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    金納多注射液對脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織中核因子-κB表達的影響

    2015-02-01 03:43:45劉子宸李永剛劉少斌張獻彩
    安徽醫(yī)藥 2015年12期
    關(guān)鍵詞:核因子急性肺損傷腫瘤壞死因子

    劉子宸,吳 棣,王 剛,李永剛,劉少斌,張獻彩

    (1.邢臺醫(yī)學高等??茖W校解剖教研室;2.邢臺市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,河北 邢臺 054000)

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    金納多注射液對脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織中核因子-κB表達的影響

    劉子宸1,吳棣2,王剛1,李永剛1,劉少斌1,張獻彩1

    (1.邢臺醫(yī)學高等??茖W校解剖教研室;2.邢臺市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科,河北 邢臺054000)

    摘要:目的探討金納多注射液對脂多糖致急性肺損傷(ALI)大鼠肺組織中核因子-κB(NF-κB)表達的影響。方法 采用隨機法將24只Wistar大鼠分為3組:對照組(Control)、脂多糖組(LPS)和金納多處理組(GBE)。采用尾靜脈注射脂多糖(LPS)的方法建立急性肺損傷模型,光學顯微鏡下觀察每組大鼠的肺組織病理學改變;檢測血清中腫瘤壞死因子-αB(TNF-αB)和肺組織中核因子-κB(NF-κB)的表達變化。結(jié)果與對照組相比,脂多糖組大鼠血清中TNF-αB含量升高(P<0.05),肺組織中NF-κB表達增加(P<0.05);與脂多糖組相比,金納多處理組大鼠血清中TNF-αB含量減少(P<0.05),肺組織中NF-κB表達減少(P<0.05)。結(jié)論 金納多注射液可有效減輕ALI時肺組織的炎癥反應,其機制可能與其降低大鼠體內(nèi)TNF-α含量、減少NF-κB表達有關(guān)。

    關(guān)鍵詞:急性肺損傷;金納多;脂多糖;腫瘤壞死因子-α;核因子-κB

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素所導致的肺泡上皮細胞及肺毛細血管內(nèi)皮細胞屏障功能喪失,從而導致的缺氧性呼吸衰竭,是機體炎癥反應失控導致的自身破壞性反應的結(jié)果。ALI時,大量富含蛋白的滲出液流入到肺泡腔,嚴重影響肺的換氣功能,導致頑固性低氧血癥和進行性呼吸衰竭,可誘發(fā)肺炎、胰腺炎、敗血癥等多種嚴重并發(fā)癥,是臨床常見的危急重癥[1-5]。在眾多病因中,重癥感染為其原因之一,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分,是引起感染性疾病的主要因素。ALI發(fā)病機制十分復雜,迄今為止尚未闡明,目前仍無有效的特異性的治療方法[6-8]。研究發(fā)現(xiàn):眾多細胞因子和炎性介質(zhì)參與了ALI的發(fā)生發(fā)展過程。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)為ALI時的炎癥啟動因子,降低體內(nèi)TNF-α的含量可顯著緩解肺損傷;核因子-κB(NF-κB)的激活在ALI中起著關(guān)鍵作用,NF-κB受到脂多糖及炎性細胞因子刺激活化后可加重ALI時的肺部損傷,減少NF-κB的表達可有效抑制ALI時炎癥反應,減輕肺組織的損傷程度[9-11]。

    銀杏是銀杏科植物的一種,銀杏葉主要為銀杏干燥葉,其主要成分為萜內(nèi)酯類、黃酮類、少量生物堿及多酚類化學物質(zhì)。銀杏葉提取物(GBE,金納多)主要含有黃酮苷和銀杏內(nèi)酯等有效成分,具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、保護血管內(nèi)皮及改善微循環(huán)等作用,臨床上多用來保護心腦血管、改善心肌缺血、緩解心絞痛、降低血清甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的含量等。目前針對銀杏葉提取物的研究大多數(shù)為其防治缺血再灌注損傷性疾病,但關(guān)于其防治ALI的研究較少[12-16]。因此,本實驗采用尾靜脈注射脂多糖(LPS)的方法復制大鼠ALI模型,旨在觀察銀杏葉提取物對ALI的作用,探討其可能的對抗機制,為臨床抗ALI的藥物治療提供一定的實驗依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1實驗動物、所用試劑和儀器健康雄性SPF級Wistar大鼠24只,體質(zhì)量210~240 g,由河北省實驗動物中心提供,動物合格證編號:1308046。金納多注射液(德國威瑪舒培博士藥廠,規(guī)格:每支5 mL,含GBE 17.5 mg,其中銀杏黃酮苷4.2 mg);脂多糖(LPS,美國Sigma公司);TNF-α檢測試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);NF-κB抗體及免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);切片機(型號:RM2135,德國Leica公司);光學顯微鏡(日本Olympus公司);其他試劑為國產(chǎn)分析純。

    1.2 動物分組及ALI模型制備領(lǐng)取實驗大鼠后,鼠籠內(nèi)覆蓋潔凈墊料,給予充足的飼料和水,適應性飼養(yǎng)3 d。室內(nèi)環(huán)境:溫度24℃左右,相對濕度40%~60%。將24只大鼠隨機分為3組:對照組(Control)、脂多糖組(LPS)和金納多處理組(GBE)。對照組每只大鼠于尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液,注射劑量為0.1 mL·kg-1;脂多糖組每只大鼠于尾靜脈注射LPS,注射劑量為0.1 mL·kg-1(濃度為50 g·L-1);金納多處理組每只大鼠于尾靜脈注射LPS,注射劑量為0.1 mL·kg-1(濃度為50 g·L-1),并于注射LPS前30 min腹腔注射金納多,注射劑量為50 mg·kg-1。所有大鼠于注射相應溶液3 h后處死取材。

    1.3肺組織病理形態(tài)學觀察大鼠經(jīng)10%水合氯醛(使用劑量為3 mL·kg-1)麻醉后,迅速打開胸腔,取部分右肺下葉組織,常規(guī)甲醛固定、乙醇梯度脫水(70%、90%乙醇各60 min→95%乙醇Ⅰ過夜、95%乙醇Ⅱ 30 min→100%乙醇Ⅰ、 Ⅱ各60 min)、二甲苯透明(二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min)、石蠟包埋(石蠟Ⅰ 30 min、 石蠟Ⅱ 2.5 h)、切片(厚度5 μm),行普通HE染色,光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。

    1.4血清中TNF-α含量的檢測大鼠經(jīng)腹主動脈采血,離心(4℃,2 000 r·min-1)10 min后取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定血清中TNF-α(ng·L-1)的濃度變化。嚴格按照試劑盒說明書操作。

    1.5免疫組織化學染色技術(shù)觀察肺組織中NF-κB的表達變化常規(guī)石蠟包埋切片,脫蠟水化,經(jīng)0.01 mol·L-1PBS清洗→3 %甲醇—過氧化氫,室溫下孵育15 min→0.01 mol·L-1PBS清洗→0.1 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0),微波抗原修復,98℃ 15 min→冷卻至室溫后0.01 mol·L-1PBS清洗→正常山羊血清孵育,37℃ 30 min→滴加一抗(1 ∶100),37℃下1.5 h →0.01 mol·L-1PBS清洗→加入生物素標記的二抗及辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素→0.01 mol·L-1PBS清洗→DAB顯色→梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察,以細胞漿或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。為了排除非特異性染色,在陰性對照實驗中,用PBS代替一抗或者二抗后,未見陽性染色。每組隨機選取5張切片,每張切片隨機選取5個不重疊的視野,光學顯微鏡下進行觀察,應用圖像分析系統(tǒng)軟件進行平均吸光度(OD值)的測量,以平均OD值代表該張切片NF-κB的表達水平。

    2結(jié)果

    2.1肺組織形態(tài)學觀察Control組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整、清晰,肺泡隔壁薄光滑,均勻一致,肺泡腔內(nèi)無滲出液;LPS組肺間質(zhì)大量炎細胞浸潤,肺泡腔內(nèi)大量紅細胞;GBE組肺組織炎細胞浸潤及肺泡腔出血減少,肺損傷程度減輕,見圖1。

    Control組LPS組GBE組

    圖1各組大鼠肺組織病理形態(tài)學改變(HE×400)

    2.2血清中TNF-α含量檢測與Control組相比,LPS組肺組織中TNF-α含量顯著升高(P<0.05),與LPS組相比,GBE組TNF-α含量明顯降低(P<0.05),但仍高于Control組(P<0.05),見表1。

    2.3肺組織中NF-κB免疫組織化學染色結(jié)果Control組肺組織NF-κB表達的棕黃色陽性信號較弱;LPS組NF-κB陽性信號明顯增強(P<0.05),胞核與胞漿均呈陽性表達;GBE組NF-κB陽性信號減弱,陽性表達的胞核顯著減少(P<0.05,見表1,圖2)。

    表1  TNF-α含量及NF-κB表達檢測結(jié)果

    注:與Control組相比*P<0.05;與LPS組相比#P<0.05。

    Control組 LPS組GBE組

    圖2各組大鼠肺組織NF-κB表達結(jié)果 (×400)

    3討論

    急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由感染、創(chuàng)傷、休克、酸中毒等原因引起的機體過度炎癥反應并導致彌漫性肺實質(zhì)損傷,其特征性病理改變是肺實質(zhì)炎癥反應所導致的彌漫性肺泡上皮和肺微血管內(nèi)皮的嚴重損傷。ALI嚴重階段稱為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),是臨床重癥監(jiān)護患者主要的死亡原因,病死率達到30%~50%。ALI時,肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷,導致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,肺順應性降低、通氣/血流比例失調(diào),臨床上表現(xiàn)為進行性低氧血癥和呼吸窘迫。ALI不僅是單純意義上的肺部疾病,而是一種全身系統(tǒng)性疾病的肺部表現(xiàn),是機體嚴重炎癥反復的結(jié)果,調(diào)控炎癥反應可以防止ALI的發(fā)生發(fā)展,降低死亡率。ALI的發(fā)病包括氧化損傷、中性粒細胞的活化、促炎細胞因子的大量釋放等多種機制,最終產(chǎn)生炎性“瀑布”樣反應,目前專家們對其發(fā)病機制尚未完全進行闡釋[17-22]。本實驗通過大鼠靜脈注射LPS建立ALI模型,20 min后大鼠精神萎靡,反應遲鈍,毛發(fā)聳立,呼吸急促,攝食飲水極少。病理學檢查發(fā)現(xiàn):注射LPS后大鼠肺泡壁大量炎細胞浸潤、肺泡腔出血,提示成功復制了ALI模型;應用金納多注射液后,以上病理改變有效緩解,說明金納多注射液可有效對抗ALI時肺組織的炎癥反應。

    研究發(fā)現(xiàn)TNF-α主要由被激活的巨噬細胞產(chǎn)生,是機體遭受感染或創(chuàng)傷后最早產(chǎn)生的促炎性細胞因子之一,是ALI發(fā)生和發(fā)展的始動因素。TNF-α能夠誘導IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子的分泌,促發(fā)炎癥反應,其水平可反應ARDS患者肺部損傷的嚴重程度。TNF-α對肺有強烈的毒性,能誘導肺內(nèi)皮細胞活化、白細胞遷移、中性粒細胞脫顆粒和毛細血管滲漏,肺泡內(nèi)積聚的水腫液進一步阻礙肺泡細胞的血流灌注和氧氣交換,加重低氧血癥。TNF-α能增加白細胞表面的黏附分子,使淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)增加,巨噬細胞抗原-1(MAC-1)增加;通過檢測ARDS病人和對照組的血清TNF-α含量發(fā)現(xiàn):ARDS患者TNF-α明顯升高,且與肺損傷程度密切相關(guān);通過減少TNF-α的水平,有利于減輕ALI時的炎癥反應[23-25]。本實驗顯示: LPS組較Control組大鼠血清中TNF-α含量增加(P<0.05),證實TNF-α及NF-κB參與了ALI進程;應用金納多處理后,血清中TNF-α含量降低(P<0.05),提示金納多可有效降低TNF-α含量,抑制炎癥反應。

    NF-κB是一類能與多種細胞因子及黏附分子基因啟動子部位的κB位點發(fā)生結(jié)合并增強基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì),是炎癥病理過程中多種炎性介質(zhì)表達調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在啟動、放大和延續(xù)炎癥反應過程中起中樞性調(diào)控作用。當細胞受到氧化、應激等因素的刺激后,NF-κB在細胞核內(nèi)與DNA特定序列結(jié)合,調(diào)節(jié)炎性細胞因子、細胞增殖等基因的轉(zhuǎn)錄,參與體液免疫、固有免疫、炎癥調(diào)節(jié)等,在ALI的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。未受刺激時,NF-κB處于未活化狀態(tài),其與抑制蛋白IκB結(jié)合在一起;當受到LPS等刺激時,IκB發(fā)生磷酸化和降解,NF-IκB與IκB解離,獲得自由的NF-IκB迅速從細胞質(zhì)移位到細胞核,與基因上κB位點發(fā)生特異性結(jié)合,從而促進有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn),NF-κB調(diào)節(jié)的靶基因蛋白包括細胞因子(IL-1、IL-2、IL-3、IL-6)、趨化因子(IL-8、巨噬細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性蛋白-1A)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)等。實驗表明:內(nèi)毒素導致,TNF-α等血清促炎細胞因子水平的升高,單核細胞或外周單核細胞及肺泡巨噬細胞NF-κB活性的增強。內(nèi)毒素進入機體后,可激活NF-κB核易位啟動TNF-α表達,釋放的TNF-α與LPS進一步激活效應細胞的NF-κB活化,進而啟動其他細胞因子和黏附分子的炎癥分子的表達,抑制NF-κB的激活可有效降低肺損傷的發(fā)生[26-30]。本實驗顯示: LPS組較Control組大鼠肺組織NF-κB表達增多(P<0.05),證實NF-κB參與了ALI進程;應用金納多處理后,肺組織NF-κB表達減少(P<0.05),提示金納多可有效抑制NF-κB表達,保護肺組織。

    綜上所述,金納多可能通過降低TNF-α的含量、抑制NF-κB的表達發(fā)揮對ALI時肺組織的保護作用。

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    基金項目:邢臺市科學技術(shù)研究發(fā)展計劃自籌經(jīng)費項目(No 2013ZC179)

    通信作者:張獻彩,女,副教授,研究方向:糖尿病消化系統(tǒng)癥狀的研究,E-mail:zhangxiancai2004@163.com

    doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.011

    (收稿日期:2015-07-29,修回日期:2015-09-07)

    Effect of Ginaton injection on the expression of NF-κB
    in rats with acute lung injury induced by LPS

    LIU Zi-Chen1, WU Di2,WANG Gang1,et al

    (1.XingtaiMedicalCollege;2.TheThirdHospitalofXingtai,Xingtai,Hebei054000,China)

    Abstract:Objective To explore the effect of Ginaton injection on the expression of NF-κB in rats with acute lung injury. Methods Twenty-four male Wistar rats were randomized into three groups:control group, LPS group and GBE group. Model of acute lung injury was established by tail-vein injection with LPS. Morphological changes of lung tissues were observed under light microscope. The content of TNF-α in serum and the expression of NF-κB in lung tissues were detected in each group. Results Compared with control group, the content of TNF-α in serum increased (P<0.05) and the expression of NF-κB in lung tissues increased (P<0.05) in LPS group; Compared with LPS group, the content of TNF-α in serum decreased (P<0.05) and the expression of NF-κB in lung tissues decreased (P<0.05) in GBE group. Conclusion Ginaton injection could reduce inflammation reaction in lung tissues during ALI, the mechanism of which was probably related to the decrease in the content of TNF-α and the expression of NF-κB.

    Key words:acute lung injury;ginaton;LPS;TNF-α;NF-κB

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