuǎn)氨酶試劑盒，長春匯力生物技術(shù)有限公司；TNF-α試劑盒，美國Fermentas公司；免疫熒光二抗，美國基因公司；54度紅星二鍋頭，生產(chǎn)批號：20101213，北京紅星二鍋頭股份公司;SIRT1及β-actin抗體,上海生物工程公司。

1.4 動物分組 2～3周齡的昆明種清潔級小鼠114只常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，溫度(22±2)℃，濕度(56±5)%,然后隨機(jī)分為對照組24只和模型組90只，模型組給予54度紅星二鍋頭8 mL/(kg·d)灌胃4周后，2組各隨機(jī)取8只殺死取材以備，檢測各項(xiàng)指標(biāo)變化；模型組剩余82只小鼠再次隨機(jī)分為病理組22只、大棗組20只、葛根組20只、聯(lián)苯雙酯組20只，均繼續(xù)隔日灌胃54度紅星二鍋頭8 mL/(kg·d)。在此基礎(chǔ)上，病理組給予蒸餾水0.01 mL/(kg·d)灌胃；大棗組給予大棗提取物0.01 mL/(kg·d)[相當(dāng)于大棗0.02 g/(kg·d)]灌胃，葛根組給予葛根提取物0.01 mL/(kg·d)[相當(dāng)于葛根原藥材0.01 g/(kg·d)]灌胃，聯(lián)苯雙酯組給予聯(lián)苯雙酯0.01 mL/(kg·d)[相當(dāng)于聯(lián)苯雙酯藥物7.5 mg/(kg·d)]灌胃。

1.5 取材 分別在灌胃的8周和12周分批處死小鼠取材。動物處死之前禁食12 h，股靜脈采血后頸椎脫臼處死小鼠，快速分離肝臟，取肝左外側(cè)葉用10%多聚甲醛固定。其余肝組織迅速放入液氮充分固定后，移入EP管內(nèi)-80℃冰箱內(nèi)儲存。采集的血液3 000g/min離心10min，上層血清移入清潔EP管內(nèi)備用。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 血清ALT、AST含量 血清分離后選用未溶血的標(biāo)本，應(yīng)用轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒檢測各組血清ALT、AST含量。

1.6.2 肝組織病理 肝組織經(jīng)10%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)脫蠟、包埋、石蠟切片(5 μm)，分別行HE和Masson染色。HE染色步驟：石蠟切片(5 μm)，二甲苯脫蠟10min×3梯度乙醇脫蠟至水，蘇木精染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化30s，1%氨水返藍(lán)30s，蒸餾水洗4 min，伊紅染色1 min，蒸餾水沖洗1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明10min×3，中性樹膠封片，顯微鏡觀察病理結(jié)果。Masson染色步驟：石蠟切片(5 μm)，二甲苯脫蠟10min×3，梯度乙醇脫蠟至水，蒸餾水沖洗2 min，蘇木精染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化30s，蒸餾水沖洗3 min，酸性麗春紅品紅染色5 min，蒸餾水沖洗1 min，0.2%冰醋酸30s，1%磷鉬酸2 min，1%亮綠2 min，0.2%冰醋酸30s，梯度乙醇脫蠟至水，二甲苯透明15 min×2，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6.3 目的蛋白的測定 約100mg組織標(biāo)本加入預(yù)冷的蛋白勻漿液(pH 7.5 Tris-Cl 50mmol/L,NaCl 100mmol/L, 1% NP40,1% Xtriton,0.5%脫氧膽酸鈉，Leupeptin 2 μg/mL，1% SDS,EDTA 2 mmol/L,PMSF 1 mmol/L，HEPES 50mmol/L,原釩酸鈉100mmol/L)1 mL，在冰浴中勻漿2 min，移入EP管，混勻后冰上放置30min，4 ℃ 10000g離心15 min，取上清，蛋白含量的測定采用Lowry法，以每毫升樣品中的毫克蛋白量(mg/mL)表示。樣品與2×上樣緩沖液(pH 6.8 Tris-Cl 100mmol/L,4%SDS,0.2%溴酚藍(lán)，20%甘油，β-巰基乙醇200mmol/L)1∶1的比例混勻煮沸5 min，冷卻至室溫，按500μg/孔、200μg/孔進(jìn)行SDS-PAGE,分離膠的濃度為10%。恒壓90V,待樣品完全進(jìn)入分離膠后改為120V,直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，斷開電源。冰水浴轉(zhuǎn)膜，用0.2 μm NC膜，恒壓80V，β-actin 2 h，SIRT1 4.5 h(上樣200μg/孔)， 取出膜用TBST沖洗，用1×TBS配制5%脫脂奶粉，室溫輕搖封閉2 h，用TBST按比例稀釋一抗(SIRT1 1∶200，βactin 1∶100),向膜的正面滴加一抗，濕盒4 ℃過夜；0.5%TBST漂洗液洗膜10min×3,用TBST稀釋二抗(1∶5 000)，在膜的正面滴加二抗，室溫1 h，用0.1%TBST漂洗液洗膜10min×3,最后一遍用TBS洗膜10min；然后在Odssey紅外掃描儀器上讀取圖像。以βactin作為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 含乙醇液體灌胃初期小鼠出現(xiàn)嗜睡，食欲較差，進(jìn)食減少，反應(yīng)遲鈍，短時間共濟(jì)失調(diào)，易激惹，皮毛光澤差等，約4周上述癥狀逐漸改善，對照組無上述改變。病理組共4只小鼠實(shí)驗(yàn)過程中死亡，病死率為4%，多為急性和亞急性死亡，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)多為急性胃擴(kuò)張、窒息等；對照組無一例死亡。

2.2 體質(zhì)量變化 灌胃4周、8周時各組小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃12周時，與對照組相比，其余4組小鼠體質(zhì)量均明顯減輕(P均<0.05)；與病理組比較，大棗組、葛根組、聯(lián)苯雙酯組小鼠體質(zhì)量無明顯變化(P均>0.05)。見表1。

2.3 血清AST和ALT比較 4周時，與對照組比較，病理組血清ALT、AST無明顯升高(P均>0.05)。8周和12周時，與對照組比較，病理組血清ALT、AST明顯升高(P均<0.05)；與病理組比較，大棗組、葛根組和聯(lián)苯雙酯組血清ALT、AST均明顯降低(P均<0.05)。見表2。

2.4 肝組織病理變化 對照組小鼠肝臟組織HE染色顯示肝細(xì)胞以中央靜脈為中心成放射狀排列，肝小葉輪廓清晰，肝索排列整齊，細(xì)胞內(nèi)脂肪滴少見，見圖1。4周時病理組HE染色顯示匯管區(qū)、肝竇內(nèi)、中央靜脈的周圍血液淤滯，部分細(xì)胞成不同程度的水樣變性，重者細(xì)胞體腫大或成球形，胞漿透明，肝竇受壓，肝索紊亂，肝小葉可見少量脂滴集聚，小葉內(nèi)見少量點(diǎn)狀壞死，見圖2。8周時病理組HE染色顯示肝組織中央靜脈周圍血液淤滯，較4周時明顯加重，肝細(xì)胞空泡樣變性，多數(shù)細(xì)胞腫大成球形，胞漿透明；脂肪變性較4周時明顯增多，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不一的脂滴，肝細(xì)胞壞死情況較4周時明顯加重，并伴有炎細(xì)胞浸潤，見圖3。8周時大棗組、葛根組、聯(lián)苯雙酯組肝組織上述病理變化均存在，但表現(xiàn)較病理組輕，細(xì)胞有少量脂肪變性，但較對照組明顯減少見，圖4～6。12周時病理組HE染色見肝臟匯管區(qū)、肝小葉中央靜脈周圍、肝竇內(nèi)可見大量的血液淤滯，肝細(xì)胞空泡變性增多，較多量的肝細(xì)胞胞腫大呈球形，胞漿透明；肝小葉點(diǎn)狀壞死及小灶狀壞死增多，可見炎細(xì)胞浸潤，某些壞死區(qū)內(nèi)可見纖維細(xì)胞增生，見圖7。12周時大棗組、葛根組、聯(lián)苯雙酯組上述改變均較病理組輕，細(xì)胞內(nèi)脂肪變較少，見圖8～10。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化比較

注：①與對照組比較，P<0.05。

表2 各組小鼠血清AST、ALT比較

圖1 對照組HE染色表現(xiàn)

圖2 4周時病理組HE染色表現(xiàn)

2.5 SIRT1表達(dá)情況 4周時，與對照組比較，病理組SIRT1表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，見圖11。8周時，與對照組比較，病理組SIRT1表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與病理組比較，葛根組和大棗組SIRT1表達(dá)無明顯變化，聯(lián)苯雙酯組SIRT1表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖12。12周時，與對照組比較，病理組SIRT1的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與病理組比較，葛根組和大棗組SIRT1表達(dá)均升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)苯雙酯組明顯降低(P<0.01)，見圖13。

圖3 8周時病理組HE染色表現(xiàn)

圖4 8周時大棗組HE染色表現(xiàn)

圖5 8周時葛根組HE染色表現(xiàn)

圖6 8周時聯(lián)苯雙酯組HE染色表現(xiàn)

圖7 12周時病理組HE染色表現(xiàn)

圖8 12周時大棗組HE染色表現(xiàn)

圖9 12周時葛根組HE染色表現(xiàn)

圖10 12周時聯(lián)苯雙酯組HE染色表現(xiàn)

圖11 4周時各組SIRT1表達(dá)情況

圖12 8周時各組SIRT1表達(dá)情況

圖13 12周時各組SIRT1表達(dá)情況

3 討 論

血清轉(zhuǎn)氨酶是肝損傷的重要標(biāo)志物，是臨床的常用指標(biāo)，但與病理切片相比，轉(zhuǎn)氨酶的升高稍滯后于病理改變，此點(diǎn)也與酒精性肝病的臨床分期表現(xiàn)出高度的一致性，即酒精性脂肪肝，加重后表現(xiàn)為酒精性肝炎、甚至肝硬化等。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用白酒長期灌胃法建立了小鼠酒精性肝病模型，模擬人類的飲酒方法和酒精性肝病的病理狀態(tài)，結(jié)果顯示：在飲酒8周時轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，與早期肝病程度呈現(xiàn)一致性，而聯(lián)苯雙酯、葛根和大棗均可使血清轉(zhuǎn)氨酶活性下降；病理切片顯示灌胃4周即出現(xiàn)酒精性肝病，隨著飲酒量的增加，酒精性肝病逐漸加重，但應(yīng)用大棗、葛根和聯(lián)苯雙酯后病理損傷呈現(xiàn)不同程度的減輕，表現(xiàn)為脂肪變、炎癥等程度減輕，說明這3種藥物均可對抗白酒引起的肝損傷。該實(shí)驗(yàn)為民間用大棗、葛根治療肝病提供了一個有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

SIRT1是蛋白去乙?；福绊懙郊?xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞周期、能量代謝和細(xì)胞衰老等[5]，而多種因素可以影響SIRT1的表達(dá)，如限食、化學(xué)物質(zhì)白藜蘆醇等[6-8]。許多學(xué)者已經(jīng)推測這種影響可能是SIRT1參與體內(nèi)的氧化應(yīng)激過程有關(guān)[9]，并且Erion等[10]研究顯示，敲除SIRT1可以影響大鼠的肝臟代謝。目前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)大量飲酒可以導(dǎo)致肝臟內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，白酒代謝過程產(chǎn)生大量超氧陰離子、自由基等，可以造成體內(nèi)的氧化損傷，影響機(jī)體內(nèi)生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類等[11]的代謝，而SIRT1具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激作用。本研究結(jié)果表明：長期飲酒可以使肝組織SIRT1蛋白表達(dá)增多，這可能是一個反饋結(jié)果，飲酒可以導(dǎo)致肝臟內(nèi)自由氧增多，從而引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，SIRT1具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激作用，所以反饋性表達(dá)增加，以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，防止細(xì)胞損傷。實(shí)驗(yàn)中聯(lián)苯雙酯、葛根和大棗表現(xiàn)出不同的作用，聯(lián)苯雙酯對抗飲酒誘發(fā)的SIRT1蛋白表達(dá)增加，葛根和大棗則完全不對抗飲酒誘發(fā)的SIRT1蛋白表達(dá)增加，說明三藥的抗酒精性肝損傷作用在分子作用機(jī)制方面確有一定的區(qū)別，可能涉及不同的分子變化。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，葛根和大棗用于治療酒精性肝病長遠(yuǎn)效果可能比聯(lián)苯雙酯更好。

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Effect of Jujube and Pueraria on the expression of SIRT1 in the hepatic tissue of mice with alcoholic liver disease

SHEN Junhua1, ZHANG Yun2, LI Fangfang3

(1.The First Hospital of Handan, Handan 056000, Hebei, China; 2.The Work’s Hospital of China Minmetals Corporation, Handan 056802, Hebei, China; 3.Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China)

Objective It is to explore the effect of Jujube and Pueraria on liver function and expression of SIRT1 in the rats with alcoholic liver disease.Methods 114 Kunming mice were randomly divided into control group (n=24) and model group (n=90), and the model group was given Red Star Erguotou 54 degrees 8 mL/(kg·d) by intragastric administration for 4 weeks.After that, 8 mice in each group were selected randomly and killed to detect serum ALT and SIRT1 expression and observe the changes of liver pathology.The rest of the mice in model group were randomly divided into pathology group (n=22), Jujube group (n=20), Pueraria group (n=20) and Bifendate group (n=20), all the mice were given Red Star Erguotou 54 degrees 8 mL/(kg·d) by intragastric administration every two days.On the basis above, pathology group, Jujube group, Pueraria group and Bifendate group were respectively given distilled water jujube extract, Pueraria root extract, Bifendate at the dose of 0.01 mL/(kg·d).In 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks after medication, serum ALT and SIRT1 expression were determined and the changes of liver pathology was observed in the mice in every group.Results Compared with the model group, the levels of serum AST, ALT were significantly lower while the expression of SIRT1 in liver tissue was higher with improvements of liver function in Jujube group and Pueraria group, the difference were statistically significant(P<0.05).Conclusion Jujube and Pueraria both have a certain curative effect onalcoholic liver disease.

Jujube; Pueraria; SIRT1; alcoholic liver disease

申軍華，女，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楦卫w維化和消化內(nèi)鏡。

李芳芳，E-mail：fflitish@126.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.10.005

R-332

A

1008-8849(2015)10-1041-05

2014-11-15