HPLC-DAD法測(cè)定“武當(dāng)三號(hào)金銀花”不同部位中蘆丁和木犀草苷的含量

鄭　芳，朱雪松，李　鵬，李志浩，李春雷，李　聰

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰　442008)

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◇藥物分析◇

HPLC-DAD法測(cè)定“武當(dāng)三號(hào)金銀花”不同部位中蘆丁和木犀草苷的含量

鄭芳，朱雪松，李鵬，李志浩，李春雷，李聰

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰442008)

摘要：目的建立HPLC-DAD法測(cè)定 “武當(dāng)三號(hào)金銀花” 不同部位中蘆丁和木犀草苷的含量。方法采用Fortis Xi Phenyl柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)—0.5%冰醋酸溶液(B)進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為354 nm；柱溫：30℃。結(jié)果蘆丁和木犀草苷在各自測(cè)定的范圍內(nèi)均呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(r≥0.999 4)，平均回收率分別為99.4%、99.3%。結(jié)論該法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，為控制“武當(dāng)三號(hào)金銀花” 不同部位蘆丁和木犀草苷的質(zhì)量提供了一種可靠的方法。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；蘆丁；木犀草苷；梯度洗脫

“武當(dāng)三號(hào)金銀花”由湖北武當(dāng)生物醫(yī)藥科技有限公司從山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司引進(jìn)的亞特紅金銀花，經(jīng)培育適合武當(dāng)?shù)貐^(qū)生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)金銀花新品種[1]。該花呈紅色，香味濃郁，抗逆性強(qiáng)?！拔洚?dāng)三號(hào)金銀花”為忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，其藤和葉分別為忍冬的干燥莖枝和干燥葉。金銀花、忍冬葉和忍冬藤均具有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)之功效[2-4]。《中國(guó)藥典》2010年版一部已將綠原酸和木犀草苷作為金銀花質(zhì)量控制的指標(biāo)，將綠原酸和馬錢(qián)苷作為忍冬藤質(zhì)量控制的指標(biāo)，但忍冬葉質(zhì)量控制尚未入藥典。忍冬葉為金銀花和忍冬藤的副產(chǎn)物，雖產(chǎn)量較高，但一直被視為非藥用部位而未得到充分利用[5]。金銀花、忍冬葉和忍冬藤除了均含有機(jī)酸外，還均含有黃酮類(lèi)等成分[6-8]。其中，以蘆丁和木犀草苷為代表的黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌等多種藥理作用[9-10]。目前，對(duì)“武當(dāng)三號(hào)金銀花”中蘆丁和木犀草苷的含量測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，采用HPLC-DAD法測(cè)定“武當(dāng)三號(hào)金銀花”不同部位(花蕾、葉、藤)中蘆丁和木犀草苷的含量，并各自取三批樣品進(jìn)行了含量測(cè)定。

1儀器與試藥

1.1儀器UltiMate 3000 高效液相色譜儀(DIONEX)，配備UltiMate 3000 Photodiode Array Detector、UltiMate 3000 Pump(四元梯度)、LGC-1025M 型柱溫箱、Chromeleon 色譜工作站及手動(dòng)進(jìn)樣器；AEU-210型萬(wàn)分之一電子分析天平(日本島津)；METTLER TOLEDO 十萬(wàn)分之一電子分析天平；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(功率200～500 W，額定頻率40 kHZ，昆山市超聲儀器有限公司)；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(功率100 W，頻率40 kHZ，昆山市超聲儀器有限公司)；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)[額定頻率(50±1) Hz，天津市泰斯特儀器有限公司]；GZX-DH-40X 4-5型電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng))。

1.2試藥蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-200707，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；木犀草苷對(duì)照品(批號(hào)：111720-200604，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；武當(dāng)三號(hào)金銀花及其葉和藤均于2014年5月18日、5月26日、6月4日采自湖北武當(dāng)生物醫(yī)藥科技有限公司賽武當(dāng)金銀花種植基地，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院陳吉炎教授鑒定為忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，其藤和葉分別為忍冬的干燥莖枝和干燥葉；乙腈和冰醋酸均為色譜純，均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇和甲醇均為分析純，均購(gòu)自武漢市中天化工有限責(zé)任公司；水為自制注射用水。

2方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取蘆丁和木犀草苷對(duì)照品各適量，置棕色瓶中，加70%乙醇制成每1 mL中含蘆丁0.104 mg和每1 mL中含木犀草苷0.124 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，均用封口膜封上，置4℃冰箱中備用；各取上述儲(chǔ)備液適量混合得蘆丁和木犀草苷混合對(duì)照品溶液(每1 mL中含蘆丁和木犀草苷分別為34.67，41.33 μg)。

2.2供試品溶液的制備

2.2.1“武當(dāng)三號(hào)金銀花”花蕾供試品溶液[2]取“武當(dāng)三號(hào)金銀花”干燥花蕾[鮮品蒸制4 min后，于鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱(45℃)干燥](過(guò)四號(hào)篩)約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱(chēng)量，超聲處理[功率250 W，頻率40 kHz，超聲溫度(40±1)℃]30 min，放冷，再稱(chēng)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm的有機(jī)相過(guò)濾頭過(guò)濾，取續(xù)濾液適量，作為供試品溶液。

2.2.2“武當(dāng)三號(hào)金銀花”葉供試品溶液取“武當(dāng)三號(hào)金銀花”干燥葉[鮮品直接置于鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱(45℃)干燥](過(guò)四號(hào)篩)約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇30 mL，稱(chēng)量，超聲處理[功率250 W，頻率40 kHz，超聲溫度(40±1)℃]30 min，放冷，再稱(chēng)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm的有機(jī)相過(guò)濾頭過(guò)濾，取續(xù)濾液適量，作為供試品溶液。

2.2.3“武當(dāng)三號(hào)金銀花”藤供試品溶液取“武當(dāng)三號(hào)金銀花”干燥藤[鮮品直接置于鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱(45℃)干燥](過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱(chēng)量，超聲處理[功率250 W，頻率40 kHz，超聲溫度(40±1)℃]30 min，放冷，再稱(chēng)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm的有機(jī)相過(guò)濾頭過(guò)濾，取續(xù)濾液適量，作為供試品溶液。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱：Fortis Xi 苯基柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動(dòng)相：以乙腈為A相、0.5 %冰醋酸溶液為B相，進(jìn)行梯度洗脫(0→14 min，A：14%，流速：0.6 mL·min-1；14→15 min，A：14%，流速：0.6→0.9 mL·min-1；15→35 min，A：14%→35%，流速：0.9→0.4 mL·min-1；35→40 min，A：35%→14%，流速：0.4→0.6 mL·min-1；40→46 min，A：14%，流速：0.6mL·min-1)；蘆丁、木犀草苷檢測(cè)波長(zhǎng)為：354 nm；柱溫：(30±1) ℃；進(jìn)樣量：5～20μL。在上述色譜條件下，進(jìn)樣“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及“2.2”項(xiàng)下各供試品溶液，得色譜圖如圖1。結(jié)果：蘆丁、木犀草苷保留時(shí)間分別約為28.2、32.1 min；理論塔板數(shù)按蘆丁峰計(jì)均不低于60 000，按木犀草苷峰計(jì)均不低于80 000；各色譜圖中蘆丁和木犀草苷色譜峰的DAD匹配值均不低于999.20，說(shuō)明各樣品溶液中的蘆丁和木犀草苷色譜峰均與相鄰的色譜峰達(dá)到了基線(xiàn)分離。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制分別進(jìn)樣“2.1”項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.208、0.416、0.832、1.248、1.664、2.08 μg和木犀草苷的對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.124、0.248、0.496、0.744、0.992、1.24 μg，記錄各自峰面積。以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得蘆丁和木犀草苷的回歸方程分別為Y蘆丁=76.96X-0.273 4(r=0.999 4)、Y木犀草苷=103.89X+0.775 3(r=0.999 6)，進(jìn)樣量的線(xiàn)性范圍分別為0.208～2.08、0.124～1.24 μg。結(jié)果表明，蘆丁和木犀草苷在各自的線(xiàn)性范圍內(nèi)均呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)精密吸取“2.1”項(xiàng)下的蘆丁和木犀草苷混合對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各自的色譜峰面積，結(jié)果蘆丁和木犀草苷色譜峰面積的RSD分別為0.73%、0.70%(n=6)。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為20140518的“武當(dāng)三號(hào)金銀花”花蕾、葉、藤干燥粉末各6份，分別按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”項(xiàng)下的方法平行操作，制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果“武當(dāng)三號(hào)金銀花”花蕾、葉、藤中蘆丁峰面積的RSD分別為1.96%、1.88%、1.92%(n=6)，木犀草苷峰面積的RSD分別為1.86%、1.90%、1.88%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為20140518的“武當(dāng)三號(hào)金銀花”花蕾、葉、藤干燥粉末各1份，分別按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”項(xiàng)下的方法平行操作，制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果“武當(dāng)三號(hào)金銀花”花蕾、葉、藤中蘆丁峰面積的RSD分別為1.16%、1.28%、1.22%(n=7)，木犀草苷峰面積的RSD分別為1.26%、1.19%、1.23%(n=7)，表明上述各供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取批號(hào)為20140518的“武當(dāng)三號(hào)金銀花”葉干燥粉末(每1 g中含蘆丁和木犀草苷分別為3.46、5.86 mg)12份，每份約0.2 g，精密稱(chēng)定，均分兩組，一組分別精密加入蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液(104.0 mg·L-1)7.0 mL，另一組精密加入木犀草苷對(duì)照品對(duì)照品儲(chǔ)備液(124.0 mg·L-1)10.0 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備樣品，依據(jù)“2.3”項(xiàng)下色譜方法各自進(jìn)樣10 μL，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9樣品含量測(cè)定分別取批號(hào)為20140518、20140526和20140604的“武當(dāng)三號(hào)金銀花”干燥花蕾、葉和藤，分別按“2.2.1”、“2.2.2” “2.2.3”項(xiàng)下的方法，制備各自的供試品溶液，并按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定蘆丁和木犀草苷的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各自含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2　“武當(dāng)三號(hào)金銀花”不同部位中蘆丁和木犀草苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3討論

3.1提取條件的確定

3.1.1“武當(dāng)三號(hào)金銀花”花蕾提取條件的確定本試驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，固定超聲功率(250 W)、超聲頻率(40 kHz)、超聲溫度[(40±1)℃]及液料比(25 mL·g-1)，分別以60%乙醇、70%乙醇和80%乙醇為提取溶劑，對(duì)超聲30、45、60 min提取方法進(jìn)行了初步考察。結(jié)果超聲30 min和超聲45、60 min時(shí)蘆丁和木犀草苷的含量相差不大；以60%乙醇和70%乙醇提取蘆丁和木犀草苷時(shí)，二者含量均無(wú)顯著性差異(以60%乙醇提取時(shí)蘆丁的含量比木犀草苷的稍高，當(dāng)以70%乙醇提取時(shí)，則木犀草苷的含量稍高)，但均高于用80%乙醇提取時(shí)的含量。故武當(dāng)三號(hào)金銀花提取蘆丁和木犀草苷的條件初步確定為：以70%乙醇為提取溶劑，超聲[功率：250 W、頻率：40 kHz、溫度：(40±1)℃]提取30 min。

3.1.2“武當(dāng)三號(hào)金銀花”葉提取條件的確定本試驗(yàn)分別對(duì)超聲提取[固定超聲頻率為40 kHz和超聲溫度為(40±1)℃，考察功率分別為100、250、500 W和超聲時(shí)間分別為30、45、60 min時(shí)的提取效果]、提取溶劑(分別為60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和50%甲醇)、和液料比(分別為50、100、150 mL·g-1)幾種單因素試驗(yàn)進(jìn)行了初步的考察。結(jié)果在固定超聲頻率(40 kHz)和超聲溫度[(40±1)℃]下，以超聲功率分別為250、500 W和提取時(shí)間分別為30、45、60 min時(shí)，蘆丁和木犀草苷提取率沒(méi)有顯著的差別，從節(jié)省時(shí)間、節(jié)約能源和提取后雜質(zhì)相對(duì)少等幾方面綜合考慮，將該試驗(yàn)超聲提取功率和時(shí)間分別定為250 W和30 min；在上述超聲條件下，當(dāng)以60%乙醇為提取溶劑，液料比為150 mL·g-1時(shí)，蘆丁和木犀草苷提取率相對(duì)較高。故“武當(dāng)三號(hào)金銀花”葉提取蘆丁和木犀草苷的條件初步確定為：以60%乙醇為提取溶劑，液料比為150 mL·g-1，超聲[功率：250 W、頻率：40 kHz、溫度：(40±1)℃]提取30 min。

3.1.3“武當(dāng)三號(hào)金銀花”藤提取條件的確定本試驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，分別對(duì)超聲提取(方法同“3.1.2”項(xiàng)下)、提取溶劑(70%乙醇和50%甲醇)和液料比(25、50 mL·g-1)幾種單因素試驗(yàn)進(jìn)行了初步的考察。結(jié)果以70%乙醇為提取溶劑，液料比為50 mL·g-1，超聲提取[超聲頻率、溫度、功率分別定為40 kHz、(40±1)℃、250 W和30 min]時(shí)，蘆丁和木犀草苷提取率相對(duì)高些。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定依照“2.3”項(xiàng)的色譜條件，進(jìn)樣“2.1”項(xiàng)下蘆丁和木犀草苷混合對(duì)照品溶液，由Ultimate3000二極管陣列檢測(cè)器對(duì)蘆丁和木犀草苷色譜峰的在線(xiàn)紫外掃描(波長(zhǎng)范圍：190～400 nm)圖譜得知：蘆丁和木犀草苷分別在約354、348 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，該試驗(yàn)可以把蘆丁和木犀草苷檢測(cè)波長(zhǎng)分別定為：354和348 nm。但從圖譜上分析，對(duì)于木犀草苷采用蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)(λ=354 nm)定量，或?qū)τ谔J丁采用木犀草苷的最大吸收波長(zhǎng)(λ=348 nm)定量均差別不大。為了簡(jiǎn)化該試驗(yàn)，又考慮到同一供試品進(jìn)樣時(shí)，蘆丁的峰面積比木犀草苷的低，因此該試驗(yàn)最終將蘆丁和木犀草苷的檢測(cè)波長(zhǎng)定為354 nm。

3.3色譜柱的選擇《中國(guó)藥典》2010年版一部對(duì)金銀花中木犀草苷的含量測(cè)定采用的色譜柱為苯基柱(Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6 mm×250 mm，5 μm)，本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-2,8]，分別采用苯基柱(Fortis Xi phenyl 4.6 mm×250 mm,5 μm)和C18柱(Fortis 4.6 mm×250 mm，5 μm)同時(shí)測(cè)定蘆丁和木犀草苷的含量，當(dāng)采用苯基柱時(shí)，二主峰的理論塔板數(shù)均不低于60 000，而采用C18柱時(shí)，二主峰的理論塔板數(shù)均低于20 000，并且二主峰與相鄰峰的分離度，前者均大于后者，故本試驗(yàn)最終采用苯基柱測(cè)定“武當(dāng)三號(hào)金銀花”不同部位中蘆丁和木犀草苷的含量。

3.4含量測(cè)定的結(jié)果由表2含量測(cè)定結(jié)果可知：“武當(dāng)三號(hào)金銀花”的花蕾、葉和藤中蘆丁和木犀草苷的含量高低均為：葉>花蕾>藤,其中葉中木犀草苷的含量幾乎為《中國(guó)藥典》2010年版一部規(guī)定的金銀花(含木犀草苷不得少于0.05%)的10倍以上。雖然藤中木犀草苷的含量相對(duì)于葉和花蕾而言最低，但其含量卻高于藥典中金銀花中木犀草苷的標(biāo)準(zhǔn)近3倍?！吨袊?guó)藥典》2010年版一部規(guī)定：金銀花的質(zhì)控指標(biāo)為綠原酸和木犀草苷(不得少于0.05%)，無(wú)蘆丁作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；規(guī)定忍冬藤的質(zhì)控指標(biāo)為綠原酸和馬錢(qián)苷，無(wú)蘆丁和木犀草苷作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于忍冬葉，藥典中無(wú)任何質(zhì)控指標(biāo)。忍冬藤和葉是生產(chǎn)金銀花的副產(chǎn)品，一年四季均可采收，資源豐富，若加以合理開(kāi)發(fā)利用，可以大大緩解市場(chǎng)上金銀花藥材的緊缺。“武當(dāng)三號(hào)金銀花”不同部位的黃酮類(lèi)的含量與同一地區(qū)其他品種的金銀花的對(duì)應(yīng)部位相比均較高(筆者已經(jīng)對(duì)武當(dāng)?shù)貐^(qū)其他品種的金銀花做過(guò)初步的對(duì)比研究)，并且，黃酮具有較強(qiáng)抗氧化能力，因此筆者推測(cè)其藥性也應(yīng)與其他品種有所不同，入藥時(shí)應(yīng)視病情進(jìn)行定量。

4結(jié)論

本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法—二極管陣列檢測(cè)器對(duì)“武當(dāng)三號(hào)金銀花” 不同部位(花蕾、葉、藤)中黃酮類(lèi)物質(zhì)——蘆丁和木犀草苷的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果，該方法操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠，以期為“武當(dāng)三號(hào)金銀花”的花蕾、葉和藤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.015

基金項(xiàng)目：湖北省2011協(xié)同創(chuàng)新中心基金(鄂教科函(2012)56號(hào))

作者簡(jiǎn)介：鄭芳，女，主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，E-mail：zhengfangdf@163.com

通信作者：朱雪松，男，主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)與臨床藥學(xué)，E-mail：dfpharmacy@163.com

(收稿日期：2015-02-13,修回日期：2015-07-20)

Determination of the contents of rutin and luteoloside in different parts
of “Wudang Ⅲ Flos lonicerae” by HPLC-DAD

ZHENG Fang,ZHU Xue-song,LI Peng,et al

(DepartmentofPharmacy,DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiMedicalUniversity,HubeiKeyLaboratoryof

WudangLocalChineseMedicineResearch,Shiyan,Hubei442008,China)

Abstract:ObjectiveTo determine the contents of rutin and luteoloside in different parts of “Wudang Ⅲ Flos lonicerae”by HPLC-DAD.MethodsFortis Xi Phenyl column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was used.The mobile phase was acetonitrile(A)-0.5% glacial acetic acid aqueous solution(B)with gradient elution.The detective wavelength was 354 nm.The column temperature was 30℃.ResultsThe rutin and luteoloside showed good linearity(r≥0.999 4)in a detection range and the average recovery rates were 99.4%,99.3%，respectively.ConclusionThe method is simple，sensitive and reproducible，which can be used to control the quality of rutin and luteoloside in different parts of “Wudang Ⅲ Flos lonicerae”.

Key words：HPLC;rutin;luteoloside;gradient elution