一種gRNA快速合成及檢測方法的建立

杜建勇，鄧然，高虹，雍偉東

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

基因定點敲除技術(shù)通過對染色體上基因特異位點進(jìn)行定點突變，使其功能喪失，進(jìn)而達(dá)到研究其功能的目的。一些利用基因敲除技術(shù)創(chuàng)建的動物疾病模型對醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)于上世紀(jì)80年代末由Smithies 等［1］創(chuàng)立，通過同源重組手段將構(gòu)建的外源DNA 片段插入并替換相應(yīng)染色體上特定的區(qū)段，達(dá)到基因敲除的目的。這一技術(shù)的應(yīng)用使人類能夠有目的地研究基因功能和與之相關(guān)的疾病之間的直接關(guān)系。然而由于同源重組技術(shù)需要載體構(gòu)建、ES 細(xì)胞打靶、篩選、顯微注射、小鼠鑒定等一系列較為復(fù)雜的操作步驟，并且成本較高、周期較長，大大限制了這一技術(shù)的應(yīng)用。針對同源重組的缺點，科學(xué)家一直在探索用其他更簡便的技術(shù)來實現(xiàn)基因敲除。先后發(fā)明了ENU 隨機(jī)突變、基因捕獲、ES 細(xì)胞基因敲除細(xì)胞庫等方法和手段，但由于技術(shù)手段和操作成本的限制，這些技術(shù)都不能完全替代傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)。2009年以后出現(xiàn)了一系列新的基因編輯技術(shù)，包括ZFN、TALEN 和CRISPR/Cas9，開創(chuàng)了基因敲除(敲入)新的時代。這些新基因編輯技術(shù)作用原理相似，即通過核酸酶在目的基因的DNA 雙鏈上制造切口，然后利用生物體自身的修復(fù)機(jī)制以同源重組或者非同源末端連接的方式實現(xiàn)修復(fù)，進(jìn)而達(dá)到基因失活的目的。作為一種最新的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)通過gRNA 識別特異的靶序列，同時介導(dǎo)Cas9 核酸酶在DNA 的特異位點上制造切口［2］，然后利用生物體自身的修復(fù)機(jī)制進(jìn)行DNA 修復(fù)。這一過程中可能造成堿基改變、增加、缺失等突變現(xiàn)象，進(jìn)而實現(xiàn)對目的基因的敲除與修飾［3］。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的高效基因組編輯功能已被成功應(yīng)用于多種生物。包括人類細(xì)胞［4］，斑馬魚［5］、小鼠［6，7］、大鼠［8］、植物［9，10］及細(xì)菌［11］。眾所周知，生物體的一個性狀往往由多個基因共同決定，傳統(tǒng)的基因敲除費時費力卻只能一次敲除一個相關(guān)基因，而CRISPR/Cas9 系統(tǒng)其中一個最重要的特點便是可在多個不同gRNA 的引導(dǎo)下由Cas9 核酸酶一次靶向敲除多個基因組位點［12，13］。與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)具有其獨特的優(yōu)勢:首先，其RNA 識別DNA 機(jī)制即核酸之間的相互識別，避免了DNA 甲基化造成的影響。其次，與ZFN 和TALEN 相比，具有相同或更高的基因編輯效率，尤其在點突變方面優(yōu)于ZFN 和TALEN［14，15］。第三，設(shè)計簡單快速，無需重復(fù)構(gòu)建核酸內(nèi)切酶表達(dá)載體，適用于任何分子生物學(xué)實驗室。

當(dāng)前基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，CRISPR/Cas9 技術(shù)以其優(yōu)勢必將迅速推動基因組功能的研究?？焖佾@取目標(biāo)gRNA 并檢測驗證其活性將會推動這項技術(shù)的發(fā)展。本文旨在建立一種體外gRNA 快速合成及檢測的方法，這一方法的建立將減少利用該系統(tǒng)實現(xiàn)基因編輯的時間，快速實現(xiàn)目標(biāo)基因的敲除。

1 材料和方法

1.1 材料

8 周齡SPF 級C57 小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK(京)2014-0004】，PCR儀(Bio-Rad T100TM Thermal Cycler)、Tanon 全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能公司)、NanoDrop 2000 超微量分光光度計(Thermo)、T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7)、RNA 純化試劑盒(MEGAclearTMKit，Ambion)、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit)、無核酸酶水、dNTP mixture、高保真酶Taq 酶(Sigma)、Cas9 核酸酶(北京唯尚立德生物科技有限公司)

1.2 gRNA 靶點選擇及其寡核苷酸鏈合成

利用http://crispr．mit．edu/ 設(shè)計能夠結(jié)合NKp46 外顯子Exon3 上的gRNA(20nt)。引物及gRNA 通用模板由Invitrogen 公司合成。

1.3 gRNA 轉(zhuǎn)錄模板的PCR 擴(kuò)增

利用NKp46 gRNA 特異的上游引物mNKp46_g1F 和gRNA 通用下游引物gRNA-R，以人工合成的gRNA 通用模板DNA 片段為模板，通過PCR 擴(kuò)增得到NKp46 基因特異的gRNA 轉(zhuǎn)錄模板。具體反應(yīng)條件如下:(94℃30s，60℃10s，72℃30 s)×35，72℃10 min，4℃保存。取5 μL 電泳檢測PCR 產(chǎn)物，確定得到目標(biāo)DNA 片段，大小為123 bp。

1.4 gRNA 模板的體外轉(zhuǎn)錄

在得到gRNA 轉(zhuǎn)錄模板后利用純化試劑盒進(jìn)行g(shù)RNA 轉(zhuǎn)錄模板的純化。將純化后的產(chǎn)物用T7 RNAkit 轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7)進(jìn)行NKp46 gRNA 體外轉(zhuǎn)錄并利用RNA 純化試劑盒(MEGAclearTMkit，Ambion)將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化。合成的gRNA 通過NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測檢測濃度及純度。分裝并－80℃凍存。

1.5 gRNA 體外活性及特異性檢測

將得到的gRNA 與Cas9 核酸酶以及目的DNA混合孵育，電泳后觀察條帶大小并觀察片段灰度來確定切割效率。反應(yīng)體系:dsDNA(4μL)，gRNA(體外轉(zhuǎn)錄)(1μL)，Cas9 核酸酶(1μL)，10 × buffer(2μL)，ddH2O(12μL)，反應(yīng)總體系(20μL)按照上述反應(yīng)體系，混合好反應(yīng)溶液，37℃30 min，65℃5 min。

2 結(jié)果

2.1 小鼠NKP46 基因gRNA 靶點選擇

NKp46 基因存在于嚙齒類動物(大鼠和小鼠)和靈長類動物，如黑猩猩和短尾猿中。同時NKp46是唯一能被小鼠細(xì)胞上表達(dá)配體所識別的人類NK細(xì)胞激活受體。為了研究NKP46 基因在病毒感染過程中的作用，我們希望通過Cas9 技術(shù)創(chuàng)建NKP46敲除小鼠。利用網(wǎng)站http://crispr．mit．edu/，設(shè)計得到gRNA，見表1。

表1 gRNA 靶點序列Tab．1 The CRISPR target sequences

本文以小鼠NKP46 基因為例設(shè)計gRNA。共選擇了2 條gRNA 序列:

gRNA1 GGTGAACATCTGGTGTCAGG，gRNA2 CTCGGTGAACATCTGGTGTC 這兩個gRNA位于Nkp49 基因組上外顯子Exon3 處。

2.2 NKp46gRNA 體外擴(kuò)增模板的設(shè)計

gRNA 轉(zhuǎn)錄模板的結(jié)構(gòu):T7 啟動子、前導(dǎo)序列(20nt)、保守序列。體外擴(kuò)增模板序列是固定的即gRNA 轉(zhuǎn)錄模板的保守序列GTTTTAGAGCTAGA AATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC TTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT，該片段可以形成gRNA 的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，是所有g(shù)RNA 都包括的一部分。

2.3 上游引物gRNA-F 的設(shè)計

將得到的20nt 的序列前端加上一段T7 啟動子序列TAATACGACTCACTATAGGG 并在末尾加上與gRNA 固有序列前端相同的幾個堿基 GTTTTAGAGCTAG，最終設(shè)計得到一個53nt 的片段。按照該方法設(shè)計并合成了靶向小鼠NKP46 基因的mNKp46_g1F。mNKp46_g1F 將作為轉(zhuǎn)錄模板合成過程中的上游引物，參與PCR 反應(yīng)。由于體外轉(zhuǎn)錄試劑盒在轉(zhuǎn)錄完成后會在5’端多出3 個G 所以在設(shè)計選擇靶向gRNA 時可以選擇起始位置帶G 的序列，這樣可以最大限度的減少體外轉(zhuǎn)錄的影響，它的構(gòu)成(圖1)mNKp46 _ g1F TAATACGACTCACTA TAGGGTGAACATCTGGTGTCAGGGTTTTAGAGCTAG

圖1 上游引物結(jié)構(gòu)示意圖Fig．1 Schematic diagram of the forward primer structure．The designed primer consists of three parts:T7 promoter，the target sequence (20nt)，and 13 bp gRNA conserved sequence

2.4 gRNA 合成的通用下游引物

gRNA-R 的設(shè)計AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC，該序列與gRNA 模板3’端互補。

2.5 靶向小鼠NKP46 基因的gRNA 的轉(zhuǎn)錄模板在體外完成擴(kuò)增

該過程十分簡單只需一步PCR 反應(yīng)就可以迅速得到足夠濃度的帶有T7 promoter 的gRNA 的轉(zhuǎn)錄模板，參與反應(yīng)的上游引物已經(jīng)按照上述方法設(shè)計合成，其中下游引物和模板由于是通用的不具有特異性，不需要每次都合成。當(dāng)研究者更換目標(biāo)基因，只需設(shè)計合成一條新的上游引物即可，下游引物及模板不需要重復(fù)合成，十分的簡單經(jīng)濟(jì)。擴(kuò)增過程(見圖2)。然后體外轉(zhuǎn)錄得到足夠濃度gRNA 的靶向NKP46 基因的gRNA。

2.6 體外利用Cas9 核酸酶檢測驗證該方法確實可以得到高特異性及活性的gRNA

設(shè)計體外檢測引物mNk46_gSF TCCAAACAC GTGCATGTTACACATG，mNk46_gSR CCCAGCTTTG ACTCTCTTGTCCATC 以小鼠DNA 作為模板，利用該引物可以擴(kuò)增NKP46 基因，作為體外酶切檢測的片段。該片段中包含gRNA 的靶點，利用這種體外檢測方法，可以迅速對設(shè)計合成的gRNA 的特異性及活性進(jìn)行檢測，通過電泳可以觀察剪切條帶的大小，以驗證靶點位置是否正確，進(jìn)一步可以通過T-A 克隆檢測切開位置。本文設(shè)計的靶向NKP46 的gRNA在靶點位置切開，使得全長1297 bp 檢測條帶，被切成兩條帶，大小分別為804 bp 和493 bp(圖3A)。通過對灰度的計算(圖3B)，計算得到轉(zhuǎn)錄后原濃度的gRNA 以及稀釋一倍的gRNA，剪切效率都為100%，由此可以證明該方法設(shè)計合成gRNA 特異性及活性較高，同時體外檢測快速檢測的方法大大提高了gRNA 檢測的效率。

圖2 gRNA 的轉(zhuǎn)錄模板結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄示意圖Fig．2 A schematic diagram of the gRNA template structure and transcription

3 討論

常規(guī)獲取gRNA 要構(gòu)建表達(dá)載體，需要把gRNA的轉(zhuǎn)錄模板連接到載體上，經(jīng)過涂板挑選單克隆再搖菌后提取質(zhì)粒，最后還要酶切使質(zhì)粒線性化才能得到gRNA 的體外轉(zhuǎn)錄模板，得到gRNA 最少也需要3d 的時間。而本文建立的這種方法將極大地節(jié)約轉(zhuǎn)錄gRNA 的時間，一步PCR 反應(yīng)就可以得到足夠濃度的轉(zhuǎn)錄模板，僅需半天時間就可以得到需要的gRNA。本文建立的這種活性及特異性檢測方法，可以在體外迅速驗證gRNA 的其活性及特異性。將Cas9 核酸酶、gRNA、PCR 擴(kuò)增的靶基因片段混合孵育，通過瓊脂糖凝膠電泳可以十分清楚的觀察到剪切位置并通過對電泳照片的灰度比較可以進(jìn)一步計算剪切效率。

建立的這種快速利用CRISPR /Cas 9 技術(shù)實現(xiàn)基因編輯的方法，最具特色的是gRNA 的獲得及體外酶切檢測。與常規(guī)方法相比我們不構(gòu)建gRNA 表達(dá)載體而是直接利用化學(xué)合成方法。在體外合成一段單鏈DNA，通過設(shè)計引物，利用PCR 技術(shù)迅速擴(kuò)增該片段，并轉(zhuǎn)錄純化得到有功能的gRNA。利用這種gRNA 快速合成及檢測的方法，可以使每次基因編輯僅需合成一段與目的基因互補的一小段DNA 鏈即一個上游引物即可，模板和下游引物都是通用的方便而經(jīng)濟(jì)。本文建立的體外酶切檢測方法可以在得到gRNA 后迅速對其活性及特異性檢測，為后續(xù)轉(zhuǎn)染或顯微注射篩選有效的gRNA 節(jié)省了寶貴的時間。

圖3 體外檢測片段擴(kuò)增及酶切位點示意圖Fig．3 A schematic diagram of the amplification and detection of fragments cleavage sites in vitro

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