還腦益聰方對老年認知障礙大鼠學習記憶及腦組織β淀粉樣蛋白和Tau蛋白表達的影響

王曉寧 李 浩 劉劍剛 劉美霞 劉龍濤 胡 佳 魏 蕓 (北京中醫(yī)藥大學，北京 0009)

還腦益聰方對老年認知障礙大鼠學習記憶及腦組織β淀粉樣蛋白和Tau蛋白表達的影響

王曉寧1李 浩1劉劍剛1劉美霞1劉龍濤1胡 佳2魏 蕓2(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

目的 探討補腎益氣、活血解毒中藥-還腦益聰方顆粒劑對認知功能障礙的自然衰老大鼠學習記憶功能及腦組織β淀粉樣蛋白及Tau蛋白等表達的影響。方法 以Morris水迷宮試驗檢測SD老年大鼠的空間學習記憶能力，將學習記憶減退的50只老年大鼠結合體質(zhì)量，分層隨機方法分成為模型(老年認知障礙)對照組、陽性對照藥(鹽酸多奈哌齊片，0.49 mg/kg)組、還腦益聰顆粒劑小劑量(3.78 g生藥/kg)組、中劑量(7.56 g生藥/kg)組、大劑量(18.90 g生藥/kg)組，每組10只，學習記憶能力正常老年大鼠10只為老年正常對照組給予等量水，連續(xù)灌胃14 w。給藥結束后，行Morris水迷宮試驗，測試老年大鼠空間學習記憶能力，免疫組織化學方法觀察海馬組織CA1區(qū)早老蛋白-1(PS-1)、β淀粉樣肽和Tau蛋白激酶(TTBK1)的表達，積分光密度值(IOD)。結果 與正常組比較，模型組老年大鼠穿臺次數(shù)顯著減少(P＜0.05)，第四象限游泳路程顯著縮短(P＜0.01)。給藥14 w后，還腦益聰方各劑量組第四象限游泳路程顯著延長(P＜0.01)，還腦益聰方大劑量組第四象限游泳時間顯著延長(P＜0.05)。模型組老年大鼠海馬CA1區(qū)TTBK1陽性表達明顯增多，PS-1表達水平增強，β淀粉樣沉積增多。經(jīng)治療后，TTBK1、PS-1和β淀粉樣肽的陽性表達明顯減少，和模型組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。結論 還腦益聰方可抑制腦組織β淀粉樣蛋白和Tau蛋白的沉積，保護腦組織海馬形態(tài)的完整性，從而改善老年認知障礙大鼠空間學習記憶能力。

還腦益聰方;認知功能障礙;自然衰老大鼠;學習記憶;β淀粉樣蛋白;Tau蛋白;早老素蛋白-1

老年性癡呆亦稱阿爾茨海默病(AD)的特征性病理變化主要為腦皮質(zhì)彌漫性萎縮，神經(jīng)元數(shù)量大量減少，大腦皮層中可見細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(NFT)，細胞外老年斑(SP)等病變〔1〕。目前缺乏有效的防治方法。前期臨床研究表明，還腦益聰方具有改善老年輕度認知障礙患者自由基代謝紊亂、調(diào)節(jié)脂代謝、提高腦供血以及減輕炎性免疫反應等多種作用〔2〕。動物實驗亦證明，還腦益聰方具有提高老年認知障礙大鼠學習記憶能力、抑制β-淀粉樣蛋白(Aβ)相關結合蛋白的表達、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥水平等綜合作用，對海馬細胞的凋亡具有抑制作用〔3～5〕。本研究通過觀察還腦益聰方對老年認知障礙大鼠空間學習記憶能力及腦組織Aβ和Tau蛋白等表達的影響，探討其防治老年大鼠腦組織衰老的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 還腦益聰方顆粒劑由制首烏、人參、石菖蒲、黃連、川芎組成，將人參、黃連、川芎按照質(zhì)量比進行混合，并用乙醇提取，藥液合并減壓回收乙醇，濃縮至稠浸膏狀，最后和石菖蒲揮發(fā)油包含物合并，進行制劑。實驗用流浸膏生藥含量約3.2 g/kg，由北京中醫(yī)藥大學中藥學院制劑室制備。試驗前用蒸餾水配制成含不同生藥濃度的藥液。鹽酸多奈哌齊(商品名:安理申，5 mg/片)，由衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字:H20050978，批號:100609A。

1.2 試劑 腦源性Tau蛋白激酶(兔，TTBK1/BDTK)抗體，批號:909902W;早老素蛋白-1(兔，PS-1)抗體，批號:110267，Aβ(兔，1～42)抗體，批號:110185，北京博奧森生物技術有限公司提供;即用型抗兔二步法免疫組織化學(非生物素)檢測試劑盒，批號:K116616D，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒，批號:K116610D，北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.3 儀器 DMS-2型Morris水迷宮系統(tǒng)，中國醫(yī)學科學院藥物研究所生產(chǎn)。Dpx View Pro型顯微-彩色圖像處理系統(tǒng)，丹麥DeltaPix公司生產(chǎn)。

1.4 動物 選用清潔級SD老年大鼠60只，雌雄各半，18～20月齡，體重300～500 g;青年大鼠10只，雌雄各半，4月齡，體重200～220 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號:SCXK(京)2006-0009。清潔級實驗動物房喂養(yǎng)適應1 w后進行實驗，動物自由攝水，室溫控制在23℃ ～25℃，濕度控制在50% ～70%，光照12 h，黑暗12 h。

1.5 分組與給藥 根據(jù)Morris水迷宮實驗結果，以青年組大鼠平均逃避潛伏期95%正常值范圍為下限，99%正常值范圍為上限，將老年大鼠分為學習記憶減退組和學習記憶正常組，結合體重按照分層隨機(應用SPSS13.0軟件)的方法分為老年正常組、老年模型組、還腦益聰方小劑量組(3.78 g生藥/kg)、還腦益聰方中劑量組(7.56 g生藥/kg)、還腦益聰方大劑量組(18.90 g/kg生藥)和陽性對照組(鹽酸多奈哌齊片，0.49 mg/kg)。老年正常組、老年模型組予等體積蒸餾水灌胃，所試藥物稀釋同等倍數(shù)，灌胃量為1 ml/100 g，連續(xù)灌胃14 w。在灌胃過程中，由于實驗人員操作不當，致使4只老年大鼠嗆死。動物實驗過程中嚴格遵守動物倫理學要求。

1.6 檢測指標

1.6.1 動物行為學測試 連續(xù)用藥14 w后以Morris水迷宮試驗檢測行為學。Morris水迷宮直徑120 cm，水深30 cm，水面高出站臺表面約1 cm，水溫(25±1)℃。將水池以四個等距離點分為四個象限區(qū)，在第四象限池壁與圓心中間放置站臺。池中加入適量墨汁，混勻，使水呈不透明黑色，達到動物視覺不能辨別池內(nèi)站臺位置及有無站臺的目的。本試驗包括定位航行試驗和空間探索試驗，分別用于訓練大鼠在水迷宮中的學習記憶能力和對站臺空間位置的記憶能力。1次/d，連續(xù)訓練5 d。從池壁第二象限1/2弧度處選擇并標記一個入水點，將大鼠從第二象限標記處逐一放入水池中，放入時將大鼠面向池壁，自動錄像系統(tǒng)記錄大鼠從入水至找到平臺并爬上平臺所需的時間(以四肢爬上平臺為準)，即逃避潛伏期(PLL)。如大鼠在3 min內(nèi)未找到平臺，則由實驗者將其引導至平臺，潛伏期最長時間為180 s。待大鼠爬上平臺并在平臺上休息10 s后，再進行下一只大鼠的試驗。第5天下午撤除站臺，隨機選取一點，面向池壁將大鼠放入水池中，攝像系統(tǒng)自動記錄大鼠3 min內(nèi)進出原平臺區(qū)的次數(shù)及在原平臺所在第四象限游泳時間、路程等作為評價大鼠學習成績的指標。

1.6.2 免疫組化法檢測腦組織PS-1、Aβ和TTBK1的表達

隨機選取5只老年大鼠腦組織病理切片，利用非生物素二步法進行免疫組織化學的檢測。石蠟包埋常規(guī)處理，連續(xù)切片約5 μm厚，撈片于多聚賴氨酸防脫處理過的載玻片上。根據(jù)試劑盒說明書嚴格操作，一抗tau蛋白激酶抗體(稀釋比例1∶400)、PS-1 抗體(1∶400)、Aβ(1∶400)，37℃孵育 1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，2 min×3次;滴加二抗，兔抗山羊IgG抗體-辣根過氧化物酶(HRP)多聚體，室溫孵育30 min，PBS溶液沖洗，2 min×3次;DBA顯色，顯微鏡下觀察，鏡下控制反應時間，待組織著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液;蒸餾水充分沖洗，蘇木素輕度復染，乙醇脫水、透明、中性膠封片。

免疫組化染色結果圖像分析:觀察每組5只老年大鼠腦的病理切片，每張切片在海馬CA1區(qū)選取3個連續(xù)的不同視野，每組共15個視野。以Dpx View Pro型顯微-彩色圖像處理系統(tǒng)采集圖像和分析，采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件統(tǒng)計每組陽性表達的積分光密度值(IOD)，取平均值。1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD 檢驗。

2 結果

2.1 對老年大鼠空間學習記憶能力的影響 與老年正常組大鼠相比，老年模型組大鼠穿臺次數(shù)顯著減少(P＜0.05)，在第四象限游泳路程顯著縮短(P＜0.01)。與老年模型組大鼠比較，還腦益聰方小、中、大劑量組在第四象限游泳路程顯著延長(P＜0.01)，還腦益聰方大劑量組在第四象限游泳時間顯著延長(P＜0.05)。見表1。

表1 各組老年大鼠空間學習記憶能力(±s)

表1 各組老年大鼠空間學習記憶能力(±s)

與老年正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與老年模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;下表同

組別 n 穿臺次數(shù)(次)第四象限路程(cm)第四象限時間(s)58.28±8.54老年模型組 10 5.70±3.271) 356.57±64.422)4) 50.68±8.09陽性對照組 9 8.00±3.54 574.25±129.264) 58.23±14.67中藥小劑量組 10 5.90±2.56 542.72±167.064) 55.49±8.88中藥中劑量組 8 5.88±2.53 585.52±106.084) 55.88±7.26中藥大劑量組 9 6.33±1.94 592.72±119.644)60.25±7.263)老年正常組 10 8.40±3.723) 620.18±100.954)

2.2 對老年大鼠海馬CA1區(qū)PS-1、Aβ和TTBK1表達的影響

自然衰老大鼠海馬組織CA1區(qū)PS-1免疫反應陽性產(chǎn)物呈棕黃色細顆粒狀，Aβ免疫反應陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色細顆粒狀TTBK1免疫反應陽性產(chǎn)物呈棕褐色細顆粒狀，主要分布于神經(jīng)元胞質(zhì)和胞膜。與老年正常組大鼠相比，老年模型組海馬CA1區(qū)PS-1陽性表達IOD值顯著升高(P＜0.01);與老年模型組大鼠相比，還腦益聰方小、中、大劑量組海馬CA1區(qū)PS-1 Aβ、TTBK1陽性表達 IOD 值均顯著下降(P＜0.01)。見表 2，圖1～圖3。

圖1 各組老年大鼠海馬CA1區(qū)PS-1表達(×600)

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Aβ表達(×600)

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)TTBK1表達(×600)

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)PS-1、Aβ和TTBK1表達(±s，n=5，IOD 值)

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)PS-1、Aβ和TTBK1表達(±s，n=5，IOD 值)

TTBK1老年正常組 4 476.84±1 045.564) 4 322.54±900.294) 4 506.62±925.494)組別 PS-1 Aβ老年模型組 7 344.64±1 336.612) 7 855.90±1 019.452) 7 860.92±1 216.972)陽性對照組 5 237.14±1 075.024) 5 414.43±950.002)4) 5 241.64±762.681)4)中藥小劑量組 6 228.52±1 420.682)4) 6 103.87±1 240.992)4) 6 194.99±1 210.732)4)中藥中劑量組 5 927.08±843.712)4) 5 933.00±766.922)4) 5 734.91±758.382)4)中藥大劑量組 4 884.38±890.824) 4 992.04±771.374) 4 862.89±836.874)

3 討論

研究表明，膽堿能神經(jīng)元丟失、NFTs和SP的形成是AD的主要病理學特征〔6〕。NFTs主要由微管相關蛋白Tau蛋白過度磷酸化形成，SP的主要成分是Aβ，而Aβ主要由淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)γ-分泌酶和β-分泌酶(BACE)的催化裂解產(chǎn)生，Aβ即是APP的一部分片段〔7〕，γ-分泌酶是一種復雜的多亞基復合體，一般認為其主要由PS-1等4部分組成〔8〕，但也有學者認為PS-1本身就是γ-分泌酶〔9〕。學習記憶能力是大腦的一項重要功能，也是構成智能的重要因素。在大腦中，海馬是負責學習和記憶的結構，海馬分為齒狀回和海馬回兩部分，而海馬回又分為CA1、CA2、CA3、CA4四個部分，其中CA1區(qū)是學習記憶、信號傳遞及信息處理的重要部位〔10〕。近年來，多項相關文獻〔8～10〕指出，老年大鼠海馬CA1區(qū)PS-1和Aβ陽性反應較強，神經(jīng)細胞磷酸化tau蛋白陽性細胞明顯增多。

本實驗采用學習記憶能力減退的自然衰老大鼠作為認知障礙動物模型，雖然正常老化與AD有著本質(zhì)的區(qū)別，但衰老是導致AD的原因之一，是老年性癡呆的最大危險因素。選擇自然衰老的大鼠，更符合衰老因素在AD發(fā)病過程中的重要作用〔11〕。本研究結果說明老年模型組大鼠存在認知功能減退;還腦益聰方可顯著改善認知障礙大鼠受損的學習記憶能力。免疫組織化學結果表明，還腦益聰方可以通過減少該模型大鼠腦組織PS-1、Aβ和TTBK1的表達，減少衰老相關蛋白對腦組織的損害，進而保護老年大鼠的學習記憶功能。

中醫(yī)學認為，癡呆的病理性質(zhì)以本虛標實、虛實夾雜為主。腎虛精虧為本，痰瘀互阻為標;腎虛精虧、腦失充養(yǎng)，故出現(xiàn)記憶、精神、智能等方面障礙;痰瘀阻竅，形成智能障礙及癡呆的基本病理表現(xiàn)〔12〕。還腦益聰方基于“虛-瘀-濁-毒”為 AD的基本病機理論，全方由制首烏、人參、石菖蒲、黃連、川芎組成。其中制首烏能養(yǎng)血益肝，固精益腎，為君藥，首烏中的有效成分二苯乙烯苷具有抗癡呆的藥理作用;人參可補脾益肺，安神益智，其有效成分人參皂苷具有保護神經(jīng)元、提高腦組織攝氧能力以及對血氧的利用率，從而改善智力狀況的作用。石菖蒲有開竅醒神，辟穢化濁，益心安神之功效，石菖蒲揮發(fā)油可明顯改善癡呆大鼠學習記憶能力。黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，黃連中的有效成分黃酮類化合物具有抗氧化作用，生物堿類化合物還可抑制乙酰膽堿酯酶的活性，以及通過作用于某些炎性細胞和炎性介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用。川芎能活血行氣，川芎提取物川芎嗪可明顯提高癡呆模型的學習記憶能力，還可改善中樞海馬膽堿能系統(tǒng)功能。以上諸藥配伍，標本兼治，共奏補腎益氣、活血通絡、化痰祛濁、清熱解毒之效。

1 劉劍剛，李 浩，姚明江，等.還腦益聰方對老齡大鼠學習記憶及腦組織β類淀粉樣蛋白P物質(zhì)水平的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2010;16(2):52-5.

2 李 浩，姚明江，趙文明，等.還腦益聰膠囊治療老年輕度認知損害的雙盲隨機對照研究〔J〕.中西醫(yī)結合學報，2008;6(1):25-31.

3 李 浩，劉劍剛，姚明江，等.還腦益聰方對老齡認知障礙大鼠脂質(zhì)代謝和海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Aβ相關結合蛋白表達的影響〔J〕.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2009;15(5):354-7.

4 姚明江，劉劍剛，李 浩，等.還腦益聰方對早期認知功能障礙大鼠血漿P-選擇素、血漿纖溶酶原激活物抑制劑和血液流變學指標的影響〔J〕.中國微循環(huán)，2009;13(4):254-8.

5 李 浩，姚明江，徐 立，等.還腦益聰方對認知功能障礙大鼠認知功能及海馬Bcl-2，Bax蛋白表達的影響〔J〕.中國中藥雜志，2009;34(20):2622-5.

6 Chui HC，Zarow C，Mack WJ，et al.Cognitive impact of subcortical vascular and Alzheimer′s disease pathology〔J〕.Ann Neurol，2006;60(6):677-87.

7 Zhang YW，Xu H.Molecular and cellular mechanisms for Alzheimer′s disease:understanding APP metabolism〔J〕.Curr Mol Med，2007;7(7):687-96.

8 鄢 浩，姜鳳超.γ-分泌酶抑制劑研究進展〔J〕.化學進展，2006;18(3):355-62.

9 Kimberly W，Wolfe M.Identity and function of gamma-secretase〔J〕.Neurosci Res，2003;74(3):353-60.

10 White AM，Mattews DB，Best PJ.Ethanol，memory，and hippocampal function:a review of recent findings〔J〕.Hippocampus，2002;10(1):88-93.

11 Rosenzweig ES，Barnes CA.Impact of aging on hippocampal function:Plasticity，network dynamics，and cognition〔J〕.Prog Neurobiol，2003;69(3):143-79.

12 粟明蘭.老年癡呆辨證內(nèi)外并治〔J〕.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2009;11(9):81-2.

Effects of Huannao Yicong decoction on learning and memory，and the expressions of β-amyloid protein and TTBK1 in aging rats with cognitive impairment

WANG Xiao-Ning，LI Hao，LIU Jian-Gang，et al.
Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

ObjectiveTo observe the effects of Huannao Yicong decoction(HYD)on learning and memory function，the expressions of β-amyloid(Aβ)protein and TTBK1 in aging rats with cognitive impairment.MethodsMorris water maze test was used to measure the spatial learning and memory of SD aging rats.50 aging rats with learning and memory impairment combining with weight were divided randomly into model(aged rats with cognitive impairment)，positive control(Hydrochloric donepezil Tablets，0.49 mg/kg)，HYD granules small-dose(3.78 g crude drug/kg)，middle-dose(7.56 g crude drug/kg)，big-dose groups(15.12 g crude drug/kg)，10 in each group.The learning and memory capacity was tested by Morris water maze.The expressions of PS-1，Aβ protein and TTBK1 in hippocampus organization CA1 region were detected by immunohistochemical method.ResultsComparing with those of normal aged rats group，the number of model group aged rats passing the platform and the swimming distance in the fourth quadrant were significantly decreased(P＜0.01).After 14 weeks treatment，the swimming distance in the fourth quadrant of each HYD group were significantly increased(P＜0.01)，the swimming time in the fourth quadrant of big-dose group was significantly increased(P＜0.05).The expressions of PS-1，TTBK1 and β-amyloid protein were significantly increased in hippocampus CA1 area of the model groups.After treatment，the expressions of PS-1，TTBK1 and β-amyloid proteins were significantly decreased(P＜0.05，P＜0.01).ConclusionsHYD could reduce the deposition of Aβ protein and TTBK1 in brain tissue，protect the integrity of histomorphology in the hippocampus，and thus improve the spatial learning and memory capacity of aged rats with cognitive impairment.

Huannao Yicong Decoction;Cognitive impairment;Natural aging rats;Spatial learning and memory;β-amyloid protein;Tau tubulin kinase;Presenilin-1

R-332;R259

A

1005-9202(2015)09-2336-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.013

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題(2009ZX09103-391)

1 中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院

2 北京化工大學化工資源有效利用國家重點實驗室

劉劍剛(1963-)，男，副研究員，主要從事心血管中藥藥理、生物流變學的臨床和基礎研究。

王曉寧(1968-)，女，博士，主要從事中西醫(yī)結合治療心腦血管疾病研究。

〔2014-07-04修回〕

(編輯 袁左鳴)