氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體LAT1對(duì)小鼠胎盤早期建立的影響

馬婧，譚毅，譚冬梅，盧俊杰，梁浩，羅文萍

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，重慶 401147;3.口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147)

在哺乳動(dòng)物胚胎的植入過程中，胚外滋養(yǎng)層對(duì)子宮蛻膜的適度侵襲是成功植入的重要事件。該過程受到嚴(yán)格的時(shí)空調(diào)節(jié)，侵襲時(shí)間的早晚、侵襲程度的強(qiáng)弱都可能影響早期胎盤形成，甚至導(dǎo)致整個(gè)妊娠事件的成敗。在小鼠圍植入期，靠近內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)的細(xì)胞增殖分化形成絨毛膜錐(ectoplacental cone，EPCs)，絨毛膜錐的外層細(xì)胞分化為具有侵襲性的次級(jí)滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophoblast giant cells，TGCs)，隨后侵入母體蛻膜組織，形成胎盤。小鼠的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲開始于D8［1，2］。小鼠作為研究人類滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和胎盤早期發(fā)生的理想動(dòng)物模型［3］，小鼠妊娠第8天時(shí)外胎盤錐中相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)規(guī)律及作用機(jī)制一直受到研究者的廣泛關(guān)注，而L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(L－type amino acid transporter 1，LAT1)在小鼠早期胎盤發(fā)生過程中的作用尚鮮有報(bào)道。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本元件，而氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體除了可以將氨基酸轉(zhuǎn)移進(jìn)出細(xì)胞外，還可參與氨基酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞興奮、抑制等重要細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)過程［4］。L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)是一個(gè)非Na+依賴性的大中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體［5］，作為其中的一員，L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)一些Na+非依賴性大中性氨基酸，其中包含亮氨酸、賴氨酸等必需氨基酸。亮氨酸作為L(zhǎng)AT1的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，在一定范圍內(nèi)其濃度升高時(shí)，LAT1表達(dá)水平增加，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)速度。而BCH作為轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑能夠抑制LAT1的活性，從而調(diào)控氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。亮氨酸和BCH的抑制作用均受濃度和時(shí)間的雙重調(diào)控。研究者發(fā)現(xiàn)，LAT1大量表達(dá)于小鼠胎盤組織［6］，推測(cè)其可能與胎兒發(fā)育過程中的氨基酸吸收和營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)［7］，比如胎兒從母體攝取重要氨基酸(如絲氨酸)［8］、激素(如甲狀腺激素)等過程可能都依賴于LAT1的參與。LAT1功能的異常或可影響胎兒發(fā)育過程中氨基酸的正常吸收，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝障礙性疾病。除此以外，鑒于在胎盤中LAT1主要表達(dá)在與侵襲表型相關(guān)的滋養(yǎng)層細(xì)胞［9，10］，我們推測(cè)LAT1或許也可參與滋養(yǎng)層侵襲行為的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響胎盤發(fā)生過程。因此，我們檢測(cè)了LAT1在D8小鼠子宮中的表達(dá)，并通過體外檢測(cè)BCH和亮氨酸對(duì)EPCs外延生長(zhǎng)的影響，探討LAT1在早期胎盤形成中的作用，促進(jìn)我們對(duì)胎盤形成過程中分子調(diào)節(jié)機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 材料

6－8周齡SPF級(jí)KM雌鼠120只，體重20～25 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(渝)2012－0001】，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物屏障系統(tǒng)環(huán)境內(nèi)【SYXK(渝)2012－0001】。KM 雄鼠與動(dòng)情期雌鼠1∶2合籠，第2天早晨觀察到陰栓的記為妊娠第1天(D1)。D8取材，收集子宮組織，將組織放入液氮中速凍，然后放在－80℃低溫冰箱內(nèi)保存，用于制作冰凍切片。

兔源性LAT1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;兔SP檢測(cè)試劑盒(SP－9001)、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Matrigel Basement Membrane Matrix基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó) BD Biosciences公司;BCH、亮氨酸均購(gòu)自Sigma公司;Gibco胎牛血清、Gibco F－12培養(yǎng)基均購(gòu)自 Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)LAT1在D8小鼠子宮中的表達(dá)

妊娠小鼠D8的子宮組織冰凍切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色:3%H2O2甲醇溶液孵育20 min，山羊血清封閉30 min，一抗(濃度為1∶800的兔源性LAT1多克隆抗體;陰性對(duì)照組采取同種兔正常血清代替一抗)4℃孵育過夜，第2天滴加二抗山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，然后滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(S－A/HRP)室溫孵育30 min，用DAB試劑顯色，并用蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度脫水，封片。顯微鏡下觀察LAT1在妊娠小鼠D8子宮中的表達(dá)位置。

1.2.2 體外檢測(cè)BCH以及亮氨酸對(duì)絨毛膜錐(EPCs)黏附能力及外延生長(zhǎng)的影響

每次取20只孕鼠，每組5只。參考Peng等［11］方法分離D8.5的EPCs。斷頸椎處死妊娠D8.5的小鼠，小心用剪刀和鑷子打開子宮壁，取出鼓包，放入培養(yǎng)基中清洗，然后在顯微鏡下用眼科鑷分離出EPCs，每只獲取6～8個(gè)結(jié)構(gòu)完整的EPCs，并隨機(jī)將EPCs放到鋪有Matrigel膠的24孔板中培養(yǎng)。2～4 h后，加入完全培養(yǎng)基(F12+10%FBS)。BCH及亮氨酸的處理濃度參考Chrostowski［9］文獻(xiàn)報(bào)道，其中處理組分別加入0.1、1、4 μmol/L BCH。對(duì)照組不做處理。亮氨酸處理實(shí)驗(yàn)取材和方法同BCH處理。處理組亮氨酸濃度分別為:20、200、800 μmol/L。

觀察各組EPCs黏附及外延生長(zhǎng)的情況。EPCs的黏附情況及外延生長(zhǎng)的測(cè)定參考Peng等方法。將培養(yǎng)至24、48 h的EPCs輕微晃動(dòng)20 s，觀察，依然在Matrigel膠上不動(dòng)的EPCs記為黏附成功，并在顯微鏡下拍照，測(cè)量EPCs距離。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)LAT1在D8小鼠子宮中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，LAT1強(qiáng)表達(dá)于D8小鼠子宮蛻膜區(qū)域的細(xì)胞中，并且LAT1在EPCs中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。

2.2 亮氨酸對(duì)絨毛膜錐黏附及外延生長(zhǎng)能力的影響

為了探討LAT1的作用底物亮氨酸對(duì)EPCs侵襲能力的影響，我們檢測(cè)了 20、200、800 μmol/L 亮氨酸對(duì)EPCs黏附能力及對(duì)外延生長(zhǎng)的影響。結(jié)果，在培養(yǎng)至24 h及48 h時(shí)，不同組的EPCs的黏附率均在90%以上，各組之間差異無(wú)顯著性。提示亮氨酸對(duì)EPCs的黏附能力沒有影響。用ImageJ軟件對(duì)EPCs外延生長(zhǎng)距離分析可知，24 h及48 h時(shí)，不同濃度亮氨酸均對(duì)EPCs的外延生長(zhǎng)無(wú)影響(圖2)。

2.3 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BCH對(duì)絨毛膜錐黏附及外延生長(zhǎng)能力的影響

為了探討氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BCH對(duì)EPCs侵襲能力的影響，我們檢測(cè)了 0.1、1、4 μmol/L BCH 對(duì)EPCs黏附能力及對(duì)外延生長(zhǎng)的影響。結(jié)果，在培養(yǎng)至24 h及48 h時(shí)。不同組的EPCs黏附率均在90%以上，各組之間差異無(wú)顯著性。提示了BCH信號(hào)對(duì)EPCs的黏附能力沒有影響。用過ImageJ軟件對(duì)EPCs外延生長(zhǎng)距離分析可知，在24 h 時(shí)，1、4 μmol/L BCH均可抑制EPCs的外延生長(zhǎng)，與對(duì)照組比較，差異有顯著性 (P ＜0.05)，在48 h時(shí)，0.1、1 μmol/L 可顯著抑制EPCs的外延生長(zhǎng)(P＜0.05)(圖3)。

注:A:LAT1在D8子宮中表達(dá);B:圖A中EPCs放大;C:陰性對(duì)照;SDZ:次級(jí)蛻膜帶;EPCs:絨毛膜錐。圖1 免疫組化檢測(cè)LAT1在D8小鼠子宮中的表達(dá)Note.A:LAT1 expression in the mouse uteri on day 8;B:A higher magnification of EPC in(A);C:negative control;SDZ:Secondary decidual zone;EPCs:Ectoplacental cone.Fig.1 Immunohitochemical staining of LAT1 in the mouse uteri on D8 of pregnancy.

注:A－D:對(duì)照組，20、200 、800 μmol/L 亮氨酸。圖2 48 h時(shí)，不同濃度亮氨酸對(duì)EPCs外延生長(zhǎng)能力的影響Note.A－D:Control，20，200，800 μmol/L L－leucine.Fig.2 Effects of different concentrations of L－leucine on EPCs outgrowth at 48 h

注:A－D:48 h時(shí)，EPCs外延生長(zhǎng)圖，分別為:對(duì)照組，0.1、1、4 μmol/L BCH;E:外延生長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)圖;*P ＜0.05，與對(duì)照組比;＊＊ P ＜0.01，與對(duì)照組比。圖3 不同濃度BCH對(duì)EPCs外延生長(zhǎng)能力的影響Note.A－D:At 48 h，the outgrowth length of EPCs，Respectively，Control，0.1 μmol/L，1 μmol/L，4 μmol/L BCH;E:Statistics of the outgrowth length in different treatment groups;*P＜0.05，Compared with the control group;＊＊ P＜0.01，Compared with the control group.Fig.3 Effects of different concentrations of BCH on EPCs outgrowth

3 討論

作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本元件氨基酸參與了細(xì)胞內(nèi)許多代謝途徑，而氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為氨基酸的攝取提供了載體通道。其中LAT1大量表達(dá)在胎兒腦、肝臟、骨髓、胎盤及生殖器等正常組織以及癌細(xì)胞中［12］，組織部位、細(xì)胞類型的不同導(dǎo)致表達(dá)水平不同［13］。

滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入母體子宮發(fā)生蛻膜化是胚胎植入的關(guān)鍵步驟，在這一過程中，侵襲性的滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力和行為方式與腫瘤細(xì)胞相似，此過程均涉及基質(zhì)金屬蛋白酶、激素以及母體免疫、代謝及內(nèi)分泌等活動(dòng)的調(diào)節(jié)［14，15］。因此，從某種意義上講，滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)母體蛻膜侵入的精確調(diào)控與腫瘤細(xì)胞侵襲的失控是同一種細(xì)胞行為的兩種表型［14］。有研究報(bào)道，LAT1在滋養(yǎng)層細(xì)胞株Rs26 TS細(xì)胞中高表達(dá)，采用基因沉默或者是LAT1的拮抗劑BCH干預(yù)細(xì)胞，均可降低小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞株Rs26 TS細(xì)胞侵襲［16］。因此，LAT1在小鼠胎盤組織中的高表達(dá)可能是通過參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲行為進(jìn)而影響早期胎盤發(fā)生進(jìn)程。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)了LAT1在小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜開始侵襲時(shí)(即妊娠第8天)妊娠子宮中的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)，LAT1強(qiáng)表達(dá)于次級(jí)蛻膜帶的蛻膜細(xì)胞胞膜上以及侵襲性的EPCs中。在胎盤未形成之前，大核多核的蛻膜細(xì)胞可為胚胎的生長(zhǎng)提供能量，因此LAT1在次級(jí)蛻膜帶的強(qiáng)表達(dá)可能提示其在胚胎發(fā)育中的營(yíng)養(yǎng)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證LAT1在EPCs侵襲過程中所扮演的角色，我們選擇體外分離培養(yǎng)的D8.5的EPCs作為研究小鼠胚胎植入及滋養(yǎng)層侵襲的體外模型，將EPCs種植于Matrigel膠上，并分別以不同濃度的LAT1的氨基酸作用底物亮氨酸及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BCH進(jìn)行干預(yù)。在小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞株Rs26 TS的完全培養(yǎng)基中含有200 mg/L亮氨酸，而研究發(fā)現(xiàn)在較低濃度(40 μmol/L)的亮氨酸培養(yǎng)基培中，細(xì)胞LAT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高。因此，限制亮氨酸的濃度可以改變LAT1的表達(dá)水平。在EPCs培養(yǎng)的F12完全培養(yǎng)基中加入不同濃度的亮氨酸，直至將培養(yǎng)基中亮氨酸濃度額外增加至800 μmol/L(200 mg/L)的濃度，依然沒有發(fā)現(xiàn)EPCs的粘附及外延生長(zhǎng)能力受到影響。分析原因，可能是因?yàn)樵谕耆囵B(yǎng)基中，氨基酸濃度(包括亮氨酸)非常高，因此再額外的添加亮氨酸，已經(jīng)不能改變LAT1的表達(dá)水平，這也與本文中亮氨酸處理EPCs后外延生長(zhǎng)情況無(wú)顯著性差異的檢測(cè)結(jié)果相吻合。如果要更進(jìn)一步的研究LAT1的作用底物在EPCs的粘附及外延生長(zhǎng)能力方面的影響，應(yīng)該自制選擇性培養(yǎng)基，去除F12完全培養(yǎng)基中的LAT1底物氨基酸，再給予定量添加。

BCH為L(zhǎng)AT1轉(zhuǎn)運(yùn)亮氨酸的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。在腫瘤細(xì)胞中，BCH可能通過影響氨基酸的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，影響mTOR磷酸化及其下游信號(hào)，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)等方式改變 LAT1的表達(dá)水平［16］。我們采用不同濃度的氨基酸特異抑制劑BCH處理EPCs，結(jié)果提示，在 24 h 時(shí)，1、4 μmol/L BCH 均可顯著抑制 EPCs的外延生長(zhǎng)，而在48h時(shí)，0.1、1 μmol/L可表現(xiàn)出顯著的抑制作用，4 μmol/L組的抑制作用差異不顯著。在加入亮氨酸及BCH處理EPCs后，無(wú)法從Matrigel膠上分離出外延生長(zhǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞，因此無(wú)法檢測(cè)該細(xì)胞中LAT1的表達(dá)水平是否發(fā)生變化。有文獻(xiàn)報(bào)道在Rs26 TS細(xì)胞中，BCH對(duì)LAT1的表達(dá)水平改變能力尚不如亮氨酸的作用。BCH作用48 h時(shí)，LAT1的蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化，但依然可以發(fā)現(xiàn)Rs26 TS細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生了顯著變化。

因此我們推測(cè)LAT1可能促進(jìn)EPCs的外延生長(zhǎng)從而參與胎盤的形成。但LAT1通過何種分子機(jī)制參與調(diào)節(jié)EPCs的侵襲行為，以及在體內(nèi)以何種復(fù)雜方式參與早期胎盤的發(fā)生，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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