小鼠糞便及腸道各部位內(nèi)容物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

武亞琦，鐘根深，吳敏娜*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100)

腸道中含有數(shù)量巨大的微生物，數(shù)量超過(guò)1014，約10倍于人體細(xì)胞［1］。這些微生物在維持人類(lèi)生命健康方面發(fā)揮著重要作用［2］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物與炎性腸病(IBD)、結(jié)直腸癌(CRC)、肥胖、二型糖尿病等多種疾病密切相關(guān)［3－6］。因此，加強(qiáng)對(duì)腸道微生態(tài)的了解有助于對(duì)一些腸道疾病的診斷及治療。

腸道微生物群的檢測(cè)方法眾多，通過(guò)糞便中微生物的群落結(jié)構(gòu)來(lái)反映腸道微生態(tài)是許多研究人員選用的方法［7，8］。然而，遺傳、腸道內(nèi)外部環(huán)境因素造成腸道各部位及個(gè)體之間腸道微生物群落組成的差異［9］。因此糞便是否可真實(shí)反映腸道微生態(tài)還有待進(jìn)一步探討。本文利用末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T－RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)，通過(guò)比較同齡雄性BALB/c小鼠糞便和腸道不同部位內(nèi)容物中微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的差異，分析糞便取樣研究腸道微生物與某些相關(guān)疾病的科學(xué)性和客觀性，為相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼喂及取樣

SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠，12周齡，體重均為24g左右，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012－0001】，飼養(yǎng)于華蘭生物工程股份有限公司SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(豫)2012－0003】。SPF級(jí)飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度為30% ～40%，采用日光燈照明，12 h明/12 h暗，自由飲用純凈水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1d后在無(wú)菌環(huán)境中收集糞便于2 mL EP管中，然后處死小鼠并解剖取出從幽門(mén)至肛門(mén)小鼠整個(gè)腸道。根據(jù)腸道解剖學(xué)特征依次截取相應(yīng)的部位，剪開(kāi)腸段，用無(wú)菌手術(shù)刀刮取內(nèi)容物，置于2 mL EP管中，立即放入－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

采用Tiangen糞便DNA提取試劑盒(DP328，Tiangen)進(jìn)行糞便及腸道內(nèi)容物中細(xì)菌基因組DNA的提取，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。然后用紫外分光光度計(jì)(Nano Drop 2000，Thermo，USA)測(cè)定所提取 DNA的濃度。

1.3 普通PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物的純化

采用細(xì)菌 16S rDNA特異性引物 8F(5’－AGAGTTTGATCATGGCTCAG－3’)和 1492R(5’－GGTTACCTTGTTACGACTT－3’)［10］對(duì)樣品中的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物8F的5’端帶有FAM標(biāo)記。PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司(大連)，擴(kuò)增體系和程序按參考文獻(xiàn)進(jìn)行［10］。然后將PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，嚴(yán)格按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP214，Tiangen)說(shuō)明書(shū)操作純化PCR產(chǎn)物。

1.4 T-RFLP分析

采用限制性?xún)?nèi)切酶Alu I(寶生物工程有限公司，大連)對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為:Alu I 1μL(10 U)，10 × buffer 2 μL，17 μL純化后的PCR產(chǎn)物，共20 μL，混勻后在37℃ 恒溫條件下酶切4 h，然后于80℃ 水浴20 min使酶失活，最后將酶切產(chǎn)物低溫快遞送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 DGGE分析

用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)特異性引物341F(5＇－CCTACGGGAGGCAGCAG－3＇)和 518R(5＇－ATTACCGCGGCTGCTGG－3＇)［11］對(duì)糞便細(xì)菌基因組進(jìn)行擴(kuò)增，PCR體系和程序據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行［12］。制備8%濃度、變性范圍為35% ～55% 的聚丙烯酰胺凝膠，保持60℃恒溫，在60 V恒壓下電泳16h。電泳結(jié)束后，使用EB染色25 min，然后在凝膠成像系統(tǒng)(EC3，UVP，USA)下成像。

1.6 熒光定量PCR

用pMDTM18－T載體連接試劑盒和感受態(tài)大腸桿菌 DH－5α(寶生物，大連)構(gòu)建含16S rDNA V3區(qū)341－518片段的質(zhì)粒，選取1×109～1×105copies/μL這5個(gè)濃度的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3個(gè)重復(fù)，在熒光定量PCR儀(Step One PlusTM，ABI，USA)中生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

對(duì)樣品 DNA進(jìn)行 qPCR，反應(yīng)體系為:SYBR premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2 × )10 μL，引物 341F和 518R 均為 0.4 μL，ROX reference dye(50 × )0.4 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 6.8 μL，共20 μL。熒光定量反應(yīng)體系為:95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán);95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán);反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行生成溶解曲線(xiàn)的程序，即95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用T－RFs的峰高所占總峰高的百分比作為相對(duì)豐度。去掉末端片斷長(zhǎng)度小于30 bp和相對(duì)豐度小于1% 的 T－RFs，將相差 ±1 bp的 T－RFs合并為同一個(gè)T－RF［13］。然后將數(shù)據(jù)用 SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算豐富度Richness(S)、多樣性指數(shù)Shannon－Weaner index(H’)和均勻度Evenness(E)［13］。Richness(S)=T－RFs 數(shù)量 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤;Shannon－Weaner index(H’)= － Σ(pi)ln(pi);Evenness=H/lnS;其中 pi=ni/N，ni為單一 T－RF 的豐度值，N為T(mén)－RFs的總豐度值，S為樣品 T－RFs數(shù)量。用Canoco軟件做對(duì)應(yīng)分析(correspondence analysis，CA)。用單因素方差(ANOVA)分析樣品方差齊性，然后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)后比較樣品之間的顯著性差異。用Quantity One軟件分析DGGE圖譜，根據(jù)unweighted pair group method clustering(UPGMA)算法構(gòu)建樹(shù)狀圖。T－RFs信息上傳至T－RFLP在線(xiàn)比對(duì)網(wǎng)站MICA:Microbial Community AnalysisⅢ(http://mica.ibest.uidaho.edu/runpat.php)上進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-RFLP分析結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌多樣性分析

腸道各部位的豐富度、多樣性、均勻度，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明糞便中細(xì)菌多樣性指數(shù)最高，為2.30，顯著高于小腸三個(gè)部位的內(nèi)容物(P ＜0.05);大腸中結(jié)腸的細(xì)菌多樣性指數(shù)為2.23，盲腸的為2.17，直腸的為2.30，與糞便中細(xì)菌多樣性指數(shù)差異無(wú)顯著性(P＞0.05);而小腸內(nèi)容物中細(xì)菌的多樣性指數(shù)顯著低于大腸和糞便，回腸、空腸和十二指腸部位分別為1.68、1.61和1.90，其中十二指腸部位細(xì)菌多樣性指數(shù)又顯著高于回腸和空腸部位的。大腸和糞便中細(xì)菌的豐富度和均勻度亦明顯高于小腸部位。

表1 BALB/c小鼠腸道各部位內(nèi)容物及糞便中細(xì)菌多樣性分析Tab.1 Diversity analysis of the bacterial community in different sites of the intestines and feces of BALB/c mice

2.1.2 腸道各部位之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)應(yīng)(CA)分析結(jié)果如圖1所示，其中去掉一個(gè)明顯離群的十二指腸樣品。圖中的1－16代表大腸內(nèi)容物和糞便樣品，它們緊密的聚在一起，表明他們的細(xì)菌群落組成十分相似且不同BALB/c小鼠大腸各部位內(nèi)容物相似性較高且重復(fù)性好。17－27代表小腸內(nèi)容物，其中18(回腸)，25(十二指腸)，26(十二指腸)明顯與其他小腸樣品的成分相差較大，表明BALB/c小鼠小腸各部位內(nèi)容物相似度和重復(fù)性不如大腸部位的高。糞便和大腸樣品聚集在一起，與小腸樣品分別位于二維軸的兩端，表明T－RFs反映出的BALB/c小鼠的糞便和大腸內(nèi)容物的細(xì)菌組成比較相似，而與小腸內(nèi)容物組成差異較大。

2.1.3 優(yōu)勢(shì)菌群分析

根據(jù)T－RFs在樣品中的峰度值用 Excel生成堆積柱狀圖2。在糞便、直腸和結(jié)腸中244、255 bp和449 bp占有的比重較高(6.95% ～42.71%)，為優(yōu)勢(shì)T－RFs，表明在這些腸道部位中共同存在著一些優(yōu)勢(shì)菌群;而這些T－RFs在盲腸中存在但所占的比重明顯減小，表明盲腸部位細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群有所改變。此外，大腸和糞便中共同擁有許多其他的TRFs，如60、183、261、265、426 bp 和437 bp 等，表明大腸部位和糞便中細(xì)菌的組成相似度較高。不同于大腸部位和糞便樣品，小腸部位的內(nèi)容物中優(yōu)勢(shì)T－的減小，73 bp只存在于小腸中，將T－RFs信息上傳至在線(xiàn)比對(duì)網(wǎng)站MICA上發(fā)現(xiàn)，60 bp代表乳桿菌屬(Lactobacillus)，而73 bp代表克雷伯菌屬(Klebsiella)。

注:1～4.糞便;5～8.直腸;9～12.結(jié)腸;13～16.盲腸;17～20.回腸;21～24.空腸;25～27.十二指腸。圖1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)CA分析Note.1－4.Feces;4－8.Rectum;9－12.Colon;13－16.Cecum;17－20.Ileum;21－24.Jejunum;25－27.Duodenum.Fig.1 CA analysis of the bacterial community composition.

2.2 DGGE分析

如圖3所示，糞便和大腸各部位條帶較小腸多，表明糞便和大腸內(nèi)容物較小腸擁有更多的細(xì)菌種類(lèi);糞便和大腸擁有的優(yōu)勢(shì)條帶相同，小腸部位的優(yōu)勢(shì)條帶與大腸不同，與T－RFLP結(jié)果相一致。

進(jìn)一步用Quantity One軟件分析DGGE圖譜，得到聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖(圖4)。除一個(gè)糞便樣品外，樹(shù)狀圖中糞便和大腸各部位聚集成一簇，空腸和回腸樣品聚集成一簇，說(shuō)明大腸和糞便的細(xì)菌群落組成相似性較高，與小腸樣品相似性較低，十二直腸內(nèi)容物中細(xì)菌與糞便及空腸、回腸差別較大。

2.3 熒光定量PCR分析結(jié)果

熒光定量PCR分析各部位細(xì)菌豐度，結(jié)果如圖5所示，小鼠腸道中，小腸部位的十二指腸和空腸內(nèi)容物中細(xì)菌豐度分別為6.9 log(copies)/g和8.3 log(copies)/g;糞便中細(xì)菌豐度高達(dá)11.8 log(copies)/g，顯著高于十二指腸和回腸這兩個(gè)小腸部位(P ＜0.05)，約為十二指腸的2倍，而與大腸各部位及回腸內(nèi)容物中細(xì)菌的豐度相當(dāng)，差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)。

注:Fec:糞便;rec:直腸;col:結(jié)腸;cec:盲腸;ile:回腸;jej:空腸;duo:十二指腸。樣品后邊的數(shù)字代表小鼠編號(hào)，如，col 1代表1號(hào)小鼠的結(jié)腸。圖2 細(xì)菌T－RFLP分析柱狀圖Note.Fec:Feces;rec:Rectum;col:Colon;cec:Cecum;ile:Ileum;jej:Jejunum;duo:Duodenum.The number following the sample stands for the mouse number.For example，col 1 stands for the colon of the first mouse.Fig.2 T－RFLP patterns of the bacterial populations.

注:1～3.糞便;4～6.直腸;7～9.結(jié)腸;10～12.盲腸;13～15.回腸;16～18.空腸;19～20.十二指腸。圖3 16 S rDNA的PCR－DGGE分析圖譜Note.Feces:1－3;Rectum:4－6;Colon:7－9;Cecum:10－12;Ileum:13－15;Jejunum:16－18;Duodenum:19－20.Fig.3 The 16S rDNA PCR－DGGE profiles

注:fec:糞便;rec:直腸，col:結(jié)腸;cec:盲腸;jej:空腸;ile:盲腸;duo:十二指腸。圖4 DGGE圖譜聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Note.fec:Feces;rec:Rectum;col:Colon;cec:Cecum;ile:Ileum;jej:Jejunum;duo:Duodenum.Fig.4 Cluster analysis of the DGGE profiles

3 討論

注:1:糞便;2:直腸;3:結(jié)腸;4:盲腸;5:回腸;6:空腸;7:十二指腸，*，P ＜0.05，與糞便樣品差異有顯著性。圖5 小鼠糞便及腸道內(nèi)容物細(xì)菌豐度Note.*，P ＜ 0.05.1.Feces;2.Rectum;3.Colon;4.Cecum;5.Ileum;6.Jejunum;7.Duodenum.Fig.5 The abundance of bacteria in the mouse intestines and feces.

腸道特有的環(huán)境使得體外分離培養(yǎng)腸道菌群存在很大的局限性［14］;基于PCR的方法目前已被廣泛應(yīng)用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究［15，16］，其中 TRFLP技術(shù)用限制性?xún)?nèi)切酶將DNA酶切成不同的末端片段(T－RFs)，相同長(zhǎng)度的 T－RFs在一定程度上代表一類(lèi)物種，可高效直觀地進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)的分析［17］;DGGE則利用變性劑梯度將長(zhǎng)度相同但組成不同的DNA分開(kāi)從而檢測(cè)DNA的多態(tài)性等［18］。本研究通過(guò)T－RFLP分析發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠腸道不同部位有其適合生存的特異性細(xì)菌種群，即優(yōu)勢(shì)的T－RFs，其中60 bp代表乳桿菌屬(Lactobacillus)，乳酸桿菌為兼性厭氧菌，60 bp片段自小腸到大腸豐度逐漸減少可能跟小腸至大腸氧氣含量逐漸減少有關(guān)。PCR－DGGE分析結(jié)果與T－RFLP結(jié)果表現(xiàn)出一致的趨勢(shì):糞便與大腸部位內(nèi)容物中細(xì)菌多樣性相似，且明顯高于小腸部位內(nèi)容物;糞便和結(jié)直腸共同擁有一些優(yōu)勢(shì)菌群，表明糞便和結(jié)直腸的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。同時(shí)BALB/c小鼠糞便與大腸各部位之間在細(xì)菌豐度上亦十分相似，與空腸、十二指腸差異顯著;且大腸各部位細(xì)菌豐度較為穩(wěn)定，小腸各部位之間細(xì)菌豐度波動(dòng)較大。小腸主要是消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的場(chǎng)所，該部位影響細(xì)菌分布的影響因素很多，如pH、消化液、分泌物和激素等，而相比之下大腸內(nèi)部環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，這可能是造成大腸內(nèi)細(xì)菌豐度穩(wěn)定性高于小腸的一個(gè)重要原因［19］。

本實(shí)驗(yàn)中BALB/c小鼠大腸各部位之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)重復(fù)性較好，且與糞便中細(xì)菌組成相似，小腸各部位細(xì)菌群落與糞便差別顯著且個(gè)體間差異較大，小鼠糞便并不能代表整個(gè)腸道內(nèi)容物，而只適用于大腸部位特別是結(jié)直腸相關(guān)疾病的研究，如結(jié)直腸癌等;對(duì)小腸部位微生態(tài)與疾病的相關(guān)研究應(yīng)該選擇其他合適的方法。除小鼠外，利用代謝產(chǎn)物來(lái)分析其他哺乳動(dòng)物腸道微生態(tài)也是科研人員常用的方法，如Ilmberger等［20］用大象糞便反應(yīng)其腸道微生態(tài)來(lái)研究大象的胃腸系統(tǒng);趙立平等［21］利用大熊貓糞便來(lái)檢測(cè)大熊貓腸道微生物區(qū)動(dòng)態(tài)，雖然不同物種間的胃腸道系統(tǒng)可能存在差異，但是本研究可為大型動(dòng)物及稀有瀕危哺乳動(dòng)物的研究提供參考。

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